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Resumo

O presente protocolo descreve um procedimento de cultura otimizado de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) para o enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.

Resumo

CRISPR/Cas9 é uma ferramenta de edição de genes altamente versátil e eficiente adotada amplamente para corrigir várias mutações genéticas. A viabilidade da manipulação gênica de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) in vitro torna os HSPCs uma célula-alvo ideal para a terapia gênica. No entanto, os HSPCs perdem moderadamente seu potencial de enxerto e repovoamento de multilinhagem em cultura ex vivo. No presente estudo, são descritas condições ideais de cultura que melhoram o enxerto de HSPC e geram um aumento do número de células geneticamente modificadas in vivo. O relatório atual exibe condições de cultura in vitro otimizadas, incluindo o tipo de meio de cultura, suplementação exclusiva de coquetéis de pequenas moléculas, concentração de citocinas, placas de cultura celular e densidade de cultura. Além disso, um procedimento otimizado de edição de genes do HSPC, juntamente com a validação dos eventos de edição de genes, são fornecidos. Para validação in vivo , a infusão de HSPCs editados por genes e a análise pós-enxerto em receptores de camundongos são exibidas. Os resultados demonstraram que o sistema de cultura aumentou a frequência de HSCs funcionais in vitro, resultando em enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.

Introdução

A inacessibilidade a doadores pareados com antígeno leucocitário humano (HLA) em ambientes de transplante alogênico e o rápido desenvolvimento de ferramentas de engenharia genética altamente versáteis e seguras tornam o transplante autólogo de células-tronco hematopoéticas (TCTH) uma estratégia de tratamento curativo para os hemodistúrbios hereditários 1,2. A terapia gênica autóloga com células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) envolve a coleta de HSPCs dos pacientes, manipulação genética, correção de mutações causadoras de doenças e transplante de HSPCs corrigidos por genes no paciente 3,4. No entanto, o resultado bem-sucedido da terapia gênica depende da qualidade do enxerto modificado por genes transplantáveis. As etapas de manipulação gênica e a cultura ex vivo de HSPCs afetam a qualidade do enxerto, diminuindo a frequência de células-tronco hematopoiéticas de longo prazo (LT-HSCs), necessitando da infusão de grandes doses de HSPCs manipulados por genes 2,5,6.

Várias moléculas pequenas, incluindo SR1 e UM171, estão sendo empregadas atualmente para expandir robustamente os HSPCs do sangue do cordão umbilical 7,8. Para HSPCs adultos, devido ao maior rendimento celular obtido na mobilização, não é necessária expansão robusta. No entanto, a retenção da haste de HSPCs isolados em cultura ex vivo é crucial para suas aplicações de terapia gênica. Portanto, uma abordagem com foco no enriquecimento cultural de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) é desenvolvida utilizando uma combinação de pequenas moléculas: Resveratrol, UM729 e SR1 (RUS)7. As condições de cultura otimizadas do HSPC promovem o enriquecimento das HSCs, resultando no aumento da frequência de HSCs modificadas por genes in vivo, e reduzem a necessidade de manipulação gênica de grandes doses de HSPCs, facilitando abordagens de terapia gênica custo-efetivas8.

Aqui, um protocolo abrangente para a cultura de HSPCs é descrito, juntamente com a infusão e análise de células editadas por genes in vivo.

Protocolo

Experimentos in vivo em camundongos imunodeficientes foram aprovados e realizados seguindo as diretrizes do Institute Animal Ethics Committee (IAEC), Christian Medical College, Vellore, Índia. Amostras de sangue periférico mobilizadas pelo fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) foram coletadas de doadores humanos saudáveis com consentimento informado após a aprovação do Conselho de Revisão Institucional (IRB).

1. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) e purificação de células CD34+

