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요약

본 프로토콜은 생체 내에서 유전자 편집 세포의 강력한 생착을 위한 최적화된 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 배양 절차를 설명합니다.

초록

CRISPR/Cas9는 다양한 유전적 돌연변이를 교정하기 위해 널리 채택된 매우 다재다능하고 효율적인 유전자 편집 도구입니다. 시험관 내에서 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 유전자 조작의 타당성은 HSPC를 유전자 치료를위한 이상적인 표적 세포로 만듭니다. 그러나 HSPC는 생체 외 배양에서 생착 및 다중 계통 재 집단 잠재력을 적당히 잃습니다. 본 연구에서, HSPC 생착을 개선하고 생체내에서 증가된 수의 유전자-변형 세포를 생성하는 이상적인 배양 조건이 기술된다. 현재 보고서는 배양 배지 유형, 고유한 저분자 칵테일 보충제, 사이토카인 농도, 세포 배양 플레이트 및 배양 밀도를 포함하여 최적화된 체외 배양 조건을 표시합니다. 그 외에도 유전자 편집 이벤트의 검증과 함께 최적화된 HSPC 유전자 편집 절차가 제공됩니다. 생체내 검증을 위해, 마우스 수용자에서의 유전자 편집된 HSPC 주입 및 생착 후 분석이 표시된다. 결과는 배양 시스템이 시험관 내에서 기능성 HSC의 빈도를 증가시켜 생체 내에서 유전자 편집 세포의 강력한 생착을 초래한다는 것을 입증했습니다.

서문

동종 이식 환경에서 인간 백혈구 항원(HLA)과 일치하는 기증자에 접근할 수 없고 매우 다재다능하고 안전한 유전 공학 도구의 급속한 개발로 인해 자가 조혈모세포 이식(HSCT)은 유전성혈액 질환에 대한 치료 전략이 되었습니다1,2. 자가 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 유전자 치료는 환자의 HSPC 수집, 유전자 조작, 질병 유발 돌연변이의 교정 및 유전자 교정 된 HSPC를 환자에게 이식하는 것을 포함합니다 3,4. 그러나 유전자 치료의 성공적인 결과는 이식 가능한 유전자 변형 이식편의 품질에 달려 있습니다. HSPC의 유전자 조작 단계 및 생체 외 배양은 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)의 빈도를 감소시켜 이식편의 품질에 영향을 미치므로 유전자 조작 HSPC 2,5,6을 다량 주입해야합니다.

SR1 및 UM171을 포함한 여러 소분자가 현재 제대혈 HSPC를 강력하게 확장하기 위해 사용되고 있습니다 7,8. 성인 HSPC의 경우, 동원시 얻은 더 높은 세포 수율로 인해 강력한 확장이 필요하지 않습니다. 그러나 생체 외 배양에서 분리된 HSPC의 줄기를 유지하는 것은 유전자 치료 응용 분야에 매우 중요합니다. 따라서 조혈모세포(HSC)의 배양 농축에 초점을 맞춘 접근법은 레스베라트롤, UM729 및 SR1(RUS)7과 같은 소분자의 조합을 사용하여 개발됩니다. 최적화된 HSPC 배양 조건은 HSC의 농축을 촉진하여 생체 내에서 유전자 변형 HSC의 빈도를 증가시키고 다량의 HSPC를 조작하는 유전자의 필요성을 줄여 비용 효율적인 유전자치료 접근법을 용이하게 합니다8.

여기에서는 생체 내에서 유전자 편집 세포의 주입 및 분석과 함께 HSPC 배양을 위한 포괄적인 프로토콜이 설명됩니다.

프로토콜

면역결핍 마우스에 대한 생체내 실험은 인도 벨로르에 있는 크리스천 의과 대학의 동물 윤리 위원회(IAEC) 연구소의 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 동원 된 말초 혈액 샘플은 기관 검토위원회 (IRB) 승인을 얻은 후 정보에 입각 한 동의하에 건강한 인간 기증자로부터 수집되었습니다.

1. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMNC)의 분리 및 CD34 + 세포의 정제

  1. 아래 단계에 따라 PBMNC 격리를 수행하십시오.
    참고: 체외 HSPC 배양 및 유전자 편집의 경우 최소 1 x 106 HSPC/그룹으로 시작하는 것이 이상적입니다. 생체 내 생착 분석의 경우, 그룹에 8 마리의 마우스가 포함되고 각 마우스에 최소 6 x 10 5 개의 세포가 주입 된 경우 최소5 x 106 HSPC / 그룹의 시작 세포 수가 이상적입니다. 시술에 충분한 수의 PBMNC (~ 1 x 109)를 얻으려면 20mL의 동원 된 말초 혈액 (mPB)으로 시작하는 것이 좋습니다.
    1. mPB 수집 후 20mL의 mPB를 멸균 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 1:1 비율로 희석합니다.
      참고: G-CSF 동원의 효율은 개인마다 다를 수 있으며9, 따라서 20mL의 동원된 혈액에서 얻은 HSPC의 수는 기증자마다 다릅니다.
    2. 10mL의 밀도 구배 배지(림프포렙, 재료 표 참조)를 50mL 튜브에 추가하고 희석된 혈액을 튜브 측면을 통해 1:2 비율로 층화합니다.
      참고: 희석된 혈액을 추가하는 동안 50mL 튜브를 20° 각도로 기울이면 림프포렙과 혼합되는 것을 방지하여 원심분리 후 혈액 성분이 명확하게 분리됩니다.
    3. 실온(RT)에서 1m/s²의 가속 속도와 1m/s²의 감속율로 600 x g 에서 30분 동안 원심분리합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 상층(혈장)을 버리고 밀도 구배 배지층 위의 간기(PBMNC)에 존재하는 버피 코트를 수확합니다.
      알림: 혈청학적 피펫을 사용하여 버피 코트를 튜브 측면에서 부드럽게 소용돌이치게 하여 흡인합니다. 과립구 및 적혈구 오염을 방지하기 위해 버피 코트를 흡인하는 동안 더 많은 양의 간기를 수집하지 마십시오.
    4. PBMNC를 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 세포 현탁액을 1:2 비율로 1x PBS로 희석합니다.
      참고: 버피 코트를 흡인하는 동안 과량의 간기가 수집된 경우 1x PBS로 세포 현탁액을 1:4 비율로 희석합니다.
    5. 실온에서 9m/s²의 가속 속도 및 7m/s²의 감속률로 5분 동안 200 x g 의 세포 현탁액을 원심분리하고 혈청학적 피펫을 사용하여 상청액을 폐기합니다. 30mL의 얼음처럼 차가운 RBC 용해 완충액( 표 7 참조)을 펠릿에 넣고 10분 동안 얼음에서 배양합니다. 2분마다 튜브를 뒤집어 섞습니다.
    6. 실온에서 200 x g 에서 가속율 9m/s², 감속률 7m/s²로 5분간 원심분리하고 상층액을 폐기합니다. 1.1.5.-1.1.6단계를 반복합니다. 펠릿 발적이 사라질 때까지. 펠릿을 기저 배지(IMDM, 재료 표 참조)로 재현탁시키고, 노이바우어 챔버(10)에서 트리판 블루를 사용하여 세포 계수를 수행한다.
      참고: 분리된 PBMNC는 CD34+ HSPC를 정제하는 데 즉시 사용할 수 있습니다. 또는 PBMNC를 동결 보존하고 CD34+ 농축을 위해 필요할 때마다 부활시킬 수 있습니다. 냉동 보존을 위해 200 x g에서 5 x 108 셀을 5분 동안 원심분리하고 IMDM:FBS: DMSO(재료 표 참조)가 포함된 냉동 배지 4mL를 7:2:1의 비율로 추가합니다.
    7. 바이알을 1 °C 크라이오 쿨러로 옮기고 -80 °C에서 최대 12 시간 동안 보관하십시오. 냉동 비알을 액체 질소 용기에 옮겨 보관하여 장기간 보관합니다.
  2. 냉동 보존 된 PBMNC를 되살립니다.
    1. 냉동 비알을 37°C 수조에서 <1분 동안 부드럽게 소용돌이치며 반-해동시킨다. 극저온의 세포 현탁액을 IMDM이 포함된 50mL 튜브에 1:10의 비율로 옮깁니다.
    2. 실온에서 9m/s²의 가속 속도 및 7m/s²의 감속 속도로 200 x g 에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고 혈청학적 피펫을 사용하여 상청액을 폐기합니다.
  3. 아래 단계에 따라 PBMNC에서 CD34+ 세포를 정제하십시오.
    1. 정제 완충액을 2% 여과된 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 멸균 1x PBS로 준비한다. PBMNC 세포 펠렛을 표 1에 따른 완충액에 재현탁시킨다.
      참고: 버퍼는 Ca++ 및 Mg++가 없어야 합니다.
    2. 신선하거나 동결 보존된 PBMNC의 1 x 108-5 x 108 세포를 포함하는 세포 현탁액을 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다(재료 표 참조).
      참고: DNase( 재료 표 참조)를 최종 농도 100μg/mL로 세포 현탁액에 추가하여 세포 응집을 방지합니다. 우리는 인간 CD34 양성 선택 칵테일 및 덱스트란 급속 구체를 포함하는 CD34 정제를 위해 시판되는 키트를 사용했습니다( 재료 표 참조).
    3. 시중에서 판매되는 인간 CD34 양성 셀렉션 칵테일( 재료 표 참조)을 100μL/mL의 세포 농도로 첨가하고 부드럽게 재현탁합니다.
    4. RT에서 30분 동안 인큐베이션하고 5분마다 세포 현탁액을 부드럽게 재현탁합니다. 시중에서 판매되는 덱스트란 래피드 스피어 50 μL/mL( 재료 표 참조)를 넣고 부드럽게 재현탁합니다.
      알림: 덱스트란 구체를 5초 동안 고속으로 소용돌이하여 입자가 고르게 분산된 것처럼 보이도록 한 다음 셀에 추가합니다.
    5. RT에서 15분 동안 배양하고 5분마다 세포 현탁액을 부드럽게 재현탁합니다. 정제 완충액으로 세포 현탁액을 총 부피 2.5mL로 만들고 부드럽게 재현탁합니다.
    6. 튜브를 시중에서 판매되는 면역 자기 기둥이없는 자석 ( 재료 표 참조)에 넣고 RT에서 5 분 동안 배양합니다. 배양 후, 자석을 뒤집고 상청액을 한 번의 연속 동작으로 버립니다.
      참고: 덱스트란 래피드 스피어 태그가 부착된 CD34+ 세포는 자기장에 의해 튜브 측면에 끌리는 상태를 유지합니다. 튜브는 2-3 초 동안 거꾸로 된 위치에 있어야합니다. 튜브 입구에 매달려있는 방울을 떨거나 얼룩지게하지 마십시오.
    7. 자석에서 튜브를 제거하고 2.5mL의 정제 버퍼를 추가합니다. 1.3.6-1.3.7단계를 다섯 번 반복합니다.
      알림: 정제 버퍼를 추가하는 동안 튜브를 예각으로 배치하고 자석을 뒤집는 동안 셀이 표면벽에 부착될 수 있으므로 튜브를 소용돌이치게 하여 버퍼를 추가합니다.
    8. 5회 세척을 완료한 후 자석에서 튜브를 제거하고 4mL의 1x 멸균 PBS를 추가하고 세포 현탁액을 다시 부유시킵니다. 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮기고 1x PBS로 최대 10mL로 만듭니다. 노이바우어 챔버(10)에서 트리판 블루를 사용하여 세포 계수를 수행한다.
    9. RT(가속도 ~9m/s², 감속 ~7m/s²)에서 5분 동안 200 x g 로 원심분리하고 피펫으로 상층액을 버립니다. HSPC를 배양하려면 단계 2.1에 언급된 대로 HSPC 배양 배지에 세포를 재현탁합니다.
      참고: 정제된 HSPC의 과잉은 HSPC 배양 배지에서 12시간 동안 HSPC를 배양한 후 9 x 106 cells/mL의 밀도로 시판되는 동결보존 배지(재료 표 참조)에서 동결보존되었습니다.
  4. 냉동 보존 된 HSPC를 되살립니다.
    1. 상기 저온 비알을 37°C 수조에서 <1분 동안 부드럽게 소용돌이치며 해동시킨다. 극저온의 세포 현탁액을 50mL 튜브로 옮깁니다.
    2. 일정한 교반과 함께 1x PBS에 재현탁된 1% BSA를 한 방울씩 추가하고 최대 20mL로 만듭니다. 실온에서 9m/s²의 가속 속도 및 7m/s²의 감속률로 5분 동안 200 x g 에서 원심분리하고 혈청학적 피펫을 사용하여 상층액을 폐기합니다.
    3. 1.4.2단계를 반복합니다. 1배. HSPC 배양 배지에 세포를 재현탁시키고 단계 2.1에 설명된 대로 배양한다.

