Apikal-Out Enteroid Modelde Lucifer Sarı Kullanarak Bağırsak Geçirgenliğinin Belirlenmesi

Özet

Mevcut protokol, bağırsak geçirgenliğini belirlemek için apikal-dışarı enteroid modelinde lusifer sarısı kullanan bir yöntemi özetlemektedir. Bu yöntem, nekrotizan enterokolit gibi inflamatuar bağırsak hastalıklarını modelleyen enteroidlerde parasellüler geçirgenliği belirlemek için kullanılabilir.

Özet

Enteroidler, nekrotizan enterokolit (NEC) gibi enflamatuar bağırsak hastalıklarının incelenmesinde ortaya çıkan bir araştırma aracıdır. Geleneksel olarak, epitel hücresinin apikal yüzeyinin iç lümene baktığı bazolateral çıkış (BO) konformasyonunda yetiştirilirler. Bu modelde, tedavi ve deney için enteroidlerin luminal yüzeyine erişim zordur, bu da konakçı-patojen etkileşimlerini inceleme yeteneğini sınırlar. Bunu atlatmak için, nekrotizan enterokolit için bir yenidoğan apikal-out (AO) modeli oluşturuldu. İntestinal epitel hücre geçirgenliği değişiklikleri NEC için patognomonik olduğundan, bu protokol parasellüler geçirgenliğin bir belirteci olarak lusifer sarısı (LY) kullanımını özetlemektedir. LY, bağırsak epitel bariyerini üç ana parasellüler yolun hepsinden geçirir : gözenek, sızıntı ve kısıtlamasız. Bir AO modelinde LY kullanmak, NEC'de geçirgenliğin daha geniş bir çalışmasına izin verir. IRB onayı ve ebeveyn onayını takiben, insan preterm yenidoğanlardan bağırsak dokusunun cerrahi örnekleri toplandı. Bağırsak kök hücreleri kript izolasyonu yoluyla toplandı ve enteroidleri büyütmek için kullanıldı. Enteroidler olgunluğa erişti ve daha sonra AO'yu dönüştürdü veya BO konformasyonunda bırakıldı. Bunlar ya tedavi edilmedi (kontrol) ya da lipopolisakkarit (LPS) ile tedavi edildi ve in vitro NEC'nin indüksiyonu için hipoksik koşullara maruz bırakıldı. Geçirgenliği değerlendirmek için LY kullanıldı. Apikal protein zonula oklüdens-1 ve bazolateral protein β-kateninin immünofloresan boyanması AO konformasyonunu doğruladı. LPS ve hipoksi ile tedavi edilen AO ve BO enteroidleri, kontrollere kıyasla önemli ölçüde artmış parasellüler geçirgenlik göstermiştir. Hem AO hem de BO enteroidleri, kontrollere kıyasla tedavi edilen enteroidlerin lümenine LY'nin alımının arttığını göstermiştir. Bir AO enteroid modelinde LY'nin kullanılması, parasellüler geçirgenliğin üç ana yolunun hepsinin araştırılmasına izin verir. Ek olarak, konakçı-patojen etkileşimlerinin araştırılmasına ve bunun BO enteroid modeline kıyasla geçirgenliği nasıl etkileyebileceğine izin verir.

Giriş

Enteroidler, organ kısıtlı insan bağırsak kök hücrelerinden türetilen üç boyutlu (3D) yapılardır ^1,2. Tamamen epitel soyundan oluşurlar ve tüm farklılaşmış intestinal epitel hücre tiplerini^{içerirler 2}. Enteroidler ayrıca bir iç bölme oluşturan apikal bir luminal yüzeyden ve çevredeki ortama bakan bazolateral bir yüzeyden oluşan hücresel polariteyi korurlar. Enteroidler, üretildikleri konakçının özelliklerini korudukları için benzersiz bir modeldir³. Bu nedenle, prematüre insan bebeklerinden üretilen enteroidler, nekrotizan enterokolit (NEC) gibi öncelikle bu popülasyonu etkileyen hastalıkları araştırmak için yararlı olan bir modeli temsil eder.