  1. Execute o isolamento PBMNC seguindo as etapas abaixo.
    NOTA: Para a cultura in vitro de HSPC e edição de genes, começar com pelo menos 1 x 106 HSPCs/grupo é ideal. Para a análise de enxerto in vivo , um número de células iniciais de pelo menos 5 x 10 6 HSPCs/grupo é ideal se um grupo contiver oito camundongos e cada camundongo for infundido com pelo menos6 x 105 células. Para obter um número suficiente de PBMNCs (~1 x 109) para o procedimento, recomenda-se começar com 20 mL de sangue periférico mobilizado (mPB).
    1. Após a coleta de mPB, diluir 20 mL de mPB com solução salina estéril 1x tamponada com fosfato (PBS) na proporção de 1:1.
      NOTA: A eficiência da mobilização do G-CSF pode variar entre os indivíduos9 e, portanto, o número de HSPCs obtidos a partir de 20 mL de sangue mobilizado varia entre os doadores.
    2. Adicionar 10 ml de meio gradiente de densidade (Lymphoprep, ver Tabela de Materiais) a um tubo de 50 ml e colocar o sangue diluído nas laterais do tubo numa proporção de 1:2.
      NOTA: Inclinar o tubo de 50 ml a um ângulo de 20° enquanto adiciona o sangue diluído impede que ele se misture com o Lymphoprep, levando a uma separação clara dos componentes sanguíneos após a centrifugação.
    3. Centrífuga a 600 x g durante 30 min à temperatura ambiente (RT) com uma taxa de aceleração de 1 m/s² e uma taxa de desaceleração de 1 m/s². Descarte a camada superior (plasma) usando uma pipeta sorológica e colha o revestimento bufante presente na interfase (PBMNCs) acima da camada média do gradiente de densidade.
      NOTA: Aspirar o casaco bufante usando uma pipeta sorológica, girando-o suavemente nas laterais do tubo. Evite coletar um volume maior de interfase enquanto aspira a pelagem bufante para evitar a contaminação por granulócitos e hemácias.
    4. Transfira os PBMNCs para um tubo cônico fresco de 50 mL e dilua a suspensão celular com 1x PBS na proporção de 1:2.
      NOTA: Diluir a suspensão celular com 1x PBS numa proporção de 1:4 se um excesso de interfase tiver sido recolhido durante a aspiração da pelagem bufante.
    5. Centrifugar a suspensão celular a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente com uma velocidade de aceleração de 9 m/s² e uma taxa de desaceleração de 7 m/s² e rejeitar o sobrenadante utilizando uma pipeta serológica. Adicionar 30 ml de tampão de lise de hemácias geladas (ver Tabela 7) ao pellet e incubar em gelo durante 10 minutos. Misture invertendo o tubo a cada 2 min.
    6. Centrifugar a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente com uma taxa de aceleração de 9 m/s² e uma taxa de desaceleração de 7 m/s² e eliminar o sobrenadante. Repita as etapas 1.1.5.-1.1.6. até que a vermelhidão da pelota desapareça. Ressuspeite o pellet com meio basal (IMDM, ver Tabela de Materiais) e realize uma contagem de células usando azul de tripano em uma câmara de Neubauer10.
      NOTA: Os PBMNCs isolados podem ser imediatamente usados para purificar HSPCs CD34 +. Alternativamente, os PBMNCs podem ser criopreservados e revividos sempre que necessário para o enriquecimento CD34+ . Para criopreservação, centrifugar 5 x 108 células a 200 x g durante 5 min e adicionar 4 ml de meio criogênico contendo IMDM: FBS: DMSO (ver Tabela de Materiais) na proporção de 7:2:1.
    7. Transfira os frascos para injetáveis para um criocooler de 1 °C e guarde-os a -80 °C até 12 h. Transfira e armazene os criovios em um recipiente de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
  2. Reviva os PBMNCs criopreservados.
    1. Descongelar pela metade os criovios em banho-maria a 37 °C por um redemoinho suave durante <1 min. Transfira a suspensão celular do criovial para um tubo de 50 mL contendo IMDM na proporção de 1:10.
    2. Centrifugar a suspensão celular a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente com uma taxa de aceleração de 9 m/s² e uma taxa de desaceleração de 7 m/s² e eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta serológica.
  3. Purifice as células CD34+ de PBMNCs seguindo as etapas abaixo.
    1. Preparar o tampão de purificação com PBS estéril 1x contendo 2% de soro fetal bovino filtrado (FBS). Ressuspenda o pellet de célula PBMNC no buffer de acordo com a Tabela 1.
      Observação : O buffer deve ser livre de Ca++ e Mg++ .
    2. Transfira a suspensão celular contendo 1 x 10 8-5 x 108 células de PBMNCs frescos ou criopreservados para o tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Adicionar DNase (ver Tabela de Materiais) a uma concentração final de 100 μg/ml à suspensão celular para evitar a aglomeração celular. Utilizamos um kit comercialmente disponível para purificação de CD34 contendo Coquetel de Seleção Positiva de CD34 Humano e Esferas Rápidas de Dextran (ver Tabela de Materiais).
    3. Adicionar Coquetel de Seleção Positiva de CD34 Humano comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) na concentração de 100 μL/mL de células e ressuspender suavemente.
    4. Incubar no RT durante 30 minutos e ressuspender suavemente a suspensão celular a cada 5 minutos. Adicione 50 μL/mL de Dextran Rapid Spheres comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais) e ressuspeite suavemente.
      NOTA: Vórtice as esferas de dextran em alta velocidade por 5 s para garantir que as partículas pareçam uniformemente dispersas e, em seguida, adicione-as às células.
    5. Incubar a RT durante 15 minutos e ressuspender suavemente a suspensão celular a cada 5 minutos. Fazer a suspensão celular para um volume total de 2,5 mL com tampão de purificação e ressuscitá-la suavemente.
    6. Coloque o tubo num íman imunomagnético sem coluna comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) e incube durante 5 minutos a RT. Após a incubação, inverta o ímã e descarte o sobrenadante em um movimento contínuo.
      NOTA: As células CD34+ marcadas com Dextran Rapid Spheres, permanecem atraídas para os lados do tubo pelo campo magnético. O tubo deve ser mantido na posição invertida por 2-3 s. Evite tremer ou apagar as gotas que permanecem penduradas na boca do tubo.
    7. Retire o tubo do ímã e adicione 2,5 mL de tampão de purificação. Repita as etapas 1.3.6-1.3.7 cinco vezes.
      NOTA: Durante a adição do tampão de purificação, posicione o tubo em um ângulo agudo e adicione o tampão girando o tubo, pois as células podem aderir às paredes da superfície enquanto invertem o ímã.
    8. Depois de completar cinco lavagens, remova o tubo do ímã, adicione 4 mL de PBS estéril 1x e ressuspenda a suspensão celular. Transfira a suspensão celular para o tubo de centrífuga de 15 mL e faça até 10 mL com 1x PBS. Realizar uma contagem de células usando azul de tripano em uma câmara de Neubauer10.
    9. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a RT (aceleração ~9 m/s², desaceleração ~7 m/s²) e eliminar o sobrenadante com uma pipeta. Para cultivar os HSPCs, ressuspenda as células nos meios de cultura do HSPC, conforme mencionado na etapa 2.1.
      NOTA: Os excessos de HSPCs purificados foram criopreservados em meio de criopreservação comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) a uma densidade de 9 x 106 células/mL após a cultura dos HSPCs por 12 h em meios de cultura HSPC.
  4. Reviver os HSPCs criopreservados.
    1. Descongele os crioviários durante <1 min num banho de água a 37 °C por um redemoinho suave. Transfira a suspensão celular no criovial para um tubo de 50 mL.
    2. Adicione 1% de BSA ressuspenso em 1x PBS gota a gota com agitação constante e faça até 20 mL. Centrifugar a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente com uma taxa de aceleração de 9 m/s² e uma taxa de desaceleração de 7 m/s² e eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta serológica.
    3. Repita a etapa 1.4.2. 1x. Ressuspender as células no meio de cultura e cultura do HSPC, conforme descrito na etapa 2.1.