2. 정제된 HSPC의 체외 배양

  1. SCF (240 ng / mL), FLT3 (240 ng / mL), TPO (80 ng / mL), IL6 (40 ng / mL) 및 1x 항생제 항진균제와 함께 SFEM-II를 사용하여 배양 배지를 준비합니다 ( 재료 표 참조).
    참고: 갓 준비한 배양 배지를 적극 권장합니다. 그러나 배지는 준비 후 최대 24시간 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
  2. CD34+ 펠릿을 배양 배지와 함께 재현탁하고 3μL의 RUS 칵테일/mL의 배지(레스베라트롤, 10μM; UM729, 500 nM; 스템레지닌-1, 750 nM; 표 참조), 세포를 5%CO2로 37°C에서 배양하였다.
    참고: UM171(10nm)은 둘 다 HSPC 형태소 유지에 유사한 영향을 미치기 때문에 UM729(500nM)를 대체하는 데 사용할 수 있습니다7. 바이알은 두 번 이상 동결 해동할 수 없습니다.
  3. 처음에는 시판되는 델타 표면 처리된 6웰 플레이트(재료 표 참조)에서 5 x 105/mL의 컨플루언시에서 정제된 세포를 시드하여 부착성 세포를 제거합니다.
  4. 6시간의 정제 후 새로운 6웰 플레이트에서 2 x 105 cells/mL의 컨플루언시로 현탁액의 세포를 다시 시드합니다.
  5. 유전자 편집 전에 유세포 분석을 사용하여 HSPC의 줄기를 특성화합니다.
    1. 유세포 분석을 위해 100μL의 1x PBS에서 1 x 105 세포를 취하여 3 μL (75 ng)의 CD34 PE, 4 μL (100 ng)의 CD133 FITC 및 4 μL (100 ng)의 CD90 APC를 추가합니다 ( 재료 표 참조).
    2. 어둠 속에서 20 분 동안 RT에서 튜브를 배양하십시오. 세포를 2mL의 1x PBS 2x로 세척하고 RT에서 5분 동안 200x g 에서 원심분리합니다. 피펫으로 상청액을 버리고 150μL의 1x PBS로 세포 펠릿을 재현탁하고 유세포분석에서 획득합니다.
      참고: CD34+ 세포의 비율이 <90%이면 1.3.7단계에서 세척 횟수를 최대 6회까지 늘립니다. 정제된 HSPC를 배양 배지에 시드하고, 6시간 후에, 현탁액에 있는 세포만을 수집한다. 대부분의 CD34- 세포는 배양 용기에 부착된다.

