Détermination de la perméabilité intestinale à l’aide du jaune de Lucifer dans un modèle entéroïde apical-out

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode qui utilise le jaune de lucifer dans un modèle entéroïde apical-out pour déterminer la perméabilité intestinale. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer la perméabilité paracellulaire chez les entéroïdes qui modélisent les maladies inflammatoires de l’intestin telles que l’entérocolite nécrosante.

Résumé

Les entéroïdes sont un outil de recherche émergent dans l’étude des maladies inflammatoires de l’intestin telles que l’entérocolite nécrosante (ECN). Ils sont traditionnellement cultivés dans la conformation basolatérale (BO), où la surface apicale de la cellule épithéliale fait face à la lumière interne. Dans ce modèle, l’accès à la surface luminale des entéroïdes pour le traitement et l’expérimentation est difficile, ce qui limite la capacité d’étudier les interactions hôte-pathogène. Pour contourner ce problème, un modèle néonatal apical-out (OA) pour l’entérocolite nécrosante a été créé. Étant donné que les changements de perméabilité des cellules épithéliales intestinales sont pathognomoniques pour l’ECN, ce protocole décrit l’utilisation du jaune de lucifer (LY) comme marqueur de la perméabilité paracellulaire. LY traverse la barrière épithéliale intestinale par les trois principales voies paracellulaires: pore, fuite et sans restriction. L’utilisation de LY dans un modèle AO permet une étude plus large de la perméabilité dans NEC. À la suite de l’approbation de la CISR et du consentement parental, des échantillons chirurgicaux de tissu intestinal ont été prélevés sur des nouveau-nés prématurés humains. Les cellules souches intestinales ont été récoltées par isolement de crypte et utilisées pour cultiver des entéroïdes. Les entéroïdes ont été cultivés jusqu’à maturité, puis transformés AO ou laissés en conformation BO. Ceux-ci n’ont pas été traités (témoins) ou ont été traités avec du lipopolysaccharide (LPS) et soumis à des conditions hypoxiques pour l’induction d’ECN in vitro . La LY a été utilisée pour évaluer la perméabilité. La coloration immunofluorescente de la protéine apicale zonula occludens-1 et de la protéine basolatérale β-caténine a confirmé la conformation de l’AO. Les entéroïdes AO et BO traités avec du LPS et de l’hypoxie ont démontré une perméabilité paracellulaire significativement accrue par rapport aux témoins. Les entéroïdes OA et BO ont montré une absorption accrue de LY dans la lumière des entéroïdes traités par rapport aux témoins. L’utilisation de la LY dans un modèle entéroïde AO permet d’étudier les trois principales voies de perméabilité paracellulaire. Il permet également d’étudier les interactions hôte-pathogène et comment cela peut affecter la perméabilité par rapport au modèle entéroïde BO.

Introduction

Les entéroïdes sont des structures tridimensionnelles (3D) dérivées de cellules souches intestinales humaines^{restreintes aux} organes ^1,2. Ils sont entièrement constitués de lignée épithéliale et contiennent tous les types de cellules épithéliales intestinales différenciées². Les entéroïdes maintiennent également la polarité cellulaire composée d’une surface luminale apicale formant un compartiment interne et d’une surface basolatérale faisant face au milieu environnant. Les entéroïdes sont un modèle unique en ce sens qu’ils préservent les caractéristiques de l’hôte à partir duquel ils ont été générés³. Ainsi, les entéroïdes générés à partir de nourrissons humains prématurés représentent un modèle utile pour étudier les maladies qui touchent principalement cette population, telles que l’entérocolite nécrosante (ECN).

