Determinazione della permeabilità intestinale utilizzando Lucifer Yellow in un modello enteroide apical-out

Riepilogo

Il presente protocollo delinea un metodo che utilizza il giallo lucifero in un modello enteroide apical-out per determinare la permeabilità intestinale. Questo metodo può essere utilizzato per determinare la permeabilità paracellulare negli enteroidi che modellano le malattie infiammatorie intestinali come l'enterocolite necrotizzante.

Abstract

Gli enteroidi sono uno strumento di ricerca emergente nello studio delle malattie infiammatorie intestinali come l'enterocolite necrotizzante (NEC). Sono tradizionalmente coltivati nella conformazione basolaterale-out (BO), dove la superficie apicale della cellula epiteliale è rivolta verso il lume interno. In questo modello, l'accesso alla superficie luminale degli enteroidi per il trattamento e la sperimentazione è impegnativo, il che limita la capacità di studiare le interazioni ospite-patogeno. Per aggirare questo, è stato creato un modello apical-out (AO) neonatale per l'enterocolite necrotizzante. Poiché i cambiamenti di permeabilità delle cellule epiteliali intestinali sono patognomonici per NEC, questo protocollo delinea l'uso del giallo lucifero (LY) come marker di permeabilità paracellulare. LY attraversa la barriera epiteliale intestinale attraverso tutte e tre le principali vie paracellulari: poro, perdita e senza restrizioni. L'utilizzo di LY in un modello AO consente uno studio più ampio della permeabilità in NEC. Dopo l'approvazione dell'IRB e il consenso dei genitori, sono stati raccolti campioni chirurgici di tessuto intestinale da neonati pretermine umani. Le cellule staminali intestinali sono state raccolte tramite isolamento della cripta e utilizzate per far crescere enteroidi. Gli enteroidi sono stati coltivati fino alla maturità e poi trasformati AO o lasciati in conformazione BO. Questi non sono stati trattati (controllo) o sono stati trattati con lipopolisaccaride (LPS) e sottoposti a condizioni ipossiche per l'induzione di NEC in vitro . LY è stato utilizzato per valutare la permeabilità. La colorazione immunofluorescente della proteina apicale zonula occludens-1 e della proteina basolaterale β-catenina ha confermato la conformazione AO. Sia gli enteroidi AO che BO trattati con LPS e ipossia hanno dimostrato un aumento significativo della permeabilità paracellulare rispetto ai controlli. Entrambi gli enteroidi AO e BO hanno mostrato un maggiore assorbimento di LY nel lume degli enteroidi trattati rispetto ai controlli. L'utilizzo di LY in un modello enteroide AO consente lo studio di tutte e tre le principali vie di permeabilità paracellulare. Consente inoltre lo studio delle interazioni ospite-patogeno e di come ciò possa influenzare la permeabilità rispetto al modello enteroide BO.

Introduzione

Gli enteroidi sono strutture tridimensionali (3D) derivate da cellule staminali intestinali umane limitate all'organo ^1,2. Sono costituiti interamente da linee epiteliali e contengono tutti i tipi di cellule epiteliali intestinali differenziate². Gli enteroidi mantengono anche la polarità cellulare costituita da una superficie luminale apicale che forma un compartimento interno e una superficie basolaterale rivolta verso il mezzo circostante. Gli enteroidi sono un modello unico in quanto preservano le caratteristiche dell'ospite da cui sono stati generati³. Pertanto, gli enteroidi generati da neonati umani prematuri rappresentano un modello utile per studiare le malattie che colpiscono principalmente questa popolazione, come l'enterocolite necrotizzante (NEC).

Il modello enteroide tradizionale viene coltivato in una conformazione basolaterale-out (BO), dove l'enteroide è racchiuso in una cupola di matrice di membrana basale (BMM). BMM induce l'enteroide a mantenere una struttura 3D con la superficie basolaterale all'esterno. Gli enteroidi BO sono un modello adatto per NEC che colma il divario tra le linee cellulari umane primarie bidimensionali (2D) e i modelli animali in vivo ^2,4. NEC è indotta negli enteroidi inserendo agenti patogeni come LPS o batteri nei mezzi che circondano gli enteroidi, seguita dall'esposizione a condizioni ipossiche ^2,3. La sfida con il modello NEC enteroide BO è che non consente lo studio efficace delle interazioni ospite-patogeno, che si verificano sulla superficie apicale in vivo. I cambiamenti nella permeabilità intestinale sono dovuti a queste interazioni ospite-patogeno. Per comprendere meglio come la permeabilità influisce sulle basi fisiopatologiche della malattia, è necessario creare un modello che preveda il trattamento della superficie apicale.