2. Cultura in vitro de HSPCs purificados

  1. Prepare os meios de cultura usando SFEM-II com SCF (240 ng/mL), FLT3 (240 ng/mL), TPO (80 ng/mL), IL6 (40 ng/mL) e 1x antibiótico-antimicótico (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Meios de cultura recém-preparados são altamente recomendados. No entanto, o meio pode ser armazenado a 4 °C por até 24 h após a preparação.
  2. Ressuspender o pellet CD34+ com o meio de cultura, adicionar 3 μL de coquetel de USR/mL de meio (Resveratrol, 10 μM; UM729, 500 nM; StemReginin-1, 750 nM; ver Tabela de Materiais) e cultivar as células a 37 °C com 5% de CO2.
    NOTA: UM171 (10 nm) pode ser usado para substituir UM729 (500 nM), pois ambos têm efeitos semelhantes na manutenção da haste do HSPC7. Os frascos para injetáveis não podem ser descongelados mais de duas vezes.
  3. Inicialmente, semeie as células purificadas a uma confluência de 5 x 105/mL em placas de 6 poços tratadas com superfície delta comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais) para remover as células aderentes.
  4. Replantar as células na suspensão a uma confluência de 2 x 105 células/ml numa nova placa de 6 poços após 6 h de purificação.
  5. Caracterizar a haste dos HSPCs usando citometria de fluxo antes da edição gênica.
    1. Para análise de citometria de fluxo, pegue 1 x 105 células em 100 μL de 1x PBS e adicione 3 μL (75 ng) de CD34 PE, 4 μL (100 ng) de CD133 FITC e 4 μL (100 ng) de CD90 APC (ver Tabela de Materiais).
    2. Incubar o tubo no RT por 20 min no escuro. Lave as células com 2 mL de 1x PBS 2x e centrifugar a 200 x g por 5 min no RT. Descarte o sobrenadante com uma pipeta, ressuspenda o pellet celular com 150 μL de 1x PBS e adquira-o em citometria de fluxo.
      NOTA: Se a percentagem de células CD34+ for <90%, aumente o número de lavagens até seis vezes no passo 1.3.7. Semeia os HSPCs purificados em meio de cultura e, após 6 h, coletar apenas as células na suspensão. A maioria das células CD34- adere à placa de cultura.