3. HSPC의 유전자 편집

  1. 가이드 RNA 재구성을 수행합니다.
    참고: CCR5 유전자좌를 표적으로 하는 포스포로티오에이트 변형이 있는 합성 sgRNA는 상업적 공급원에서 얻었습니다( 재료 표 참조).
    1. 재구성을 위해 써모 믹서를 37 ° C로 설정하고 1x TE 버퍼 ( 재료 표 참조)를 37 ° C에서 10 분 동안 예열하십시오. 합성된 화학적으로 변형된 sgRNA 바이알을 11,000 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리한다.
    2. 1.5nM의 동결건조된 sgRNA를 포함하는 sgRNA 바이알에 15μL의 1x TE 완충액을 추가하여 최종 농도 100pM/μL를 산출합니다. 팁을 모서리 주위로 소용돌이치면서 최대 5배까지 부드럽게 재현탁합니다.
    3. 37 °C의 열 혼합기에서 최소 흔들림으로 30-40 초 동안 배양합니다. 짧은 스핀 후 15μL의 sgRNA를 수집하고 향후 사용을 위해 -80°C에서 1μl 분취량(100pM/μL)으로 최대 1년 동안 보관합니다.
      알림: 반복적인 동결 해동을 피하십시오. 분취된 gRNA의 최대 1회 동결-해동 주기가 권장됩니다.
  2. 아래 단계에 따라 핵 절제를 수행하십시오.
    1. 배양 3일째에, Neubauer의 개선된 세포 계수 챔버10을 사용하여 세포를 계수하였다.
    2. RNP 준비(2 x 105 세포 핵 절단용)의 경우 0.5mL 튜브에 CCR5 유전자(100pM)를 표적으로 하는 sgRNA 1μL를 취하고 바이알 바닥 주위를 부드럽게 소용돌이치며 Cas9 2.65μL(50pM)를 추가합니다. RT에서 10 분 동안 배양하십시오.
      참고: gRNA 서열: (CCR5) TGACATCAATTATTATACATCGG.
    3. 완충액 준비를 위해 16.4μL의 P3 1차 세포 용액과 3.6μL의 보충제를 상용 뉴클레오펙션 키트( 재료 표 참조)와 함께 제공하고 RT에서 10분 동안 배양합니다. 배양 배지를 준비하고(단계 2.1.) 핵형성 전에 배양 용기에서 37°C에서 사전 배양합니다.
    4. 펠렛 2 x 105 세포를 RT에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리하여 펠렛을 방해하지 않고 피펫을 사용하여 상청액을 부드럽게 버린다. 단계 3.2.3에서 준비한 완충액 20μL로 펠릿을 재현탁시킨다. 부드럽게 다시 일시 중지하십시오.
    5. 세포 현탁액을 기포 없이 준비된 RNP 복합체(단계 3.2.2)와 부드럽게 혼합합니다. 현탁액을 상용 뉴클레오펙션 스트립(재료 표 참조)으로 옮기고 펄스 코드 DZ100을 선택하여 4D 뉴클레오펙터(재료 표 참조)를 사용하여 세포를 전기천공합니다.
      참고: 완충액 및 RNP 성분을 포함한 세포 현탁액의 최종 부피는 27μL/전기천공을 초과해서는 안 됩니다.
    6. 실험 대조군을 위해, 2 x 10 5개의 편집되지 않은 HSPC를 RT에서5 분 동안 200 x g 에서 원심분리하여 펠릿하고, 단계 3.2.3에서 제조된 완충액 20μL로 펠릿을 재현탁시킨다. RNP 복합체없이.
    7. 100μL의 사전 배양 배지(단계 3.2.3)를 전기천공된 세포에 추가하고 RT의 뉴클레오펙션 스트립에서 10분 동안 세포를 방해받지 않은 상태로 둡니다. 배양 10분 후, 실험 요건에 따라 내용물을 배양 플레이트로 옮깁니다.
      참고: 이 프로토콜은 표적 특이적 gRNA를 사용하는 모든 게놈 유전자좌의 비상동 말단 접합(NHEJ) 매개 표적 파괴에 적용할 수 있습니다. 단계 3.2.2에서 이중 gRNA를 포함함으로써 큰 결실을 도입하기 위해 동일한 프로토콜을 적용할 수 있다. 11. 또한, RNP 인큐베이션 10분 후, 동일한 프로토콜이 공여자 주형(12)과 함께 제공될 때 상동성 지시 복구(HDR) 기반 유전자 편집에 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 AAVS1, 의사 β-글로빈, β-글로빈 및 CCR5 유전자좌 7,8의 표적 중단에 의해 검증되었습니다.