Co et al. sono stati i primi a dimostrare che gli enteroidi BO maturi possono essere indotti a formare una conformazione apical-out (AO) rimuovendo le cupole BMM e risospendendole in media⁵. Questo articolo ha dimostrato che gli enteroidi AO mantenevano la corretta polarità epiteliale, contenevano tutti i tipi di cellule intestinali, sostenevano la barriera epiteliale intestinale e consentivano l'accesso alla superficie apicale⁵. L'utilizzo di enteroidi AO come modello NEC consente di ottenere una riproduzione fisiologica del processo patologico e lo studio delle interazioni ospite-patogeno.

Uno dei principali contributi alla fisiopatologia della NEC è l'aumento della permeabilità intestinale⁶. Diverse molecole sono state proposte come un modo per testare la permeabilità intestinale in vitro⁷. Tra questi, il giallo lucifero (LY) è un colorante idrofilo con picchi di eccitazione ed emissione a 428 nm e 540 nm, rispettivamente⁸. Mentre attraversa tutte le principali vie paracellulari, è stato utilizzato per valutare la permeabilità paracellulare in varie applicazioni, tra cui le barriere epiteliali emato-encefaliche e intestinali ^8,9. L'applicazione tradizionale di LY utilizza cellule coltivate in monostrati su una superficie semipermeabile¹⁰. LY viene applicato sulla superficie apicale e attraversa attraverso proteine paracellulari a giunzione stretta per riunirsi sul lato basolaterale. Concentrazioni più elevate di LY nel compartimento basolaterale indicano una diminuzione delle proteine a giunzione stretta con conseguente rottura della barriera cellulare epiteliale intestinale e aumento della permeabilità¹⁰. È stato anche descritto in modelli enteroidi BO 3D in cui LY è stato aggiunto al supporto e singoli enteroidi sono stati ripresi per l'assorbimento di LY nel lume¹¹. Sebbene ciò consenta l'analisi qualitativa tramite la visualizzazione dell'assorbimento di LY, l'analisi quantitativa è limitata. Questo protocollo delinea una tecnica unica che utilizza LY per valutare la permeabilità paracellulare utilizzando un modello enteroide NEC in vitro in enteroidi AO mantenendo l'orientamento 3D. Questo metodo può essere utilizzato per l'analisi sia qualitativa che quantitativa della permeabilità.

Protocollo

La presente ricerca è stata eseguita in conformità con l'approvazione dell'Institutional Review Board (IRB, # 11610, 11611) presso l'Università dell'Oklahoma. Il consenso dei genitori era richiesto prima di raccogliere campioni chirurgici umani secondo le specifiche IRB. A seguito dell'approvazione dell'IRB e del consenso dei genitori, il tessuto intestinale tenue umano è stato ottenuto da neonati (età gestazionale corretta (GA) compresa tra 36 e 41 settimane al momento della raccolta del campione, tutti con una storia di parto pretermine a un GA stimato di 25-34 settimane, 2: 1 M: F) sottoposti a intervento chirurgico per NEC o altra resezione intestinale, come la rimozione della stomia o la riparazione dell'atresia. Gli enteroidi sono stati generati da tessuto ottenuto dal digiuno o dall'ileo.