3. Edição genética de HSPCs

  1. Realizar a reconstituição do RNA guia.
    NOTA: O sgRNA sintético com modificações de fosforotioato visando o locus CCR5 foi obtido de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).
    1. Para a reconstituição, ajustar a termomisturador a 37 °C e pré-aquecer o tampão 1x TE (ver Tabela de Materiais) a 37 °C durante 10 minutos. Centrifugar o frasco para injetáveis de sgRNA sintético quimicamente modificado a 11.000 x g durante 1 min a 4 °C.
    2. Ao frasco para injetáveis de sgRNA contendo 1,5 nM de sgRNA liofilizado, adicione 15 μL de 1x tampão TE, produzindo uma concentração final de 100 pM/μL. Ressuscite suavemente até 5x, girando a ponta ao redor dos cantos.
    3. Incubar na betoneira a 37 °C durante 30-40 s com agitação mínima. Após um giro curto, colete 15 μL de sgRNA e armazene como alíquotas de 1 μl (100 pM/μL) a -80 °C para uso futuro por até 1 ano.
      NOTA: Evite o congelamento-descongelamento repetido. Recomenda-se um máximo de um ciclo de congelamento-descongelamento de gRNA aliquotado.
  2. Realize a nucleofeção seguindo os passos abaixo.
    1. No dia 3 da cultura, conte as células usando a câmara de contagem celular melhorada de Neubauer10.
    2. Para a preparação de RNP (para nucleofecação de 2 x 10 5 células), tome 1 μL de sgRNA visando o gene CCR5 (100 pM) em um tubo de0,5 mL e adicione 2,65 μL de Cas9 (50 pM) girando suavemente em torno do fundo do frasco para injetáveis. Incubar no RT por 10 min.
      NOTA: sequência de gRNA: (CCR5) TGACATCAATTATTATACATCGG.
    3. Para a preparação do tampão, adicionar 16,4 μL de solução de célula primária P3 e 3,6 μL de suplemento, fornecidos com o kit de nucleofeção comercial (ver Tabela de Materiais), e incubar em RT por 10 min. Preparar o meio de cultura (passo 2.1.) e pré-incubá-lo a 37 °C na placa de cultura antes da nucleofecção.
    4. Pellet 2 x 10 5 células por centrifugação a 200 x g durante5 min a RT e descarte suavemente o sobrenadante utilizando uma pipeta sem perturbar o pellet. Ressuspender o pellet com 20 μL do tampão preparado na fase 3.2.3. e gentilmente ressuscitá-lo.
    5. Misturar suavemente a suspensão celular com o complexo RNP preparado (passo 3.2.2.) sem bolhas de ar. Transfira a suspensão para a tira de nucleofeção comercial (ver Tabela de Materiais) e selecione o código de pulso DZ100 para eletroporar as células usando o nucleofector 4D (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: O volume final da suspensão celular, incluindo o tampão e os componentes do RNP, não deve exceder mais de 27 μL/electroporação.
    6. Para o controle experimental, pellet 2 x 10 5 HSPCs não editados por centrifugação a 200 x g por5 min no RT, e ressuspender o pellet com 20 μL do buffer preparado na etapa 3.2.3. sem complexo RNP.
    7. Adicionar 100 μL de meios de cultura pré-incubados (passo 3.2.3.) às células electroporosas e deixar as células intactas durante 10 minutos na tira de nucleofeção no RT. Após 10 min de incubação, transferir o conteúdo para a placa de cultura de acordo com os requisitos experimentais.
      NOTA: Este protocolo pode ser aplicado à interrupção direcionada mediada pela junção final não homóloga (NHEJ) de qualquer locus genômico usando gRNA específico do alvo. O mesmo protocolo pode ser aplicado para a introdução de grandes deleções, incluindo gRNA duplo na etapa 3.2.2. 11. Além disso, após 10 min de incubação do RNP, o mesmo protocolo pode ser utilizado para edição gênica baseada em reparo direcionado por homologia (HDR) quando fornecido com um modelo de doador12. O protocolo foi validado pela interrupção direcionada da AAVS1, pseudo β-globina, β-globina e do locus CCR5 7,8.