Le modèle entéroïde traditionnel est cultivé dans une conformation basolatérale (BO), où l’entéroïde est enfermé dans un dôme de matrice membranaire basale (BMM). BMM induit l’entéroïde à maintenir une structure 3D avec la surface basolatérale à l’extérieur. Les entéroïdes BO sont un modèle approprié pour l’ECN qui comble l’écart entre les lignées cellulaires humaines primaires bidimensionnelles (2D) et les modèles animaux in vivo ^2,4. L’ECN est induite chez les entéroïdes en plaçant des agents pathogènes tels que le LPS ou les bactéries dans le milieu entourant les entéroïdes, suivie d’une exposition à des conditions hypoxiques ^2,3. Le défi avec le modèle NEC entéroïde BO est qu’il ne permet pas l’étude efficace des interactions hôte-pathogène, qui se produisent à la surface apicale in vivo. Les changements dans la perméabilité intestinale sont dus à ces interactions hôte-pathogène. Pour mieux comprendre comment la perméabilité affecte la base physiopathologique de la maladie, il faut créer un modèle qui implique le traitement de la surface apicale.

Co et al. ont été les premiers à démontrer que les entéroïdes BO matures peuvent être induits à former une conformation apicale-out (AO) en retirant les dômes BMM et en les remettant en suspension dans le milieu⁵. Cet article a démontré que les entéroïdes AO maintenaient une polarité épithéliale correcte, contenaient tous les types de cellules intestinales, maintenaient la barrière épithéliale intestinale et permettaient l’accès à la surface apicale⁵. L’utilisation des entéroïdes AO comme modèle NEC permet une reproduction physiologique du processus pathologique et l’étude des interactions hôte-pathogène.

L’un des principaux contributeurs à la physiopathologie de l’ECN est l’augmentation de la perméabilité intestinale⁶. Plusieurs molécules ont été proposées comme moyen de tester la perméabilité intestinale in vitro⁷. Parmi ceux-ci, le jaune de lucifer (LY) est un colorant hydrophile avec des pics d’excitation et d’émission à 428 nm et 540 nm, respectivement⁸. Comme il traverse toutes les principales voies paracellulaires, il a été utilisé pour évaluer la perméabilité paracellulaire dans diverses applications, y compris les barrières hémato-encéphalique et intestinale ^8,9. L’application traditionnelle de LY utilise des cellules cultivées en monocouches sur une surface semi-perméable¹⁰. LY est appliqué sur la surface apicale et traverse les protéines de jonction serrée paracellulaire pour se rassembler sur le côté basolatéral. Des concentrations plus élevées de LY dans le compartiment basolatéral indiquent une diminution des protéines de jonction serrée avec une dégradation subséquente de la barrière cellulaire épithéliale intestinale et une perméabilité accrue¹⁰. Il a également été décrit dans des modèles entéroïdes BO 3D où la LY a été ajoutée au milieu et les entéroïdes individuels ont été imagés pour l’absorption de LY dans la lumière¹¹. Bien que cela permette une analyse qualitative via la visualisation de l’absorption des LEI, l’analyse quantitative est limitée. Ce protocole décrit une technique unique qui utilise la LY pour évaluer la perméabilité paracellulaire à l’aide d’un modèle entéroïde NEC in vitro chez les entéroïdes AO tout en maintenant l’orientation 3D. Cette méthode peut être utilisée pour l’analyse qualitative et quantitative de la perméabilité.

Protocole

La présente recherche a été réalisée conformément à l’approbation du Institutional Review Board (IRB, #11610, 11611) à l’Université de l’Oklahoma. Le consentement des parents était requis avant de prélever des échantillons chirurgicaux humains, conformément aux spécifications de la CISR. Après l’approbation de la CISR et le consentement des parents, du tissu intestinal grêle humain a été obtenu chez des nourrissons (âge gestationnel corrigé (AG) allant de 36 à 41 semaines au moment du prélèvement de l’échantillon, tous ayant des antécédents de naissance prématurée à un AG estimé de 25 à 34 semaines, 2:1 M:F) subissant une intervention chirurgicale pour une ECN ou une autre résection intestinale, comme un retrait de stomie ou une réparation de l’atrésie. Les entéroïdes ont été générés à partir de tissus obtenus à partir du jéjunum ou de l’iléon.