1. Colture enteroidi di derivazione infantile umana: isolamento della cripta e placcatura da tessuto intero

1. Preparare terreni di coltura, tampone chelante #1 e tampone chelante #2 (Tabella 1) seguendo il rapporto precedente⁴. Conservare i tamponi chelanti a 4 °C e utilizzarli entro 48 ore.
2. Preparare i terreni minigut umani (Tabella 1). Conservare il brodo a -20 °C e riscaldarlo a bagnomaria a 37 °C prima dell'uso.
3. Preparare il 50% di mezzi condizionati con L-WRN (CM) (Tabella 1). Conservare il brodo a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
   NOTA: La base L-WRN al 100% per i mezzi condizionati è descritta in un protocollo di Miyoshi et ^al.12.
4. Generare enteroidi da piccoli campioni di tessuto intestinale ottenuti da campioni chirurgici seguendo il precedente rapporto⁴. Piastra quattro pozzetti di enteroidi in una piastra a 24 pozzetti da un pezzo di tessuto intestinale da 0,75-2,5 g.
   NOTA: Gli enteroidi possono essere generati con successo dal tessuto immagazzinato in 30 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 terreno in un tubo conico da 50 mL a 4 °C per un massimo di 48 ore.
5. Posizionare la piastra a 24 pozzetti in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ capovolto per 15-20 minuti per consentire la polimerizzazione delle cupole BMM⁴.
6. Aggiungere 500 μL di 50% di L-WRN CM (come descritto al punto 1.3) con 0,5 μL di Y-27632, inibitore di ROCK (RI, vedere Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto. Dopo 2-3 giorni, sostituire con il 50% L-WRN CM senza RI.

2. Generazione di enteroidi AO

1. Coltiva enteroidi incorporati in BMM per 7-10 giorni con il 50% di L-WRN CM⁴.
2. Rimuovere il supporto e aggiungere 500 μL di soluzione di recupero cellulare (CRS, vedere Tabella dei materiali) in un pozzetto. Raschiare la cupola, pipettare su e giù più volte, quindi aggiungere la soluzione CRS / enteroide / BMM al pozzetto successivo.
3. Raschiare la cupola, pipettare su e giù più volte e posizionare la soluzione in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 500 μL di CRS al secondo pozzetto, pipettare su e giù, quindi aggiungerlo al primo pozzetto. Trasferire questa soluzione nella stessa provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
4. Ripetere il passaggio 2.3, raggruppando due pozzetti in un tubo di microcentrifuga fino a quando tutto il contenuto del pozzetto è in CRS.
   NOTA: Più di due pozzetti possono essere raggruppati in un tubo conico più grande da 15 mL se si generano grandi volumi di enteroidi AO. Mantenere un rapporto CRS per pozzo di 500 μL è importante per garantire la completa solubilizzazione del BMM.
5. Porre le provette della microcentrifuga (fase 2.3) con soluzione CRS/enteroide/BMM aggregata su un rotatore per 1 ora a 4 °C per solubilizzare il BMM.
6. Centrifugare la soluzione a 200 x g per 3 minuti a 4°C, quindi rimuovere il surnatante con una micropipetta, lasciando il pellet.
7. Risospendere il pellet enteroide in 1 mL di 50% L-WRN CM (come preparato al punto 1.3) per provetta da microcentrifuga. Pipettare delicatamente 500 μL della soluzione enteroide/media risospesa in ciascun pozzetto delle piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti a bassissimo attacco (vedere Tabella dei materiali).
8. Incubare a 37 °C con 5% di CO₂ per 3 giorni prima della sperimentazione.