4. HSPC에서 유전자 편집 이벤트의 검증

  1. DNA 추출을 수행하십시오.
    1. 핵 형성 후 72시간 후, Neubauer 챔버에서 트리판 블루를 사용하여 세포 계수를 수행합니다. DNA 추출을 위해 1 x 105 유전자 편집 HSPC를 수집합니다.
    2. RT에서 5분 동안 11,000 x g에서 세포를 원심분리하고 피펫을 사용하여 상청액을 버립니다. 펠릿을 1 mL의 1x PBS로 재현탁하고 원심분리를 반복하고 상청액을 버립니다. 펠릿에 1 x 105 셀에 대해 20μL의 빠른 추출 용액(재료 표 참조)을 추가하고 펠릿을 재현탁합니다.
    3. 혼합물을 68°C의 열순환기에서 30분 동안 배양합니다. 짧은 스핀 후, 혼합물을 98°C의 열순환기에서 10분 동안 배양한다. 분광광도계13을 이용하여 조 용해물 중의 DNA의 농도를 측정하였다.
  2. PCR에 의한 유전자 편집 유전자좌의 증폭을 수행한다.
    1. Primer3( 재료 표 참조)를 사용하여 400-700bp 범위의 앰플리콘 크기로 이중 가닥 절단(DSB) 부위에 걸쳐 있는 궤적 특이적 프라이머를 설계합니다(표 2).
      참고: Primer3는 PCR 프라이머를 설계하기 위한 웹 기반 오픈 소스 도구입니다.
    2. 표 3 에 제공된 바와 같이 반응 혼합물을 제조하고, 표 4에 언급된 사이클링 조건으로 열순환기를 실행한다. 원하는 유전자좌의 증폭을 확인하려면 5μL의 PCR 산물과 6x 로딩 염료를 혼합하고 TAE 버퍼를 사용하여 만든 2% 아가로스 겔 전기영동 상에 로드합니다.
      참고: TAE 버퍼 구성 요소는 표 7에 나와 있습니다.
    3. 100V에서 30-40분 동안 작동하고 젤 이미징 시스템을 사용하여 앰플리콘을 검출합니다( 재료 표 참조). PCR 정제 제조업체 프로토콜( 재료 표 참조)에 따라 증폭된 PCR 산물을 정리합니다.
    4. 나노드롭 분광광도계를 사용하여 정제된 PCR 산물의 농도를 측정합니다( 재료 표 참조).
  3. 아래 단계에 따라 Sanger 시퀀싱 및 자유 염료 터미네이터 제거를 수행합니다.
    1. 표 5에 나타낸 바와 같이 반응 혼합물을 준비한다. 표 6에 언급된 사이클링 조건으로 열순환기를 실행하십시오.
    2. 1.5mL 튜브에 10μL의 PCR 샘플에 10μL의 HighPrep DTR 시약( 재료 표 참조)과 40μL의 85% 에탄올을 넣고 약 8x-10x 격렬한 피펫팅으로 혼합합니다.
    3. 혼합물을 RT에서 5분 동안 배양하고 1.5mL 튜브를 자기 분리 스탠드에 5분 동안 놓습니다. 피펫을 사용하여 상청액을 제거하고 100 μL의 85% 에탄올을 첨가한다.
    4. 상청액을 폐기하고 4.3.3단계를 반복합니다. 1배. 자석 스탠드에서 1.5mL 튜브를 꺼내 37°C에서 10분 동안 써모 믹서에서 배양하여 에탄올을 건조시킵니다.
    5. 40μL의 뉴클레아제가 없는 물로 비드를 격렬하게 재현탁하고 RT에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 자기 분리 스탠드에 5분 동안 놓고 게시된 보고서14,15에 따라 Sanger 시퀀싱을 수행합니다.
  4. ICE 분석16에 의한 인델 주파수 평가를 수행한다.
    1. ICE 분석을 위해 Synthego( 재료 표 참조)를 사용하십시오.
    2. 편집 및 편집되지 않은 샘플과 gRNA 서열의 ab1 파일을 업로드하고 분석을 클릭하여 Indels의 빈도를 얻습니다.