Geleneksel enteroid model, enteroidin bir bazal membran matrisi (BMM) kubbesi içine alındığı bir bazolateral çıkış (BO) konformasyonunda yetiştirilir. BMM, enteroidin dışarıdaki bazolateral yüzey ile 3D bir yapıyı korumasını sağlar. BO enteroidleri, iki boyutlu (2D) birincil insan hücre hatları ile in vivo hayvan modelleri ^2,4 arasındaki boşluğu dolduran NEC için uygun bir modeldir. NEC, enteroidleri çevreleyen ortama LPS veya bakteri gibi patojenlerin yerleştirilmesiyle enteroidlerde indüklenir, ardından hipoksik koşullara maruz kalır ^2,3. BO enteroid NEC modeli ile ilgili zorluk, apikal yüzeyde in vivo olarak meydana gelen konakçı-patojen etkileşimlerinin etkili bir şekilde çalışılmasına izin vermemesidir. Bağırsak geçirgenliğindeki değişiklikler bu konakçı-patojen etkileşimlerinden kaynaklanmaktadır. Geçirgenliğin hastalığın patofizyolojik temelini nasıl etkilediğini daha iyi anlamak için, apikal yüzeyin tedavisini içeren bir model oluşturulmalıdır.

Co ve ark., olgun BO enteroidlerinin, BMM kubbelerini çıkararak ve bunları medya^5'te yeniden askıya alarak apikal-out (AO) konformasyonu oluşturmaya indüklenebileceğini gösteren ilk kişilerdir. Bu makalede, AO enteroidlerinin doğru epitel polaritesini koruduğu, tüm intestinal hücre tiplerini içerdiği, intestinal epitel bariyerini desteklediği ve apikal yüzeye erişime izin verdiği^{gösterilmiştir 5}. AO enteroidlerinin bir NEC modeli olarak kullanılması, hastalık sürecinin fizyolojik bir üremesini ve konakçı-patojen etkileşimlerinin incelenmesini sağlar.

NEC'nin patofizyolojisine önemli bir katkıda bulunanlardan biri artmış bağırsak geçirgenliğidir⁶. İn vitro⁷ bağırsak geçirgenliğini test etmenin bir yolu olarak birkaç molekül önerilmiştir. Bunlar arasında, lusifer sarısı (LY), sırasıyla 428 nm ve 540 nm'de uyarma ve emisyon zirvelerine sahip hidrofilik bir boyadır^. Tüm ana parasellüler yollardan geçerken, kan-beyin ve bağırsak epitel bariyerleri ^8,9 dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda parasellüler geçirgenliği değerlendirmek için kullanılmıştır. LY'nin geleneksel uygulaması, yarı geçirgen bir yüzey¹⁰ üzerinde tek katmanlı olarak yetiştirilen hücreleri kullanır. LY apikal yüzeye uygulanır ve bazolateral tarafta toplanmak için parasellüler sıkı bağlantı proteinlerinden geçer. Bazolateral bölmedeki daha yüksek LY konsantrasyonları, daha sonra bağırsak epitel hücre bariyeri parçalanması ve artan geçirgenlik¹⁰ ile birlikte sıkı bağlantı proteinlerinin azaldığını gösterir. Ayrıca, LY'nin medyaya eklendiği ve LY'nin lümen^11'e alımı için bireysel enteroidlerin görüntülendiği 3D BO enteroid modellerinde de tanımlanmıştır. Bu, LY alımının görselleştirilmesi yoluyla nitel analize izin vermesine rağmen, nicel analiz sınırlıdır. Bu protokol, AO enteroidlerinde in vitro NEC enteroid modeli kullanarak parasellüler geçirgenliği değerlendirmek için LY kullanan ve 3D oryantasyonunu koruyan benzersiz bir tekniği özetlemektedir. Bu yöntem, geçirgenliğin hem kalitatif hem de nicel analizi için kullanılabilir.

Protokol

Bu araştırma, Oklahoma Üniversitesi'nde Kurumsal İnceleme Kurulu onayına (IRB, #11610, 11611) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. IRB spesifikasyonlarına göre insan cerrahi örneklerini toplamadan önce ebeveyn onayı gerekiyordu. IRB onayı ve ebeveyn onayını takiben, NEC veya ostomi alımı veya atrezi onarımı gibi diğer bağırsak rezeksiyonu için ameliyat geçiren bebeklerden (düzeltilmiş gebelik yaşı (GA), hepsi 25-34 haftalık, tahmini GA'da erken doğum öyküsü olan, 2: 1 M: F olan) insan ince bağırsak dokusu elde edildi. Enteroidler jejunum veya ileumdan elde edilen dokudan üretildi.