1. Cultures entéroïdes humaines d’origine infantile : isolement de la crypte et placage à partir de tissus entiers

1. Préparer les milieux de culture, le tampon chélatant #1 et le tampon chélatant #2 (tableau 1) à la suite du rapport précédent⁴. Conserver les tampons chélatants à 4 °C et les utiliser dans les 48 heures.
2. Préparer des milieux miniintestinaux humains (tableau 1). Conservez le bouillon à −20 °C et au chaud au bain-marie à 37 °C avant utilisation.
3. Préparer 50 % de milieux conditionnés en L-WRN (CM) (Tableau 1). Conservez le bouillon à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
   NOTE: La base 100% L-WRN pour les milieux conditionnés est décrite dans un protocole par Miyoshi et ^al.12.
4. Générer des entéroïdes à partir d’échantillons de tissus intestinaux grêles obtenus à partir d’échantillons chirurgicaux suite au rapport précédent⁴. Plaquer quatre puits d’entéroïdes dans une plaque de 24 puits à partir d’un morceau de tissu intestinal de 0,75 à 2,5 g.
   REMARQUE : Les entéroïdes peuvent être générés avec succès à partir de tissus stockés dans un milieu de 30 ml du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 dans un tube conique de 50 ml à 4 °C pendant 48 h maximum.
5. Placez la plaque de 24 puits dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO₂ à l’envers pendant 15-20 minutes pour permettre la polymérisation des dômes BMM⁴.
6. Ajouter 500 μL de L-WRN cm à 50 % (tel que décrit à l’étape 1.3) avec 0,5 μL d’Y-27632, inhibiteur de ROCK (IR, voir le tableau des matériaux) à chaque puits. Après 2-3 jours, remplacer par 50% L-WRN CM sans RI.

2. Génération d’entéroïdes AO

1. Cultiver des entéroïdes incorporés dans BMM pendant 7-10 jours avec 50% L-WRN^{CM 4}.
2. Retirez le média et ajoutez 500 μL de solution de récupération cellulaire (CRS, voir Tableau des matériaux) dans un puits. Grattez le dôme, pipette de haut en bas plusieurs fois, puis ajoutez la solution CRS/entéroïde/BMM au puits suivant.
3. Grattez le dôme, pipette de haut en bas plusieurs fois et placez la solution dans un tube à microcentrifugeuse. Ajouter 500 μL de CRS au deuxième puits, pipeter de haut en bas, puis l’ajouter au premier puits. Transférer cette solution dans le même tube microcentrifuge de 1,5 mL.
4. Répétez l’étape 2.3, en regroupant deux puits dans un tube microcentrifuge jusqu’à ce que tout le contenu du puits soit dans CRS.
   REMARQUE : Plus de deux puits peuvent être regroupés dans un tube conique plus grand de 15 mL s’ils génèrent de grands volumes d’entéroïdes d’AO. Le maintien d’un ratio de SRC par puits de 500 μL est important pour assurer une solubilisation complète de la BMM.
5. Placer les tubes microcentrifugés (étape 2.3) avec une solution poolée CRS/entéroïde/BMM sur un rotateur pendant 1 h à 4 °C pour solubiliser le BMM.
6. Centrifuger la solution à 200 x g pendant 3 min à 4°C, puis retirer le surnageant à l’aide d’une micropipette en laissant la pastille derrière.
7. Resuspendre la pastille entéroïde dans 1 mL de L-WRN cm à 50 % (tel que préparé à l’étape 1.3) par tube de microcentrifugeuse. Pipeter doucement 500 μL de la solution entéroïde/milieu en suspension dans chaque puits des plaques de culture tissulaire à 24 puits à très faible fixation (voir le tableau des matériaux).
8. Incuber à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 3 jours avant l’expérimentation.

