Un insert innovant imprimé en 3D conçu pour permettre des cultures cellulaires 2D et 3D simples

Résumé

Dans cet article, un insert nouvellement conçu imprimé en 3D est présenté comme un modèle de co-culture et validé par l’étude de la communication intercellulaire paracrine entre les cellules endothéliales et les kératinocytes.

Résumé

Les analyses classiques de la communication indirecte entre différents types de cellules nécessitent l’utilisation de milieux conditionnés. De plus, la production de milieux conditionnés reste chronophage et éloignée des conditions physiologiques et pathologiques. Bien que quelques modèles de co-culture soient disponibles dans le commerce, ils restent limités à des tests spécifiques et concernent principalement deux types de cellules.

Ici, on utilise des inserts imprimés en 3D qui sont compatibles avec de nombreux tests fonctionnels. L’insert permet la séparation d’un puits d’une plaque à 6 puits en quatre compartiments. Un large éventail de combinaisons peut être défini. De plus, des fenêtres sont conçues dans chaque paroi des compartiments de manière à ce que la communication intercellulaire potentielle entre chaque compartiment soit possible dans le milieu de culture d’une manière dépendante du volume. Par exemple, la communication intercellulaire paracrine peut être étudiée entre quatre types de cellules en monocouche, en 3D (sphéroïdes), ou en combinant les deux. De plus, un mélange de différents types de cellules peut être ensemencé dans le même compartiment au format 2D ou 3D (organoïdes). L’absence de fond dans les inserts imprimés en 3D permet les conditions de culture habituelles sur la plaque, un éventuel revêtement sur la plaque contenant l’insert, et une visualisation directe par microscopie optique. Les multiples compartiments offrent la possibilité de collecter différents types de cellules indépendamment ou d’utiliser, dans chaque compartiment, différents réactifs pour l’extraction d’ARN ou de protéines. Dans cette étude, une méthodologie détaillée est fournie pour utiliser le nouvel insert imprimé en 3D comme système de co-culture. Pour démontrer plusieurs capacités de ce modèle flexible et simple, des tests fonctionnels de communication cellulaire précédemment publiés ont été effectués dans les nouveaux inserts imprimés en 3D et se sont avérés reproductibles. Les inserts imprimés en 3D et la culture cellulaire conventionnelle à l’aide de milieux conditionnés ont conduit à des résultats similaires. En conclusion, l’insert imprimé en 3D est un dispositif simple qui peut être adapté à de nombreux modèles de co-cultures avec des types de cellules adhérentes.

Introduction

In vivo, les cellules communiquent entre elles soit directement (contact cellulaire), soit indirectement (par sécrétion de molécules). Pour étudier la communication cellulaire, différents modèles de co-culture peuvent être développés, tels que la co-culture directe (les différents types de cellules sont en interaction directe dans le même puits) et la co-culture compartimentée (les différents types de cellules sont en interaction indirecte dans différents compartiments d’un système de culture)¹. De plus, les milieux conditionnés peuvent être utilisés pour les systèmes de co-culture, où l’interaction indirecte est rendue possible par le transfert de molécules sécrétées contenues dans le milieu conditionné d’un type de cellule effectrice à une cellule répondeuse^{de type 1}.

Dans le cas des études de communication cellulaire paracrine, les systèmes de co-culture indirecte fournissent des modèles qui reflètent fortement les interactions cellulaires in vivo. Des systèmes de co-culture indirecte ont été développés et commercialisés, permettant la mise en place de modèles de co-culture indirecte ^2,3. Malheureusement, la plupart des systèmes de co-culture indirecte ne comportent que deux compartiments. D’autres systèmes de co-culture indirecte offrent plusieurs compartiments, mais ils sont moins évolutifs que le système décrit dans le présent manuscrit. Certains d’entre eux ne permettent pas une visualisation classique au microscope, et ils présentent souvent des méthodes d’application spécifiques. Dans plusieurs études, la communication paracrine entre différents types de cellules est sondée par le modèle de milieu conditionné 4,5,6,7. Il s’agit d’une méthode d’investigation plus facile par rapport aux systèmes de co-culture indirects, car elle ne nécessite pas de méthodes ou de matériaux spécifiques pour être établie¹. D’autre part, la préparation des milieux conditionnés prend du temps et ne fournit des informations que sur la signalisation cellulaire unidirectionnelle (effecteur à répondeur)¹.