5. 유전자 편집 HSPC의 이식

  1. 시판되는 NOD scid 감마 마우스(NSG)17 및 NOD를 전제 조건화한다. 골수 이식을 위한 CG-KitW-41JTyr+PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/ThomJ (NBSGW)18 마우스( 재료 표 참조).
    1. NSG 마우스를 전조건화하기 위해 6-8주령 암컷 마우스를 선택하고 맹검 무작위화에 의해 대조군 및 편집된 그룹으로 분리합니다.
    2. NSG 마우스를 파이 케이지에 넣고 HSPC 이식 6-8시간 전에 시판되는 조사기( 재료 표 참조)를 사용하여 3.5Gy로 조사합니다.
      참고: 방사선 조사 전에 마우스의 무게를 측정하는 것이 좋으며 무게가 >20g인 마우스는 방사선 조사를 받게 됩니다.
    3. 6-8 주령의 수컷 및 암컷 NBSGW 마우스를 사전 컨디셔닝하기 위해 HSPC 이식 48 시간 전에 체중 kg 당 12.5mg의 용량으로 복강 내 (IP) 주사를 통해 부 술판 ( 재료 표 참조)을 주사합니다.
      참고: 부술판 컨디셔닝은 마우스 골수에서 인간 HSPC의 생착을 증가시키고 다량의 유전자 편집 HSPC를 주입할 필요성을 감소시킨다19. 컨디셔닝을 위한 부술판 용량의 이상적인 범위는 체중 10mg/kg에서 15mg/kg 사이입니다. 부술판의 복용량을 늘리면 심각한 사망률 문제가 발생합니다.
  2. 골수 이식을 위한 세포 현탁액을 준비한다.
    1. 뉴클레오펙션 스트립에서 유전자-편집된 HSPC의 인큐베이션 10분 후(단계 3.2.7 참조), 세포 현탁액을 10mL의 1x PBS로 옮긴다. Neubauer의 개선된 세포 계수 챔버(10)를 사용하여 세포를 계수한다.
    2. 한 마우스의 주입을 위해, RT에서 5분 동안 200 x g에서 원심분리하여 1.5 mL 튜브에서 6 x 105 세포를 펠릿하고, 펠릿을 방해하지 않고 피펫을 사용하여 상청액을 부드럽게 버린다. 세포 펠릿을 100μL의 1x PBS로 재현탁시킨다.
  3. 아래 단계에 따라 꼬리 정맥 주사로 HSPC를 주입하십시오.
    1. 사전 조절된 NSG 또는 NBSGW 마우스를 마우스 억제기에 놓습니다( 재료 표 참조).
    2. 마우스 꼬리를 잡고 플러그를 부드럽게 밀어 마우스를 제지합니다. 마우스 꼬리를 70 % 에탄올로 부드럽게 닦으십시오. 31 G 인슐린 주사기에서 세포 현탁액 100 μL를 흡인한다.
      알림: 주사기를 부드럽게 두드리거나 플런저를 부드럽게 움직여 주입 제품의 기포를 엄격히 피하십시오.
    3. 적외선 램프의 빛을 꼬리로 30-40 초 동안 향하게하여 마우스의 몸 부위를 티슈 페이퍼로 덮습니다. 바늘의 경사 부분을 왼쪽 또는 오른쪽 꼬리 꼬리 정맥에 20° 각도로 부드럽게 삽입합니다.
    4. 왼쪽 집게 손가락으로 꼬리를 들어 올려 주사기로 평면 축에 유지합니다. 플런저를 밀어 세포 현탁액을 정맥에 주입합니다. 티슈 페이퍼로 피어싱 부위 근처에 부드러운 압력을 가하고 바늘을 빼냅니다.
    5. 30 초 동안 부드러운 압력을 가한 후 구속기에서 마우스를 꺼내 케이지로 옮깁니다.

6. 단기 생착 가능성 평가

  1. 인간 HSPC 이식 4주 후, 파스퇴르 피펫을 사용하여 헤파린화된 튜브에서 안와 정맥동을 통해 혈액을 수집하여 단기 생착을 평가합니다.
    1. 샘플 수집 전에 복강 내 (IP) 주사를 통해 케타민 (90-120 mg / kg) 및 자일 라진 (8-12 mg / kg) 제형으로 동물을 마취하십시오.
      참고: 마취된 마우스의 뒷다리에 부드럽게 압력을 가하여 감각 상실을 확인합니다.
    2. 마취 후 동물을 복부 누운 곳에 놓고 마우스를 부드럽게 긁어 눈을 뜨면 눈의 구체가 약간 튀어 나옵니다.
    3. 파스퇴르 피펫을 30°-45° 각도로 니팅 멤브레인 아래 눈의 내측 칸투스에 부드럽게 삽입합니다. 파스퇴르 피펫을 적절한 위치에 놓은 후 튜브에 약간의 압력을 가하고 튜브를 부드럽게 회전시키기 시작합니다.
      알림: 혈액은 후안와 신경총에 구멍이 뚫리는 즉시 모세관 작용에 의해 튜브로 들어갑니다.
  2. 50-80 μL의 말초 혈액을 수집 한 후 눈의 내측 캔서스에서 피펫을 부드럽게 빼냅니다.
    1. 눈의 궤도 주위에서 출혈을 멈추려면 눈꺼풀을 닫고 거즈 조각을 사용하여 부드러운 압력을가하십시오.
  3. 세포를 각각의 항체로 염색하고(표 8) RT에서 25-30분 동안 암실에서 세포를 배양한다.
  4. 적혈구 용해의 경우, 세포 현탁액에 1x RBC 용해 완충액 3mL(표 7)를 추가하고 얼음에서 10분 동안 배양합니다.
    1. RT에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리하고 피펫을 사용하여 상청액을 버립니다. 6.4단계를 반복합니다. 펠릿의 발적이 사라질 때까지.
    2. 2mL의 1x PBS를 추가하고 RT에서 5분 동안 200 x g 로 원심분리하여 적혈구 용해와 관련된 세포 파편을 제거합니다.
    3. 150 μL의 1x PBS를 펠릿에 첨가한 다음, 유세포분석을 위한 면역표현형을 진행하여 생착된인간 세포의 백분율을 평가하였다7.