4. Validação de eventos de edição de genes em HSPCs

  1. Realizar extração de DNA.
    1. Após 72 h após a nucleofecção, realizar uma contagem celular usando azul de tripano em uma câmara de Neubauer. Coletar 1 x 105 HSPCs editados por genes para extração de DNA.
    2. Centrifugar as células a 11.000 x g durante 5 min a RT e eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta. Ressuscite o pellet com 1 mL de 1x PBS e repita a centrifugação e descarte o sobrenadante. Ao pellet, adicionar 20 μL de solução de extrato rápido (ver Tabela de Materiais) para 1 x 105 células e ressuspender o pellet.
    3. Incubar a mistura num termociclador a 68 °C durante 30 minutos. Após uma rotação curta, incubar a mistura num termociclador a 98 °C durante 10 minutos. Medir a concentração de DNA no lisado bruto usando um espectrofotômetro13.
  2. Realizar a amplificação do locus editado por genes por PCR.
    1. Usando o Primer3 (ver Tabela de Materiais), projete os primers específicos do locus abrangendo o local de quebra de fita dupla (DSB) com tamanhos de amplificador variando entre 400-700 pb (Tabela 2).
      NOTA: Primer3 é uma ferramenta de código aberto baseada na Web para projetar primers de PCR.
    2. Preparar a mistura de reacção conforme previsto no quadro 3 e utilizar o termociclador com as condições de ciclagem mencionadas no quadro 4. Para confirmar a amplificação do locus desejado, misture 5 μL de produto de PCR com corante de carga de 6x e carregue na eletroforese em gel de agarose a 2% feita usando tampão TAE.
      NOTA: Os componentes de buffer TAE são fornecidos na Tabela 7.
    3. Execute por 30-40 min a 100 V e detecte o amplificador usando um sistema de imagem em gel (consulte Tabela de Materiais). De acordo com o protocolo do fabricante de purificação por PCR (consulte Tabela de Materiais), limpe o produto de PCR amplificado.
    4. Meça a concentração do produto de PCR purificado usando um espectrofotômetro de nanogotas (consulte Tabela de Materiais).
  3. Execute o sequenciamento de Sanger e a remoção livre do terminador de corante seguindo as etapas abaixo.
    1. Preparar a mistura de reacção como indicado no quadro 5. Execute o termociclador com as condições de ciclismo mencionadas na Tabela 6.
    2. Adicione 10 μL de reagente HighPrep DTR (ver Tabela de Materiais) e 40 μL de etanol a 85% a 10 μL de amostra de PCR em um tubo de 1,5 mL e misture-o por pipetagem vigorosa em torno de 8x-10x.
    3. Incubar a mistura em RT por 5 min e colocar o tubo de 1,5 mL no suporte de separação magnética por 5 min. Retire o sobrenadante usando uma pipeta e adicione 100 μL de etanol a 85%.
    4. Rejeitar o sobrenadante e repetir o passo 4.3.3. 1x. Retire os tubos de 1,5 mL do suporte magnético e incube-os a 37 °C por 10 min em um termomisturador para secar o etanol.
    5. Ressuspender vigorosamente as esferas com 40 μL de água isenta de nuclease e incubar em RT por 5 min. Coloque o tubo no suporte de separação magnética por 5 minutos e realize o sequenciamento de Sanger seguindo relatos publicados14,15.
  4. Realizar uma avaliação de frequência indel por análise ICE16.
    1. Use o Synthego (consulte Tabela de Materiais) para a análise ICE.
    2. Carregue arquivos ab1 de amostras editadas e não editadas e sequências de gRNA e clique em analisar para obter a frequência dos Indels.

5. Transplante de HSPCs editados por genes

  1. Pré-condicionar o NOD scid gamma mouse (NSG)17 e o NOD comercialmente disponíveis. Camundongos CG-KitW-41JTyr+PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/ThomJ (NBSGW)18 (ver Tabela de Materiais) para transplante de medula óssea.
    1. Para pré-condicionamento de camundongos NSG, escolha camundongos fêmeas de 6 a 8 semanas de idade e separe-os em grupos controle e editados por randomização cega.
    2. Coloque os camundongos NSG nas gaiolas de torta e irradie a 3,5 Gy usando um irradiador comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) 6-8 h antes do transplante de HSPC.
      NOTA: Recomenda-se pesar os ratos antes da irradiação, e os ratos pesando >20 g serão submetidos à irradiação.
    3. Para pré-condicionamento de camundongos NBSGW machos e fêmeas de 6-8 semanas de idade, injete bussulfano (ver Tabela de Materiais) através de injeção intraperitoneal (IP) na dose de 12,5 mg/kg de peso corporal 48 h antes do transplante de HSPC.
      NOTA: O condicionamento de bussulfano aumenta o enxerto de HSPCs humanos na medula óssea de camundongos e diminui a necessidade de infusão de grandes doses de HSPCs editados por genes19. A faixa ideal de dose de bussulfano para condicionamento é entre 10 mg/kg a 15 mg/kg de peso corporal. Doses aumentadas de bussulfano resultarão em graves problemas de mortalidade.
  2. Prepare a suspensão celular para transplante de medula óssea.
    1. Após 10 min de incubação dos HSPCs editados por genes na tira de nucleofeção (ver etapa 3.2.7.), transfira a suspensão celular para 10 mL de 1x PBS. Conte as células usando a câmara de contagem de células melhorada de Neubauer10.
    2. Para a perfusão de um rato, pellet 6 x 10 5 células num tubo de 1,5 ml por centrifugação a 200 x g durante5 min a RT e descarte suavemente o sobrenadante utilizando uma pipeta sem perturbar o pellet. Ressuscite o pellet celular com 100 μL de 1x PBS.
  3. Infundir os HSPCs por injeção na veia caudal seguindo os passos abaixo.
    1. Coloque o rato NSG ou NBSGW pré-condicionado na contenção do rato (consulte Tabela de Materiais).
    2. Segure a cauda do mouse e pressione suavemente o plugue para conter o mouse. Limpe suavemente a cauda do rato com etanol a 70%. Aspirar 100 μL da suspensão celular numa seringa de insulina 31 G.
      NOTA: Evite rigorosamente bolhas no produto para perfusão, batendo suavemente na seringa ou movendo suavemente o êmbolo.
    3. Direcione a luz da lâmpada infravermelha para a cauda por 30-40 s, cobrindo a área do corpo do mouse com dobras de papel de seda. Insira suavemente a parte chanfrada da agulha na veia caudal esquerda ou direita na veia caudal esquerda ou direita num ângulo de 20°.
    4. Levante a cauda com o dedo indicador esquerdo para mantê-la no eixo planar com a seringa. Empurre o êmbolo para infundir a suspensão celular na veia. Aplique uma pressão suave perto da região perfurada com papel de seda e retire a agulha.
    5. Após 30 s de aplicação de pressão suave, remova o rato da contenção e transfira-o para a gaiola.