3. Verifica della conformazione enteroide di AO mediante colorazione immunofluorescente a montaggio intero

1. Dopo l'incubazione degli enteroidi in sospensione di mezzo per 3 giorni, pipettare la sospensione enteroide/media da un pozzetto in una provetta per microcentrifuga.
2. Centrifugare la sospensione enteroide/media a 200 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante con una micropipetta.
3. Risospendere gli enteroidi in 20 μL di BMM. Pipettare 10 μL di sospensione enteroide su un vetrino da microscopio e stenderlo in uno strato sottile di circa 1 cm per 1 cm quadrato. Ripetere con i restanti 10 μL di sospensione enteroide su una parte separata dello stesso vetrino in modo che ci siano due strisci di sospensione enteroide / BMM.
4. Lasciare che gli strisci enteroidi / BMM si solidifichino a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti.
5. Lavorando nella cappa aspirante, posizionare il vetrino in un barattolo colorante e riempire con paraformaldeide al 4% fino a coprire lo striscio enteroide / BMM (~ 30 ml per un vetrino se si utilizza un barattolo di colorazione di vetro con capacità di 10 vetrini). Lasciare 30 minuti (a temperatura ambiente) per la fissazione.
   ATTENZIONE: la paraformaldeide al 4% è pericolosa e può causare danni agli occhi / irritazione, irritazione della pelle e cancro. Lavorare sempre sotto una cappa aspirante quando lo si utilizza. Indossare guanti protettivi e dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione. Smaltirlo in un contenitore approvato per lo smaltimento dei rifiuti.
6. Gettare il 4% di paraformaldeide in un contenitore per rifiuti appropriato. Aggiungere 30 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) al barattolo colorante o fino a quando PBS copre gli strisci enteroidi / BMM. Lasciare riposare per 3 minuti a RT, quindi scartare il PBS nella bottiglia di scarto della paraformaldeide. Ripetere questo passaggio altre due volte per un totale di tre lavaggi.
7. Riempire un nuovo barattolo di colorazione con 30 ml di Triton X-100 allo 0,5% diluito in PBS. Posizionare il vetrino con strisci enteroidi / BMM nella soluzione Triton e lasciarlo permeabilizzare per 20 minuti a RT.
8. Scartare il Triton X-100 allo 0,5% diluito in PBS. Aggiungere 30 ml di PBS al barattolo colorante e lasciare riposare per 3 minuti. Scartare il PBS decantando.
9. Pulire delicatamente il vetrino attorno agli strisci enteroidi / BMM, facendo attenzione a non interromperli. Utilizzando una penna barriera idrofobica (penna barriera PAP, vedere Tabella dei materiali), disegnare un cerchio attorno a ciascuno degli strisci enteroidi / BMM. Fare un siero al 20%, specifico per l'animale in cui è stato allevato l'anticorpo secondario (vedi Tabella dei materiali).
10. Appoggiare il vetrino del microscopio sul banco da laboratorio. Bloccare il vetrino per 1 ora a 4 °C pipettando 100 μL di siero specifico al 20% dal punto 3.9 su ciascuno degli strisci enteroidi/BMM circondati dalla penna barriera idrofobica.
11. Preparare una soluzione da 100 μL con diluizioni 1:100 e 1:200 di anticorpi primari β-catenina e ZO-1, rispettivamente, diluiti in PBS.
    NOTA: Ogni anticorpo primario deve provenire da un animale diverso per garantire che abbiano canali immunofluorescenti distinti quando vengono sottoposti a ripresa. Il presente studio utilizza un anticorpo β-catenina di topo e un anticorpo ZO-1 di coniglio (vedi Tabella dei materiali).
12. Picchiettare il vetrino sul bancone per rimuovere il siero al 20% e asciugare delicatamente, facendo attenzione a non interrompere gli strisci enteroidi / BMM. Pipettare 100 μL di soluzione anticorpale primaria di β-catenina/ZO-1 su uno degli strisci enteroid/BMM. Pipettare 100 μL di PBS senza anticorpi primari sull'altro striscio enteroide/BMM come controllo negativo.
13. Foderare il fondo di un contenitore di plastica con un tovagliolo di carta bagnato per creare un contenitore umidificato. Posizionare il vetrino nel contenitore, facendo attenzione a non interrompere le soluzioni che coprono gli strisci enteroidi / BMM. Posizionare il coperchio sul contenitore per sigillare e conservare in piano a 4 °C per una notte.
    NOTA: non lasciare asciugare il vetrino. Assicurarsi che il contenitore sia chiuso per evitare l'essiccazione.
14. Una volta pronto per procedere, toccare il vetrino sul contatore per rimuovere gli anticorpi primari e il PBS dagli strisci enteroidi / BMM.
15. Eseguire una fase di lavaggio posizionando il vetrino in un barattolo colorante e riempiendo con 30 ml di PBS o fino a quando PBS copre gli strisci enteroidi / BMM. Lasciare riposare per 3 minuti a temperatura ambiente. Scartare il PBS e ripetere questo passaggio altre due volte per un totale di tre lavaggi.
16. Preparare 200 μL di anticorpi secondari per due diversi canali immunofluorescenti, con ogni anticorpo con una diluizione 1:1000 in PBS (vedere Tabella dei materiali). Tenere la soluzione al riparo dalla luce.
17. Pipettare 100 μL di soluzione anticorpale secondaria su ciascuno degli strisci enteroidi/BMM. Mettilo al buio e lascialo riposare per 1 ora a RT.
18. Tocca la diapositiva sul contatore per rimuovere gli anticorpi secondari. Ripetere i passaggi di lavaggio descritti al punto 3.15, assicurandosi che tutti i lavaggi vengano eseguiti al buio.
19. Aggiungere una goccia di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (Fluoroshield con DAPI, vedere la tabella dei materiali) mezzo di montaggio a ciascuno degli strisci enteroidi / BMM e applicare un vetrino di copertura per garantire che entrambi gli strisci siano adeguatamente coperti. Evitare di intrappolare le bolle sotto il coprifoglio. Tenere il vetrino al buio fino al momento della visualizzazione al microscopio.
    NOTA: l'imaging immediato delle diapositive produce i risultati ottimali; tuttavia, i vetrini possono essere conservati in un contenitore umidificato a 4 °C e ripresi fino a 1 settimana dopo l'aggiunta di DAPI.