1. İnsan bebek kaynaklı enteroid kültürler: tüm dokudan kript izolasyonu ve kaplama

1. Önceki rapor^4'ü takiben kültür medyası, şelatlama arabelleği #1 ve şelatlama arabelleği #2 (Tablo 1) hazırlayın. Şelatlama tamponlarını 4 °C'de saklayın ve 48 saat içinde kullanın.
2. İnsan minigut medyasını hazırlayın (Tablo 1). Stoğu -20 ° C'de saklayın ve kullanmadan önce 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın.
3. %50 L-WRN şartlandırılmış ortam (CM) hazırlayın (Tablo 1). Stoğu 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
   NOT: Şartlandırılmış ortam için% 100 L-WRN tabanı, Miyoshi ve ^ark.12 tarafından bir protokolde tanımlanmıştır.
4. Bir önceki rapor^4'ü takiben cerrahi örneklerden elde edilen ince bağırsak dokusu örneklerinden enteroidler üretin. 0.75-2.5 g'lık bir bağırsak dokusundan 24 delikli bir plakada dört kuyucuk enteroid plakası.
   NOT: Enteroidler, 30 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamında, 4 ° C'de 50 mL'lik bir konik tüpte 48 saate kadar saklanan dokudan başarıyla üretilebilir.
5. BMM kubbelerinin polimerizasyonuna izin vermek için 24 kuyucuklu plakayı 37 °C, %5 CO₂ inkübatöre 15-20 dakika baş aşağı yerleştirin⁴.
6. Her bir kuyucuğa 0.5 μL Y-27632, ROCK inhibitörü (RI, Malzeme Tablosuna bakınız) ile 500 μL% 50 L-WRN CM (adım 1.3'te açıklandığı gibi) ekleyin. 2-3 gün sonra, RI olmadan% 50 L-WRN CM ile değiştirin.

2. AO enteroidlerinin üretimi

1. BMM'ye gömülü enteroidleri% 50 L-WRN CM⁴ ile 7-10 gün boyunca büyütün.
2. Ortamı çıkarın ve bir kutucuğa 500 μL hücre kurtarma çözeltisi (CRS , bkz. Kubbeyi kazıyın, pipeti birkaç kez yukarı ve aşağı kazıyın, ardından CRS / enteroid / BMM çözeltisini bir sonraki kuyucuğa ekleyin.
3. Kubbeyi kazıyın, pipeti birkaç kez yukarı ve aşağı kazıyın ve çözeltiyi bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. İkinci kutucuğa 500 μL CRS ekleyin, yukarı ve aşağı pipet verin, ardından ilk oyuğa ekleyin. Bu çözeltiyi aynı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
4. Adım 2.3'ü tekrarlayın, tüm kuyu içeriği CRS'de olana kadar iki kuyuyu bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
   NOT: İkiden fazla kuyu, büyük miktarlarda AO enteroidleri üretiyorsa, daha büyük bir 15 mL konik tüp içinde toplanabilir. Kuyu başına 500 μL CRS oranının korunması, BMM'nin tam çözünürlüğünü sağlamak için önemlidir.
5. BMM'yi çözündürmek için mikrosantrifüj tüplerini (adım 2.3) havuzlanmış CRS / enteroid / BMM çözeltisi ile 4 ° C'de 1 saat boyunca bir rotatör üzerine yerleştirin.
6. Çözeltiyi 4 ° C'de 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin, ardından süpernatantı bir mikropipetle çıkarın ve peleti geride bırakın.
7. Enteroid peleti, mikrosantrifüj tüpü başına% 50 L-WRN CM'lik 1 mL'de (adım 1.3'te hazırlandığı gibi) yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan enteroid/ortam çözeltisinin 500 μL'sini ultra düşük ataşmanlı 24 delikli doku kültürü plakalarının her bir kuyucuğuna nazikçe pipetleyin (bkz.
8. Denemeden önceki 3 gün boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C'de inkübe edin.