7. 장기 생착 가능성 평가

  1. 마우스를 안락사시킵니다.
    1. 생착 분석을 위해 이식된 마우스를 16주차에 희생시키고 1-2분 동안 마우스 케이지 내부에 100%CO2 질식20 을 도입하였다.
    2. 심장 및 호흡 정지와 뒷다리를 부드럽게 꼬집어 근육 운동이 없음을 확인하여 안락사를 확인하십시오. 두 조건이 모두 충족되면 케이지에서 마우스를 제거하십시오.
    3. 인간 세포 키메라를 평가하려면 골수에서 세포를 수집하십시오.
  2. 아래 단계에 따라 골수에서 세포를 분리합니다.
    1. 안락사 후 요도 위 1cm의 수직 절개를하고 횡격막 아래 1cm까지 연장하십시오. 복부를 넓게 열기 위해 절개 된 부위의 모서리를 수평으로 자릅니다.
    2. 대퇴골과 경골을 해부하고 가위를 사용하여 대퇴골과 경골에 부착 된 연조직을 제거합니다. 티슈 페이퍼로 부드럽게 문지르고 메스를 사용하여 0.5mL 미세 원심 분리 튜브 바닥에 직경 0.2cm 이하의 작은 구멍을 만듭니다.
    3. 메스를 사용하여 뼈의 근위 끝을 제거하고 절단면이 0.5mL 미세 원심분리 튜브의 구멍을 향하도록 뼈를 놓습니다. 뼈가 있는 0.5mL 튜브를 멸균 1x PBS 100μL가 들어 있는 1.5mL 튜브에 넣습니다.
    4. 뚜껑을 닫고 RT의 멸균 조건에서 1000 x g 에서 3분 동안 튜브를 회전시킨 다음 빈 골수강이 있는 뼈가 들어 있는 0.5mL 튜브를 버립니다. 골수가 들어 있는 1.5mL 반응 튜브에 1mL의 1x PBS를 추가하고 1mL 피펫을 사용하여 약 10x 이상 세포를 부드럽게 재현탁합니다.
    5. 1mL의 세포 현탁액을 9mL의 RBC 용해 완충액을 포함하는 15mL 튜브로 옮깁니다. 7분마다 튜브를 부드럽게 뒤집어 2분 동안 얼음에서 세포를 배양합니다.
    6. 7분 후, 9m/s²의 가속도와 7m/s²의 감속으로 RT에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리합니다. 7.2.5단계를 반복합니다. 맑은 옅은 흰색 펠릿이 관찰 될 때까지.
    7. 10mL의 멸균 1x DPBS로 세포를 재현탁하고 15mL 튜브의 40μm 세포 스트레이너를 사용하여 골수 세포 현탁액을 여과합니다. 세포 손실을 방지하기 위해 2mL의 1x PBS 2x로 세포 여과기를 헹굽니다.
    8. 200 x g, RT에서 5분 동안 원심분리하고, 피펫을 사용하여 상청액을 버린다. 100 μg/mL의 작동 농도에서 DNase-I를 사용하여 10 mL의 IMDM으로 세포를 재현탁합니다.
    9. 유세포 분석에 의한 생착 분석을 위해 FACS 튜브에서 1 x 106 단핵 세포를 채취합니다. 생착된 골수 단핵 세포에서 유전자 편집 빈도를 평가하기 위해, RT에서 5분 동안 11,000 x g에서 1 x 106 단핵 세포를 펠릿하고 피펫을 사용하여 상청액을 버립니다.

8. 면역 표현형

  1. 항체로 염색하기 전에 정제된 재조합 인간 Fc 단백질 1.5μL( 재료 표 참조)와 함께 골수 세포를 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
    참고 : 여기에 사용 된 인간 Fc 단백질은 IgG 수용체에 의해 유발되는 비특이적 항체 염색을 차단하도록 공식화되었습니다. 이에 의해, 항체 표지 7,21,22의 특이성을 증가시킨다. 표적 세포의 항체 염색에 앞서, 항체 적정을 수행한다. 다중 색상 유세포 분석 작업을 하는 동안 FMO 대조군과 이소타입 대조군을 포함하는 것이 좋습니다.
  2. 유세포분석기에 의한 인간 세포 생착의 백분율을 결정하기 위해, FACS 튜브에서 1 x 106 단 핵 세포를 취하고, 표 8에 언급된 바와 같이 세포를 염색한다.
  3. RT에서 25-30분 동안 어둠 속에서 세포를 배양하고, RT에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리하고, 피펫을 사용하여 상청액을 버린다.
  4. 유세포 분석기로 세포를 획득하고, 단핵구의 정방향(FSC) 및 측면 산란(SSC)을 이용하여 세포 집단(P1)을 게이트하고, 세포 집단에 따라 전압을 조절한다. P1 모집단에서 50,000개의 세포 이벤트를 획득합니다.
  5. 마우스 골수에서 인간 백혈구 집단을 분석하려면 유세포 분석 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 P1 세포 집단에서 인간 CD45+ 세포 및 마우스 CD45.1을 게이트합니다( 재료 표 참조).
  6. 다음 공식8을 사용하여 인간 세포의 생착을 계산하십시오.
    생착의 % = (% hCD45) / (% hCD45 + % mCD45) × 100.
    참고: 인간 생착에 대한 역치는 CD45에 대해 0.1% 양성으로 간주되었습니다.
  7. 또한 인간 CD45+ 세포에서 hCD34+ 세포의 백분율을 분석하여 장기 재집단 세포를 평가합니다. 생착된 인간 세포의 다계통 재구성을 평가하기 위해, 표 9에 따라 100 μL의 세포 현탁액을 염색한다.
    참고: 항체는 실험 전에 적정되어야 합니다.
  8. 유세포분석 소프트웨어를 사용하여 P1 세포 집단에서 hCD45를 게이트하고 hCD45에서 hCD19, hCD3 및 hCD13(림프구 및 골수성 하위 집합)의 백분율을 정량화합니다.