4. Induzione di NEC sperimentali

1. Assicurarsi che gli enteroidi AO siano stati in sospensione per almeno 72 ore prima dell'uso.
2. Pipettare delicatamente tutta la sospensione enteroide / media da ciascun pozzetto in un tubo di microcentrifuga.
   NOTA: più pozzetti possono essere raggruppati in un tubo conico da 15 ml se viene trattato un grande volume di pozzetti. Per questo protocollo si raccomanda un minimo di tre pozzetti per gruppo di trattamento.
3. Centrifugare a 300 x g per 3 minuti a RT e rimuovere il surnatante.
4. Aggiungere 10 μL di 5 mg/ml di lipopolisaccaride (LPS, vedere Tabella dei materiali) a 500 μL di 50% di LWRN CM per pozzetto (concentrazione finale 100 μg/mL LPS).
5. Risospendere gli enteroidi AO designati come gruppo di trattamento in 50% LWRN + LPS e aliquota 500 μL di sospensione su una piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti. Risospendere gli enteroidi AO designati come controlli non trattati in 500 μL di 50% di LWRN CM per pozzetto. Aliquot 500 μL di questa sospensione su una piastra di attacco ultrabassa separata a 24 pozzetti.
6. Indurre ipossia negli enteroidi AO trattati con LPS tramite una camera di incubazione modulare (MIC) con 1% O 2, 5% CO 2 e 94% N ₂ secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Trattare gli enteroidi con ipossia e LPS per 24 ore.
7. Posizionare le colture non trattate e trattate con LPS + ipossia, ancora nella camera MIC, in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ per 24 ore.

5. Misura della permeabilità paracellulare utilizzando LY

1. Pipettare delicatamente la sospensione enteroide/media da ciascun pozzetto in un tubo di microcentrifuga. DPBS caldo e 50% LRWN CM in bagnomaria a 37 °C.
2. Centrifugare la sospensione enteroide/media a 300 x g per 3 minuti a RT.
3. Rimuovere il supporto. Lavare gli enteroidi con DPBS caldo da 500 μL.
4. Centrifugare a 300 x g per 3 minuti a RT. Rimuovere il surnatante con una micropipetta.
5. Ripetere i passaggi 5.3-5.4 ancora una volta per un totale di due volte.
6. Dopo il lavaggio, aggiungere 450 μL di LWRN CM caldo al 50% (come preparato al punto 1.3).
7. Aggiungere 50 μL di 2,5 mg/mL LY (la concentrazione finale è 0,25 μg/μL, vedere la tabella dei materiali) in ciascun pozzetto e ruotare delicatamente per mescolare. Collocare in un incubatore a 37 °C, 5% CO 2 per₂ ore.
8. Pipettare delicatamente la sospensione enteroide/media da ciascun pozzetto in un tubo di microcentrifuga.
9. Centrifugare a 300 x g per 3 minuti a RT, quindi rimuovere il surnatante, lasciando dietro di sé il pellet enteroide.
10. Lavare gli enteroidi con 500 μL di DPBS caldo.
11. Centrifugare a 300 x g per 3 minuti a RT, quindi rimuovere il surnatante lasciando dietro di sé il pellet enteroide.
12. Ripetere i passaggi 5.10-5.11 altre tre volte per un totale di quattro lavaggi.
13. Risospendere ogni pellet con 1.000 μL di DPBS freddo e pipettare vigorosamente su e giù per dissociare gli enteroidi.
14. Preparare gli standard per la curva standard LY diluita in DPBS (100 ng/mL; 50 ng/mL; 25 ng/mL; 12,5 ng/mL; 6,25 ng/mL; 3,13 ng/mL; 1,57 ng/mL; 0 ng/mL).
15. Pipettare 150 μL di ciascun campione per pozzetto in triplice copia su una piastra da 96 pozzetti.
16. Misurare la fluorescenza ad un picco di eccitazione di 428 nm e un picco di emissione di 536 nm su un lettore di piastre in grado di leggere la fluorescenza (vedi Tabella dei materiali). Utilizzando un software statistico (vedi Tabella dei materiali), calcolare le concentrazioni interpolando la curva standard e utilizzando una curva a quattro parametri.