3. Vérification de la conformation entéroïde de l’OA par coloration immunofluorescente sur support entier

1. Après l’incubation des entéroïdes en suspension de milieu pendant 3 jours, pipeter la suspension entéroïde/média d’un puits dans un tube à microcentrifugeuse.
2. Centrifuger la suspension entéroïde/milieu à 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant à l’aide d’une micropipette.
3. Resuspendre les entéroïdes dans 20 μL de BMM. Pipeter 10 μL de suspension entéroïde sur une lame de microscope et l’étaler en une fine couche d’environ 1 cm sur 1 cm carré. Répéter avec les 10 μL restants de suspension entéroïde sur une partie séparée de la même lame de sorte qu’il y ait deux frottis de suspension entéroïde/BMM.
4. Laisser les frottis entéroïdes/BMM se solidifier à température ambiante (TR) pendant 15 min.
5. En travaillant dans la hotte, placer la lame dans un pot de coloration et remplir de 4% de paraformaldéhyde jusqu’à ce qu’elle recouvre le frottis entéroïde/BMM (~30 mL pour une lame si vous utilisez un pot de coloration en verre d’une capacité de 10 lames). Laisser agir 30 minutes (à température ambiante) pour que la fixation ait lieu.
   ATTENTION : Le paraformaldéhyde à 4 % est dangereux et peut causer des lésions ou irritations oculaires, une irritation de la peau et le cancer. Travaillez toujours sous une hotte lorsque vous l’utilisez. Portez des gants de protection et de l’équipement de protection individuelle lorsque vous le manipulez. Jetez-le dans un conteneur d’élimination des déchets approuvé.
6. Jeter 4 % de paraformaldéhyde dans un contenant à déchets approprié. Ajouter 30 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le pot de coloration ou jusqu’à ce que le PBS recouvre les frottis entéroïdes/BMM. Laisser reposer pendant 3 minutes à TA, puis jeter le PBS dans le flacon de déchets de paraformaldéhyde. Répétez cette étape deux fois de plus pour un total de trois lavages.
7. Remplissez un nouveau pot de coloration avec 30 ml de Triton X-100 à 0,5% dilué dans du PBS. Placer la lame avec les frottis entéroïdes/BMM dans la solution Triton et laisser perméabiliser pendant 20 min à TA.
8. Jetez le Triton X-100 à 0,5% dilué dans du PBS. Ajouter 30 ml de PBS dans le pot de coloration et laisser reposer pendant 3 minutes. Jetez le PBS en le décantant.
9. Essuyez délicatement la lame autour des frottis entéroïdes/BMM, en prenant soin de ne pas les perturber. À l’aide d’un stylo barrière hydrophobe (stylo PAP barrière, voir le tableau des matériaux), tracez un cercle autour de chacun des frottis entéroïdes/BMM. Faire un sérum à 20%, spécifique à l’animal chez lequel l’anticorps secondaire a été élevé (voir Tableau des matériaux).
10. Posez la lame du microscope à plat sur la paillasse du laboratoire. Bloquer la lame pendant 1 h à 4 °C en pipetant 100 μL de sérum spécifique à 20 % de l’étape 3.9 sur chacun des frottis entéroïdes/BMM entourés par le stylo barrière hydrophobe.
11. Préparer une solution de 100 μL avec des dilutions de 1:100 et 1:200 d’anticorps primaires β-caténine et ZO-1, respectivement, dilués dans du PBS.
    REMARQUE : Chaque anticorps primaire doit provenir d’un animal différent pour s’assurer qu’il aura des canaux immunofluorescents distincts lorsqu’il sera photographié. La présente étude utilise un anticorps β-caténine de souris et un anticorps ZO-1 de lapin (voir le tableau des matériaux).
12. Appuyez sur la lame sur le comptoir pour retirer le sérum à 20% et essuyez doucement, en prenant soin de ne pas perturber les frottis entéroïdes / BMM. Pipeter 100 μL de solution d’anticorps primaires β-caténine/ZO-1 sur l’un des frottis entéroïdes/BMM. Pipeter 100 μL de PBS sans anticorps primaire sur l’autre frottis entéroïde/BMM comme témoin négatif.
13. Tapisser le fond d’un contenant en plastique avec une serviette en papier humide pour créer un contenant humidifié. Placez la lame dans le récipient, en veillant à ne pas perturber les solutions recouvrant les frottis entéroïdes/BMM. Placez le couvercle sur le récipient pour le sceller et conservez à plat à 4 °C pendant la nuit.
    REMARQUE: Ne laissez pas la lame sécher. Assurez-vous que le contenant est fermé pour éviter la dessiccation.
14. Une fois prêt à continuer, appuyez sur la lame sur le comptoir pour retirer les anticorps primaires et le PBS des frottis entéroïdes / BMM.
15. Effectuez une étape de lavage en plaçant la lame dans un bocal à colorer et en la remplissant de 30 ml de PBS ou jusqu’à ce que le PBS recouvre les frottis entéroïdes / BMM. Laisser reposer pendant 3 min à température ambiante. Jetez le PBS et répétez cette étape deux fois de plus pour un total de trois lavages.
16. Préparer 200 μL d’anticorps secondaires pour deux canaux immunofluorescents différents, chaque anticorps ayant une dilution de 1:1000 dans du PBS (voir le tableau des matériaux). Gardez la solution à l’abri de la lumière.
17. Pipeter 100 μL de solution d’anticorps secondaires sur chacun des frottis entéroïdes/BMM. Placez-le dans l’obscurité et laissez-le reposer pendant 1 h à RT.
18. Appuyez sur la lame sur le compteur pour retirer les anticorps secondaires. Répétez les étapes de lavage décrites à l’étape 3.15, en vous assurant que tous les lavages sont effectués dans l’obscurité.
19. Ajouter une goutte de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (Fluoroshield avec DAPI, voir le tableau des matières) sur chacun des frottis entéroïdes/BMM et appliquer une lame de couverture pour s’assurer que les deux frottis sont adéquatement couverts. Évitez de coincer des bulles sous la lame. Gardez la lame dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elle soit prête à être vue au microscope.
    REMARQUE: L’imagerie immédiate des lames donne les résultats les plus optimaux; cependant, les lames peuvent être stockées à plat dans un récipient humidifié à 4 °C et imagées jusqu’à 1 semaine après l’ajout de DAPI.