9. 생착된 골수 단핵세포에서의 유전자 편집 빈도 평가

  1. 골수 단핵 세포 펠릿에 5 x 105 세포에 대한 50μL의 빠른 추출 용액(재료 표 참조)을 추가하고 펠릿을 재현탁합니다.
  2. 혼합물을 68°C의 열순환기에서 30분 동안 배양합니다. 짧은 스핀 후, 혼합물을 98°C의 열순환기에서 10분 동안 배양한다.
  3. 분광 광도계를 사용하여 조 용해물 중의 DNA 농도를 측정한다. 4.2.-4.4 단계를 따르십시오. ICE 분석 8,15를 사용하여 유전자 편집 빈도를 검증합니다.

결과

본 연구는 생체 외 배양에서 CD34+CD133+CD90+ HSC의 보유를 용이하게 하는 이상적인 HSPC 배양 조건을 식별합니다. 유전자 변형 HSC의 향상된 생성과 함께 HSC의 배양 농축을 입증하기 위해 PBMNC 분리, CD34+ 세포 정제, 배양, 유전자 편집, 이식, 생착 특성화 및 생체 내 유전자 변형 세포를 위한 최적화된 절차가 제공됩니다(그림 1). 정제 후...

토론

HSPC 유전자 치료의 성공적인 결과는 주로 이식편에서 생착 가능한 HSC의 품질과 양에 달려 있습니다. 그러나 HSC의 기능적 특성은 체외 배양 및 유전자 조작 절차와 관련된 독성을 포함하여 유전자 치료 제품의 준비 단계에서 크게 영향을받습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 생체 외 배양에서 CD34+CD133+CD90+ HSC의 줄기를 유지하는 이상적인 HSPC 배양 조?...

공개

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 존재하지 않는다고 선언합니다.

감사의 말

저자는 CSCR의 유세포 분석 시설 및 동물 시설의 직원을 인정하고자합니다. A. C.는 ICMR-SRF 펠로우십, K. V. K.는 DST-INSPIRE 펠로우십, PB는 CSIR-JRF 펠로우십에서 자금을 지원합니다. 이 작업은 인도 정부 생명공학부(보조금 번호 BT/PR26901/MED/31/377/2017 및 BT/PR31616/MED/31/408/2019)에서 자금을 지원했습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
4D-Nucleofector® X UnitLONZA BIOSCIENCEAAF-1003X
4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips)LONZA BIOSCIENCEV4XP-3032
Antibiotic-Antimycotic (100X)THERMO SCIENTIFIC15240096
Anti-human CD45 APCBD BIOSCIENCE 555485 
Anti-human CD13 PEBD BIOSCIENCE555394
Anti-human CD19 PerCPBD BIOSCIENCE340421
Anti-human CD3 PE-Cy7BD BIOSCIENCE557749
Anti-human CD90 APCBD BIOSCIENCE561971
Anti-human CD133/1 Miltenyibiotec130-113-673
Anti-human CD34 PEBD BIOSCIENCE348057
Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5BD BIOSCIENCE560580
Blood Irradator-2000 BRIT (Department of Biotechnology, India)BI 2000 
Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates)NUNC (THERMO SCIENTIFIC)140675
CrysoStor CS10BioLife solutions#07952
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Guide-it Recombinant Cas9TAKARA BIO632640
Cas9-eGFPSIGMAC120040 
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 Centrifuge tube-50mlNUNC (THERMO SCIENTIFIC)339652
DMSOMPBIO219605590
DNAaseSTEMCELL TECHNOLOGIES6469
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1XHYCLONESH30028.02
EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit IISTEMCELL TECHNOLOGIES17856
EasySep magnetSTEMCELL TECHNOLOGIES18000
Electrophoresis unitORANGE INDIAHDS0036
FBSTHERMO SCIENTIFIC10270106
Flow cytometer – ARIA IIIBD BIOSCIENCE- 
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Mice RestrainerAVANTORTV-150
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Nunc delta 6-well plateTHERMO SCIENTIFIC140675
Polystyrene round-bottom tubeBD352008
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Pasteur pipetteFISHER SCIENTIFIC13-678-20A
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Mouse Pie CageFISCHER SCIENTIFIC50-195-5140
polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm)STEMCELL TECHNOLOGIES38007
Primer3Whitehead Institute for Biomedical Researchhttps://primer3.ut.ee/
QuickExtract™ DNA Extraction SolutionLucigenQE09050
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UM171STEMCELL TECHNOLOGIES72914
UM729STEMCELL TECHNOLOGIES72332
XylazineXYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED-

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