6. Avaliação do potencial de enxerto a curto prazo

  1. Após 4 semanas de transplante de HSPC humano, avaliar o enxerto de curto prazo coletando sangue através do seio venoso orbitário em um tubo heparinizado usando uma pipeta de Pasteur.
    1. Anestesiar o animal com cetamina (90-120 mg/kg) e xilazina (8-12 mg/kg) formulação via injeção intraperitoneal (IP) antes da coleta da amostra.
      NOTA: Aplique suavemente pressão nos membros posteriores do rato anestesiado para confirmar a perda de sensibilidade.
    2. Após anestesiar, posicione o animal em decúbito ventral e esfregue suavemente o rato para abrir o olho, o que permite que o globo ocular se projete ligeiramente.
    3. Insira suavemente a pipeta Pasteur no canto medial do olho sob a membrana nictante em um ângulo de 30°-45°. Depois de colocar a pipeta Pasteur na posição correta, aplique uma leve pressão no tubo e comece a girar o tubo suavemente.
      NOTA: O sangue entrará no tubo por ação capilar assim que o plexo retroorbital for perfurado.
  2. Depois de coletar 50-80 μL de sangue periférico, retire suavemente a pipeta do canto medial do olho.
    1. Para cessar o sangramento ao redor da órbita do olho, feche as pálpebras e aplique uma pressão suave usando um pedaço de gaze.
  3. Coloração das células com os respectivos anticorpos (Tabela 8) e incubar as células no escuro por 25-30 min no RT.
  4. Para a lise de hemácias, à suspensão celular, adicionar 3 mL de 1x tampão de lise de hemácias (Tabela 7) e incubar por 10 min em gelo.
    1. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a RT e eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta. Repita a etapa 6.4. até que a vermelhidão do pellet desapareça.
    2. Adicionar 2 mL de 1x PBS e centrifugar a 200 x g por 5 min no RT para remover os detritos celulares associados à lise dos eritrócitos.
    3. Adicionar 150 μL de PBS 1x ao pellet e, em seguida, proceder à imunofenotipagem para citometria de fluxo para avaliar a porcentagem de células humanas enxertadas7.

7. Avaliação do potencial de enxerto a longo prazo

  1. Eutanasiar os ratos.
    1. Sacrificar os ratos transplantados na semana 16 para análise de enxerto, introduzindo asfixia 100% CO2 20 dentro da gaiola dos ratos por 1-2 min.
    2. Confirmar a eutanásia verificando a parada cardíaca e respiratória e a ausência de movimentos musculares com compressão suave dos membros posteriores. Se ambas as condições forem atendidas, remova os ratos da gaiola.
    3. Para avaliar o quimerismo celular humano, colete as células da medula óssea.
  2. Isole as células da medula óssea seguindo os passos abaixo.
    1. Após a eutanásia, faça uma incisão vertical 1 cm acima da uretra e estenda até 1 cm abaixo do diafragma. Corte horizontalmente nos cantos da área incisada para abrir amplamente a região abdominal.
    2. Dissecar o fêmur e a tíbia e remover os tecidos moles ligados ao fêmur e à tíbia usando uma tesoura. Esfregue suavemente com papel de seda e faça um pequeno orifício com um diâmetro não superior a 0,2 cm no fundo de um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL usando um bisturi.
    3. Remova as extremidades proximais dos ossos usando um bisturi e coloque os ossos com o lado cortado voltado para o orifício do tubo de microcentrifugação de 0,5 mL. Coloque o tubo de 0,5 mL com os ossos no tubo de 1,5 mL contendo 100 μL de PBS estéril 1x.
    4. Feche a tampa, gire os tubos por 3 min a 1000 x g em condições estéreis no RT e descarte os tubos de 0,5 mL contendo ossos com uma cavidade de medula vazia. Adicionar 1 ml de 1x PBS ao tubo de reação de 1,5 ml contendo medula óssea e ressuspender suavemente as células aproximadamente não inferior a 10x utilizando uma pipeta de 1 ml.
    5. Transfira 1 mL da suspensão celular para um tubo de 15 mL contendo 9 mL de tampão de lise de hemácias. Incubar as células no gelo por 7 min com inversão suave dos tubos a cada 2 min.
    6. Após 7 min, centrífuga a 200 x g por 5 min em RT com uma aceleração de 9 m/s² e uma desaceleração de 7 m/s². Repita a etapa 7.2.5. até que um pellet branco pálido claro seja observado.
    7. Ressuspeite as células com 10 mL de DPBS estéril 1x e filtre a suspensão celular da medula óssea usando um filtro celular de 40 μm em um tubo de 15 mL. Lave o filtro celular com 2 mL de 1x PBS 2x para evitar a perda de células.
    8. Centrifugar por 5 min a 200 x g, RT, e descartar o sobrenadante usando uma pipeta. Ressuspender as células com 10 mL de IMDM com DNase-I em uma concentração de trabalho de 100 μg/mL.
    9. Tome 1 x 106 células mononucleares em um tubo FACS para análise de enxerto por citometria de fluxo. Para avaliar a frequência de edição de genes em células mononucleares da medula óssea enxertadas, pellet 1 x 106 células mononucleares a 11.000 x g por 5 min no RT e descartar o sobrenadante usando uma pipeta.