4. Induction de l’ECN expérimentale

1. S’assurer que les entéroïdes OA ont été en suspension pendant au moins 72 heures avant utilisation.
2. Pipeter doucement toute la suspension entéroïde/média de chaque puits dans un tube à microcentrifugation.
   REMARQUE : Plusieurs puits peuvent être regroupés dans un tube conique de 15 mL si un grand volume de puits est traité. Un minimum de trois puits par groupe de traitement est recommandé pour ce protocole.
3. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à TA et retirer le surnageant.
4. Ajouter 10 μL de 5 mg/mL de lipopolysaccharide (LPS, voir le tableau des matières) à 500 μL de 50 % de LWRN CM par puits (concentration finale de 100 μg/mL de LPS).
5. Resuspendre les entéroïdes AO désignés comme groupe de traitement dans 50% LWRN + LPS et aliquote 500 μL de suspension sur une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits. Resuspendre les entéroïdes AO désignés comme témoins non traités dans 500 μL de 50 % de REL CM par puits. Aliquote 500 μL de cette suspension à une plaque de fixation séparée à très basse température de 24 puits.
6. Induire l’hypoxie chez les entéroïdes AO traités au LPS via une chambre d’incubateur modulaire (CMI) contenant 1 % d’O2, 5 % de CO₂ et 94 % de_N2 selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Traiter les entéroïdes avec hypoxie et LPS pendant 24 h.
7. Placer les cultures non traitées et LPS + hypoxie, toujours dans la chambre MIC, dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO₂ pendant 24 h.