3. AO enteroid konformasyonunun tam montajlı immünofloresan boyama ile doğrulanması

1. Enteroidlerin 3 gün boyunca ortam süspansiyonunda inkübasyonunu takiben, enteroid / medya süspansiyonunu bir kuyucuktan bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
2. Enteroid/ortam süspansiyonunu 200 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı bir mikropipetle çıkarın.
3. Enteroidleri 20 μL BMM'de yeniden askıya alın. Pipet 10 μL enteroid süspansiyonu mikroskop üzerine kaydırır ve yaklaşık 1 cm x 1 cm kare ince bir tabaka halinde yayar. Kalan 10 μL enteroid süspansiyonu ile aynı slaytın ayrı bir bölümünde tekrarlayın, böylece iki enteroid / BMM süspansiyonu lekesi olur.
4. Enteroid/BMM yaymalarının oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca katılaşmasına izin verin.
5. Duman davlumbazında çalışırken, sürgüyü bir boyama kavanozuna yerleştirin ve enteroid / BMM yaymasını örtene kadar% 4 paraformaldehit ile doldurun (10 slayt kapasiteli bir cam vitray kavanoz kullanılıyorsa bir slayt için ~ 30 mL). Fiksasyonun gerçekleşmesi için 30 dakika (oda sıcaklığında) bekleyin.
   DİKKAT: %4 paraformaldehit tehlikelidir ve göz hasarına/tahrişine, cilt tahrişine ve kansere neden olabilir. Kullanırken daima bir duman başlığı altında çalışın. Kullanırken koruyucu eldiven ve kişisel koruyucu ekipman giyin. Onaylı bir atık imha kabına atın.
6. % 4 paraformaldehiti uygun bir atık kabına atın. Boyama kavanozuna veya PBS enteroid/BMM yaymalarını kaplayana kadar 30 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. RT'de 3 dakika bekletin ve ardından PBS'yi paraformaldehit atık şişesine atın. Toplam üç yıkama için bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
7. PBS'de seyreltilmiş 30 mL'lik %0,5 Triton X-100 ile yeni bir boyama kavanozunu doldurun. Enteroid/BMM yaymalı slaytı Triton çözeltisine yerleştirin ve RT'de 20 dakika geçirgenleşmesine izin verin.
8. PBS'de seyreltilmiş %0,5 Triton X-100'ü atın. Boyama kavanozuna 30 mL PBS ekleyin ve 3 dakika bekletin. PBS'yi dekantasyon yaparak atın.
9. Enteroid / BMM yaymalarının etrafındaki slaytı nazikçe silin, onları bozmamaya dikkat edin. Hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak (bariyerli PAP kalemi, bakınız Malzeme Tablosu), enteroid/BMM yaymalarının her birinin etrafına bir daire çizin. Sekonder antikorun yükseldiği hayvana özgü% 20'lik bir serum yapın (bakınız Malzeme Tablosu).
10. Mikroskop slaytını laboratuvar tezgahına düz bir şekilde yerleştirin. Hidrofobik bariyer kalemi tarafından halkalanan enteroid/BMM yaymalarının her birine adım 3.9'dan itibaren 100 μL spesifik %20 serum pipetleyerek slaytı 4 °C'de 1 saat boyunca bloke edin.
11. PBS'de seyreltilmiş sırasıyla 1:100 ve 1:200 β-katenin ve ZO-1 primer antikorlarının seyreltilmesiyle 100 μL'lik bir çözelti hazırlayın.
    NOT: Her birincil antikor, görüntülendiklerinde farklı immünofloresan kanallara sahip olmalarını sağlamak için farklı bir hayvandan olmalıdır. Bu çalışmada bir fare β-katenin antikoru ve bir tavşan ZO-1 antikoru kullanılmaktadır (bakınız Malzeme Tablosu).
12. % 20 serumu çıkarmak için tezgahın üzerindeki slayda dokunun ve enteroid / BMM yaymalarını bozmamaya dikkat ederek yavaşça kurulayın. Enteroid/BMM yaymalarından birine 100 μL β-katenin/ZO-1 primer antikor solüsyonu pipeti. Pipet, primer antikor olmaksızın 100 μL PBS'yi negatif kontrol olarak diğer enteroid/BMM üzerine smear eder.
13. Nemlendirilmiş bir kap oluşturmak için plastik bir kabın tabanını ıslak bir kağıt havluyla hizalayın. Sürgüyü kabın içine yerleştirin, enteroid/BMM yaymalarını kaplayan çözeltileri bozmamaya dikkat edin. Kapağı kapatmak için kabın üzerine yerleştirin ve gece boyunca 4 ° C'de düz bir şekilde saklayın.
    NOT: Kızağın kurumasına izin vermeyin. Kurulaşmayı önlemek için kabın kapalı olduğundan emin olun.
14. Devam etmeye hazır olduktan sonra, enteroid / BMM yaymalarından birincil antikorları ve PBS'yi çıkarmak için sayaç üzerindeki slayta dokunun.
15. Slaytı bir boyama kavanozuna yerleştirip 30 mL PBS ile doldurarak veya PBS enteroid/BMM yaymalarını kaplayana kadar bir yıkama adımı uygulayın. Oda sıcaklığında 3 dakika bekletin. PBS'yi atın ve toplam üç yıkama için bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
16. İki farklı immünofloresan kanal için 200 μL sekonder antikor hazırlayın, her antikor PBS'de 1:1000 seyreltmeye sahiptir (bkz. Çözümü ışıktan uzak tutun.
17. Enteroid/BMM yaymalarının her birine 100 μL sekonder antikor çözeltisi pipetin. Karanlıkta yerleştirin ve RT'de 1 saat bekletin.
18. İkincil antikorları çıkarmak için sayaç üzerindeki slayta dokunun. Adım 3.15'te belirtilen yıkama adımlarını tekrarlayın ve tüm yıkamaların karanlıkta yapıldığından emin olun.
19. Enteroid/BMM yaymalarının her birine 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI'li Floroshield, Malzeme Tablosuna bakınız) montaj ortamı damlatın ve her iki lekenin de yeterince örtülmesini sağlamak için bir örtü slip uygulayın. Kabarcıkları kapak kapağının altına hapsetmekten kaçının. Mikroskop altında görüntülemeye hazır olana kadar slaytı karanlıkta tutun.
    NOT: Slaytların anında görüntülenmesi en uygun sonuçları verir; Bununla birlikte, slaytlar 4 ° C'de nemlendirilmiş bir kapta düz bir şekilde saklanabilir ve DAPI'nin eklenmesinden sonra 1 haftaya kadar görüntülenebilir.