8. Imunofenotipagem

  1. Incubar as células da medula óssea com 1,5 μL de uma proteína Fc humana recombinante purificada (ver Tabela de Materiais) durante 15 minutos a 4 °C antes de ser corada com anticorpos.
    NOTA: A proteína Fc humana usada aqui é formulada para bloquear a coloração de anticorpos não específicos causada por receptores para IgG; aumenta a especificidade da marcação de anticorpos 7,21,22. Antes da coloração de anticorpos das células-alvo, realize a titulação de anticorpos. É altamente recomendável incluir controles FMO e controles de isotipo ao trabalhar na análise fluxocitométrica multicolorida.
  2. Para determinar a porcentagem de enxerto de células humanas por citômetro de fluxo, tomar 1 x 106 células mononucleares em um tubo FACS e corar as células, conforme mencionado na Tabela 8.
  3. Incubar as células no escuro por 25-30 min em RT. Centrífuga a 200 x g por 5 min em RT e descartar o sobrenadante usando uma pipeta.
  4. Adquira as células por um citômetro de fluxo, paguem a população celular (P1) usando dispersões para frente (FSC) e laterais (SSC) de células mononucleares e ajuste a voltagem de acordo com a população celular. Adquira 50.000 eventos celulares na população P1.
  5. Para analisar as populações de leucócitos humanos na medula óssea de camundongos, retire as células CD45+ humanas e CD45.1 de camundongos da população de células P1 usando um software de análise de dados de citometria de fluxo (consulte Tabela de Materiais).
  6. Calcular o enxerto de células humanas utilizando a seguinte fórmula8:
    % de enxerto = (% hCD45) / (% hCD45 + % mCD45) × 100.
    NOTA: O limiar para enxerto humano foi considerado 0,1% positivo para CD45.
  7. Além disso, analise a porcentagem de células hCD34+ de células CD45+ humanas para avaliar as células de repovoamento a longo prazo. Para avaliar a reconstituição multilinhagem das células humanas enxertadas, corar 100 μL de suspensão celular seguindo a Tabela 9.
    NOTA: Os anticorpos precisam ser titulados antes dos experimentos.
  8. Usando o software de citometria de fluxo, pegue o hCD45 da população de células P1 e, a partir do hCD45, quantifique a porcentagem de hCD19, hCD3 e hCD13 (subconjuntos linfoide e mielóide).

9. Avaliação da frequência de edição de genes em células mononucleares da medula óssea enxertadas

  1. Ao pellet de células mononucleares da medula óssea, adicionar 50 μL de solução de extrato rápido (ver Tabela de Materiais) para 5 x 105 células e ressuspender o pellet.
  2. Incubar a mistura num termociclador a 68 °C durante 30 minutos. Após uma rotação curta, incubar a mistura num termociclador a 98 °C durante 10 minutos.
  3. Meça a concentração de DNA no lisado bruto usando um espectrofotômetro. Siga as etapas 4.2.-4.4. validar a frequência de edição de genes utilizando a análise ICE 8,15.

Resultados

O presente estudo identifica condições ideais de cultura HSPC que facilitam a retenção de HSCs CD34+CD133+CD90+ em cultura ex vivo. Para demonstrar o enriquecimento cultural de HSCs, juntamente com a geração aprimorada de HSCs modificadas por genes, são fornecidos os procedimentos otimizados para isolamento de PBMNC, purificação de células CD34+, cultura, edição de genes, transplante, caracterização de enxerto e células modificadas por genes in vivo<...