Risultati

Conformazione AO
Gli enteroidi sospesi in mezzi LWRN al 50% per 72 ore assumono una conformazione AO (Figura 1). Ciò è stato confermato tramite colorazione immunofluorescente utilizzando supporti interi enteroidi della proteina apicale, zonula occludens-1 (ZO-1), e della proteina basolaterale, β-catenina (Figura 1). Gli enteroidi AO mostrano ZO-1 (verde) sulla superficie apicale esterna dell'enteroide, mentre la β-catenina (rossa...

Discussione

La permeabilità intestinale è complessa e riflette la funzione della barriera epiteliale. La barriera intestinale comprende un singolo strato di cellule epiteliali che media il trasporto transcellulare e paracellulare¹⁴. La permeabilità paracellulare si basa su proteine a giunzione stretta che sigillano lo spazio tra le cellule epiteliali¹⁴. All'interno di questo trasporto paracellulare, ci sono tre percorsi distinti attraverso i quali le molecole possono attraversarsi: ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
[leu] 15-gastrin 1	Millipore Sigma	G9145-.1MG
100 µm sterile cell strainer	Corning	431752
100% LWRN conditioned media	Made in-house following Miyoshi et al.12
24-well tissue culture plate	Corning	3526
96-well black, clear bottom plate	Greiner Bio-One	655090
A-83-01	R&D Systems	2939/10
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11032
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200	Cell Signaling	#D6L1E
Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100	Cell Signaling	#14-2567-82
B-27 supplement minus Vitamin A	Thermo Fisher Scientific	17504-044
Barrier PAP pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
BMM (Matrigel)	Corning	CB-40230C
Cell Recovery Solution	Corning	354270
Dissecting scissors
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11-965-118
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	11320-082
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14-190-144
Epidermal Growth Factor (EGF)	Millipore Sigma	GF144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	EDS-500G
EVOS m7000 Imaging system	Invitrogen	AMF7000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-525
Fluoroshield with DAPI	Millipore Sigma	F6057-20mL
Forceps
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15-750-060
Glass coverslips
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061
GraphPad Prism 9	Dotmatics
Insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Lipopolysaccharide (LPS)	Millipore Sigma	L2630-25MG
Lucifer Yellow CH, Lithium Salt	Invitrogen	L453
Modular incubator chamber	Billups Rothenberg Inc.	MIC101
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)	Thermo Fisher Scientific	15630-080
N-Acetylcysteine	Millipore Sigma	A9165-5G
Nicotinamide	Millipore Sigma	N0636-100G
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-148
Refrigerated swinging bucket centrifuge
Refrigerated tabletop microcentrifuge
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
SB202190	Millipore Sigma	S7067-5MG
SpectraMax iD3 microplate reader	Molecular devices
Tube Revolver Rotator	ThermoFisher Scientific	88881001
Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate	Corning	3473
Y-27632, ROCK inhibitor (RI)	Tocris	1254