4. Deneysel NEC'nin indüksiyonu

1. AO enteroidlerinin kullanımdan önce en az 72 saat boyunca süspansiyonda olduğundan emin olun.
2. Her bir kuyucuktan gelen tüm enteroid/ortam süspansiyonunu nazikçe bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
   NOT: Çok sayıda kuyu işlendiğinde birden fazla kuyu 15 mL'lik bir konik tüp halinde toplanabilir. Bu protokol için tedavi grubu başına en az üç kuyu önerilir.
3. RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
4. Kuyucuk başına 500 μL %50 LWRN CM'ye 10 μL 5 mg/mL lipopolisakkarit (LPS, bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin (son konsantrasyon 100 μg/mL LPS).
5. Tedavi grubu olarak belirlenen AO enteroidleri% 50 LWRN + LPS ve aliquot 500 μL süspansiyonda 24 kuyucuklu ultra düşük bir bağlantı plakasına yeniden askıya alın. Tedavi edilmemiş kontroller olarak belirlenen AO enteroidlerini, kuyu başına% 50 LWRN CM'nin 500 μL'sinde yeniden askıya alın. Bu süspansiyonun Aliquot 500 μL'si ayrı bir 24 kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasına.
6. LPS ile muamele edilmiş AO enteroidlerinde, üreticinin talimatlarına göre% 1_O2,% 5 CO 2 ve% 94_{N 2} ile modüler bir inkübatör odası (MIC) aracılığıyla hipoksi indükleyin (bkz. Enteroidleri 24 saat boyunca hipoksi ve LPS ile tedavi edin.
7. Tedavi edilmemiş ve LPS + hipoksi ile tedavi edilmiş kültürleri, hala MIC odasında, 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO₂ inkübatöre yerleştirin.