5. Mesure de la perméabilité paracellulaire à l’aide de LY

1. Pipeter doucement la suspension entéroïde/média de chaque puits dans un tube microcentrifugé. Réchauffer DPBS et 50% LRWN CM dans un bain-marie à 37 °C.
2. Centrifuger la suspension entéroïde/milieu à 300 x g pendant 3 min à TA.
3. Retirez le support. Lavez les entéroïdes avec du DPBS chaud de 500 μL.
4. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à TA. Retirer le surnageant à l’aide d’une micropipette.
5. Répétez les étapes 5.3 à 5.4 une fois de plus pour un total de deux fois.
6. Après le lavage, ajouter 450 μL de LWRN CM chaud à 50 % (tel que préparé à l’étape 1.3).
7. Ajouter 50 μL de LY à 2,5 mg/mL (concentration finale de 0,25 μg/μL, voir le tableau des matières) à chaque puits et agiter doucement pour mélanger. Placer dans un incubateur à 37 °C, 5% CO 2 pendant₂ h.
8. Pipeter doucement la suspension entéroïde/média de chaque puits dans un tube microcentrifugé.
9. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à TA, puis retirer le surnageant en laissant la pastille entéroïde derrière.
10. Laver les entéroïdes avec 500 μL de DPBS chaud.
11. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à TA, puis retirer le surnageant en laissant la pastille entéroïde derrière.
12. Répétez les étapes 5.10-5.11 trois fois de plus pour un total de quatre lavages.
13. Remettez chaque pastille en suspension avec 1 000 μL de DPBS froid et pipeter vigoureusement de haut en bas pour dissocier les entéroïdes.
14. Préparer des étalons pour la courbe étalon LY diluée dans la DPBS (100 ng/mL; 50 ng/mL; 25 ng/mL; 12,5 ng/mL; 6,25 ng/mL; 3,13 ng/mL; 1,57 ng/mL; 0 ng/mL).
15. Pipeter 150 μL de chaque échantillon par puits en triple sur une plaque de 96 puits.
16. Mesurer la fluorescence à un pic d’excitation de 428 nm et un pic d’émission de 536 nm sur un lecteur de plaque capable de lire la fluorescence (voir le tableau des matériaux). À l’aide d’un logiciel statistique (voir le tableau des matières), calculer les concentrations en interpolant la courbe standard et en utilisant une courbe à quatre paramètres.

Résultats

Conformation AO
Les entéroïdes en suspension dans un milieu LWRN à 50 % pendant 72 h supposent une conformation OA (Figure 1). Cela a été confirmé par coloration immunofluorescente utilisant des montures entières entéroïdes de la protéine apicale, zonula occludens-1 (ZO-1), et de la protéine basolatérale, β-caténine (Figure 1). Les entéroïdes AO montrent ZO-1 (vert) sur la surface apicale externe de l’entéroïde, t...

Discussion

La perméabilité intestinale est complexe et reflète la fonction de barrière épithéliale. La barrière intestinale comprend une seule couche de cellules épithéliales qui intervient dans le transport transcellulaire et paracellulaire¹⁴. La perméabilité paracellulaire repose sur des protéines de jonction serrée qui scellent l’espace entre les cellules épithéliales¹⁴. Dans ce transport paracellulaire, il existe trois voies distinctes par lesquelles les molécule...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
[leu] 15-gastrin 1	Millipore Sigma	G9145-.1MG
100 µm sterile cell strainer	Corning	431752
100% LWRN conditioned media	Made in-house following Miyoshi et al.12
24-well tissue culture plate	Corning	3526
96-well black, clear bottom plate	Greiner Bio-One	655090
A-83-01	R&D Systems	2939/10
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11032
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200	Cell Signaling	#D6L1E
Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100	Cell Signaling	#14-2567-82
B-27 supplement minus Vitamin A	Thermo Fisher Scientific	17504-044
Barrier PAP pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
BMM (Matrigel)	Corning	CB-40230C
Cell Recovery Solution	Corning	354270
Dissecting scissors
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11-965-118
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	11320-082
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14-190-144
Epidermal Growth Factor (EGF)	Millipore Sigma	GF144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	EDS-500G
EVOS m7000 Imaging system	Invitrogen	AMF7000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-525
Fluoroshield with DAPI	Millipore Sigma	F6057-20mL
Forceps
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15-750-060
Glass coverslips
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061
GraphPad Prism 9	Dotmatics
Insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Lipopolysaccharide (LPS)	Millipore Sigma	L2630-25MG
Lucifer Yellow CH, Lithium Salt	Invitrogen	L453
Modular incubator chamber	Billups Rothenberg Inc.	MIC101
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)	Thermo Fisher Scientific	15630-080
N-Acetylcysteine	Millipore Sigma	A9165-5G
Nicotinamide	Millipore Sigma	N0636-100G
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-148
Refrigerated swinging bucket centrifuge
Refrigerated tabletop microcentrifuge
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
SB202190	Millipore Sigma	S7067-5MG
SpectraMax iD3 microplate reader	Molecular devices
Tube Revolver Rotator	ThermoFisher Scientific	88881001
Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate	Corning	3473
Y-27632, ROCK inhibitor (RI)	Tocris	1254