Discussão

O resultado bem-sucedido da terapia gênica com HSPC depende predominantemente da qualidade e quantidade de HSCs enxertáveis no enxerto. No entanto, as propriedades funcionais das HSCs são altamente afetadas durante a fase preparatória dos produtos de terapia gênica, inclusive pela cultura in vitro e toxicidade associada ao procedimento de manipulação gênica. Para superar essas limitações, identificamos condições ideais de cultura de HSPCs que retêm a caule de HSCs CD34+CD133+CD...

Divulgações

Os autores declaram que não existem interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores querem reconhecer a equipe da instalação de citometria de fluxo e da instalação animal da CSCR. A. C. é financiado por uma bolsa ICMR-SRAF, K. V. K. é financiado por uma bolsa DST-INSPIRE e P. B. é financiado por uma bolsa CSIR-JRF. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia (subvenção n.º BT/PR26901/MED/31/377/2017 e BT/PR31616/MED/31/408/2019)

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
4D-Nucleofector® X UnitLONZA BIOSCIENCEAAF-1003X
4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips)LONZA BIOSCIENCEV4XP-3032
Antibiotic-Antimycotic (100X)THERMO SCIENTIFIC15240096
Anti-human CD45 APCBD BIOSCIENCE 555485 
Anti-human CD13 PEBD BIOSCIENCE555394
Anti-human CD19 PerCPBD BIOSCIENCE340421
Anti-human CD3 PE-Cy7BD BIOSCIENCE557749
Anti-human CD90 APCBD BIOSCIENCE561971
Anti-human CD133/1 Miltenyibiotec130-113-673
Anti-human CD34 PEBD BIOSCIENCE348057
Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5BD BIOSCIENCE560580
Blood Irradator-2000 BRIT (Department of Biotechnology, India)BI 2000 
Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates)NUNC (THERMO SCIENTIFIC)140675
CrysoStor CS10BioLife solutions#07952
BusulfanCELON LABS (60mg/10mL)- 
Guide-it Recombinant Cas9TAKARA BIO632640
Cas9-eGFPSIGMAC120040 
 Centrifuge tube-15mlCORNING430790
 Centrifuge tube-50mlNUNC (THERMO SCIENTIFIC)339652
DMSOMPBIO219605590
DNAaseSTEMCELL TECHNOLOGIES6469
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1XHYCLONESH30028.02
EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit IISTEMCELL TECHNOLOGIES17856
EasySep magnetSTEMCELL TECHNOLOGIES18000
Electrophoresis unitORANGE INDIAHDS0036
FBSTHERMO SCIENTIFIC10270106
Flow cytometer – ARIA IIIBD BIOSCIENCE- 
FlowJo BD BIOSCIENCE -
Flt3-LPEPROTECH300-19-1000
Gel imaging systemCELL BIOSCIENCES11630453
HighPrep DTR reagentMAGBIOGENOMICSDT-70005
Human BD Fc BlockBD BIOSCIENCE553141
IL6PEPROTECH200-06-50
IMDM mediaTHERMO SCIENTIFIC12440053
Infrared lampMURPHY-
Insulin syringe 6mm 31GBD BIOSCIENCE324903
KetamineKETMIN 50-
Loading dye 6XTAKARA BIO9156
LymphoprepSTEMCELL TECHNOLOGIES7851
Mice RestrainerAVANTORTV-150
Nano drop spectrophotometerTHERMO SCIENTIFICND-2000C
Neubauer cell counting chamberROHEM INSTRUMENTSCC-3073
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)The Jackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:005557
NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW)The Jackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:026622
Nunc delta 6-well plateTHERMO SCIENTIFIC140675
Polystyrene round-bottom tubeBD352008
P3 primary cell Nucleofection solutionLONZA BIOSCIENCEPBP3-02250
Pasteur pipetteFISHER SCIENTIFIC13-678-20A
PCR clean-up kitTAKARA BIO740609.25
Mouse Pie CageFISCHER SCIENTIFIC50-195-5140
polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm)STEMCELL TECHNOLOGIES38007
Primer3Whitehead Institute for Biomedical Researchhttps://primer3.ut.ee/
QuickExtract™ DNA Extraction SolutionLucigenQE09050
ReserveratrolSTEMCELL TECHNOLOGIES72862
SCFPEPROTECH300-07-1000
SFEM-IISTEMCELL TECHNOLOGIES9655
sgRNASYNTHEGO- 
SPINWINTARSON1020
StemReginin 1STEMCELL TECHNOLOGIES72342
ICE analysis toolSYNTHEGOhttps://ice.synthego.com/
Tris-EDTA buffer solution (TE) 1XSYNTHEGOSupplied with gRNA 
ThermocyclerAPPLIED BIOSYSTEMS4375305
TPOPEPROTECH300-18-1000
Trypan blueHIMEDIA LABSTCL046
UM171STEMCELL TECHNOLOGIES72914
UM729STEMCELL TECHNOLOGIES72332
XylazineXYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED-

Referências

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