5. LY kullanılarak parasellüler geçirgenliğin ölçülmesi

1. Her bir kuyucuktan enteroid/ortam süspansiyonunu nazikçe bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. 37 °C su banyosunda sıcak DPBS ve %50 LRWN CM.
2. Enteroid/ortam süspansiyonunu RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
3. Medyayı kaldırın. Enteroidleri ılık 500 μL DPBS ile yıkayın.
4. RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Süpernatantı bir mikropipetle çıkarın.
5. 5.3-5.4 arasındaki adımları toplam iki kez olmak üzere bir kez daha yineleyin.
6. Yıkadıktan sonra, 450 μL sıcak% 50 LWRN CM ekleyin (adım 1.3'te hazırlandığı gibi).
7. Her bir oyuğa 50 μL 2.5 mg / mL LY (son konsantrasyon 0.25 μg / μL'dir, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve karıştırmak için yavaşça döndürün. 37 °C, %5 CO 2 inkübatöre₂ saat bekletin.
8. Her bir kuyucuktan enteroid/ortam süspansiyonunu nazikçe bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
9. RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın, ardından enteroid peleti geride bırakarak süpernatanı çıkarın.
10. Enteroidleri 500 μL ılık DPBS ile yıkayın.
11. RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın, ardından enteroid peleti geride bırakarak süpernatantı çıkarın.
12. Toplam dört yıkama için 5.10-5.11 arasındaki adımları üç kez daha yineleyin.
13. Her peleti 1.000 μL soğuk DPBS ile yeniden askıya alın ve enteroidleri ayırmak için pipeti kuvvetli bir şekilde yukarı ve aşağı doğru kuvvetlice uygulayın.
14. DPBS cinsinden seyreltilmiş LY standart eğrisi için standartlar hazırlayın (100 ng / mL; 50 ng / mL; 25 ng / mL; 12.5 ng / mL; 6.25 ng / mL; 3.13 ng / mL; 1.57 ng / mL; 0 ng / mL).
15. Pipet, 96 delikli bir plaka üzerinde üçlü olarak kuyucuk başına her numunenin 150 μL'si.
16. Floresansı okuyabilen bir plaka okuyucuda 428 nm'lik bir uyarma zirvesinde ve 536 nm'lik bir emisyon zirvesinde floresanı ölçün (bkz. İstatistiksel yazılım kullanarak (bakınız Malzeme Tablosu), standart eğriyi enterpolasyon yaparak ve dört parametreli bir eğri kullanarak konsantrasyonları hesaplayın.

Sonuçlar

AO konformasyonu
72 saat boyunca %50 LWRN ortamında asılı kalan enteroidler AO konformasyonu varsayar (Şekil 1). Bu, apikal proteinin enteroid bütün montajları, zonula oklüdens-1 (ZO-1) ve bazolateral protein, β-katenin (Şekil 1) kullanılarak immünofloresan boyama ile doğrulandı. AO enteroidleri, enteroidin dış, apikal yüzeyinde ZO-1 (yeşil) gösterirken, β-katenin (kırmızı) iç, bazolateral yüzeydedir (

Tartışmalar

Bağırsak geçirgenliği karmaşıktır ve epitel bariyer fonksiyonunu yansıtır. Bağırsak bariyeri, transsellüler ve parasellüler transporta aracılık eden tek bir epitel hücresi tabakasından oluşur¹⁴. Parasellüler geçirgenlik, epitel hücreleri arasındaki boşluğu kapatan sıkı bağlantı proteinlerine dayanır¹⁴. Bu parasellüler taşıma içinde, moleküllerin geçebileceği üç ayrı yol vardır: gözenek, sızıntı ve sınırsız¹⁵

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
[leu] 15-gastrin 1	Millipore Sigma	G9145-.1MG
100 µm sterile cell strainer	Corning	431752
100% LWRN conditioned media	Made in-house following Miyoshi et al.12
24-well tissue culture plate	Corning	3526
96-well black, clear bottom plate	Greiner Bio-One	655090
A-83-01	R&D Systems	2939/10
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11032
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200	Cell Signaling	#D6L1E
Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100	Cell Signaling	#14-2567-82
B-27 supplement minus Vitamin A	Thermo Fisher Scientific	17504-044
Barrier PAP pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
BMM (Matrigel)	Corning	CB-40230C
Cell Recovery Solution	Corning	354270
Dissecting scissors
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11-965-118
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	11320-082
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14-190-144
Epidermal Growth Factor (EGF)	Millipore Sigma	GF144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	EDS-500G
EVOS m7000 Imaging system	Invitrogen	AMF7000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-525
Fluoroshield with DAPI	Millipore Sigma	F6057-20mL
Forceps
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15-750-060
Glass coverslips
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061
GraphPad Prism 9	Dotmatics
Insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Lipopolysaccharide (LPS)	Millipore Sigma	L2630-25MG
Lucifer Yellow CH, Lithium Salt	Invitrogen	L453
Modular incubator chamber	Billups Rothenberg Inc.	MIC101
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)	Thermo Fisher Scientific	15630-080
N-Acetylcysteine	Millipore Sigma	A9165-5G
Nicotinamide	Millipore Sigma	N0636-100G
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-148
Refrigerated swinging bucket centrifuge
Refrigerated tabletop microcentrifuge
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
SB202190	Millipore Sigma	S7067-5MG
SpectraMax iD3 microplate reader	Molecular devices
Tube Revolver Rotator	ThermoFisher Scientific	88881001
Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate	Corning	3473
Y-27632, ROCK inhibitor (RI)	Tocris	1254