Dans cet article, une nouvelle façon simple d’étudier la communication cellulaire est proposée. Permettant la combinaison de plusieurs types de cellules en interaction directe ou indirecte et dans des formats 2D ou 3D, les inserts imprimés présentent de nombreux avantages pour mettre en place facilement des modèles de co-culture. Adapté pour être placé dans les puits de plaques de 6 puits, l’insert imprimé en 3D est circulaire et permet de séparer le puits en quatre compartiments (deux grands compartiments et deux petits compartiments ; Graphique 1A). Les inserts imprimés en 3D se caractérisent par l’absence de fond. Ainsi, les cellules sont en contact direct avec la plaque sur laquelle l’insert est placé. De plus, chaque compartiment peut être revêtu indépendamment des autres. De plus, le comportement des cellules peut être facilement suivi au microscope optique. La présence de fenêtres de communication dans chaque paroi de l’insert permet l’ajout, au moment optimal, d’un support commun pour réaliser différentes expériences de co-culture. De nombreuses combinaisons de co-culture peuvent être réalisées pour étudier la communication directe et/ou indirecte entre plusieurs types de cellules. Par exemple, un modèle de co-culture indirecte entre quatre types de cellules différentes en monocouche et/ou en 3D (sphéroïdes) peut être conçu. Une combinaison de modèles de co-culture directe et indirecte peut également être réalisée en mélangeant différents types de cellules dans le même compartiment. L’effet de structures complexes (organoïdes, explants de tissus, etc.) sur différents types de cellules pourrait être un autre exemple de modèles qui peuvent être réalisés. De plus, les inserts imprimés en 3D sont compatibles avec les tests fonctionnels de biologie cellulaire (prolifération, migration, formation de pseudotubes, différenciation, etc.) et avec les tests de biochimie (extraction d’ADN, d’ARN, de protéines, de lipides, etc.). Enfin, les inserts imprimés en 3D offrent un large éventail de schémas expérimentaux de modèles de co-culture avec la possibilité de combiner simultanément différents tests dans la même expérience dans les différents compartiments.

Certaines capacités des inserts imprimés en 3D sont présentées pour les valider en tant que modèle de co-culture rapide et facile à utiliser. Par rapport à une étude précédemment publiée sur la communication des cellules paracrines, la capacité des inserts imprimés en 3D à être un modèle de co-culture précieux est démontrée. Pour évaluer ce point, la régulation de la prolifération et de la migration des cellules endothéliales par les kératinocytes a été comparée entre le système d’insertion imprimé en 3D et le système classique utilisant des milieux conditionnés. Les inserts imprimés en 3D permettent d’obtenir rapidement des résultats similaires par rapport au système conventionnel utilisant des supports conditionnés. En effet, les inserts imprimés en 3D fournissent un modèle robuste pour étudier les interactions cellulaires dans les deux sens sans avoir besoin de produire des milieux conditionnés et avec la possibilité d’effectuer en parallèle les tests de prolifération et de migration dans la même expérience.

Pour conclure, dans cet article, un nouveau modèle prêt à l’emploi pour étudier la communication cellulaire est proposé. Compatibles avec tous les types de cellules adhérentes, les inserts imprimés en 3D permettent d’effectuer de nombreuses combinaisons de co-culture qui visent à se rapprocher des conditions in vivo .

Protocole

REMARQUE : Les inserts 3D (Figure 1A) sont achetés dans le commerce et sont imprimés à l’aide d’une résine photopolymère biocompatible avec la culture cellulaire et l’autoclavage (voir le tableau des matériaux). Dans cette section, un protocole détaillé pour établir le modèle de co-culture par inserts est décrit (voir la figure 1B). Quelques exemples d’applications sont également fournis.

1. Mise en place de l’insert stérilisé dans les plaques à 6 puits

1. Mélangez les deux composants fournis dans le kit (voir tableau des matériaux), le silicium alimentaire (réactif A) et le catalyseur (réactif B), dans un rapport de 10 :1 (v/v) selon les instructions du fabricant. (Figure 1Ba). Utilisez une spatule stérilisée à l’éthanol à 70 % pour mélanger les deux composants.
   REMARQUE : Le volume du mélange de silicium à préparer dépend du nombre d’inserts à fixer. Un excès de catalyseur peut entraîner une solidification trop rapide du mélange de silicium.
2. Appliquez les inserts sur le mélange de silicone à l’aide d’une pince à épiler de manière à ce que le mélange soit uniformément réparti sur le bord inférieur des inserts (Figure 1Bb). Placez les inserts dans les puits d’une plaque à 6 puits et appliquez une légère pression sur les inserts pour vous assurer que les inserts sont en contact étroit avec la plaque afin d’éviter toute fuite du milieu de culture cellulaire (Figure 1Bc).
3. Placez la plaque à 37 °C pour soutenir le processus de solidification du silicium pendant 1 h.
   REMARQUE : Le temps de solidification dépend de la quantité de catalyseur qui a été ajoutée.
4. Après solidification, stériliser les plaques avec les inserts en les plongeant dans un bain d’éthanol à 70% pendant 30 min à 1 h.
5. Jetez l’alcool par pipetage et laissez sécher la plaque (couvercle ouvert) pendant la nuit dans une hotte de culture cellulaire.
   REMARQUE : L’alcool doit être complètement évaporé avant d’effectuer l’étape suivante pour éviter la fixation cellulaire et la toxicité. La plaque prête à l’emploi contenant les inserts peut être conservée pendant plusieurs jours avant utilisation dans des conditions sèches et stériles à température ambiante.

2. Revêtements tels que la poly-L-lysine ou la poly-HEMA (étape facultative)

REMARQUE : Le revêtement n’est pas effectué dans cette expérience et les étapes sont fournies pour informer sur la possibilité de revêtement des inserts.

1. Préparez la solution de revêtement selon les instructions du fabricant.
2. Considérez un volume de 200 à 400 μL pour les plus grands compartiments et un volume de 50 à 100 μL pour les plus petits compartiments pour le revêtement de l’insert. Ajoutez la solution de revêtement dans les compartiments individuels.
3. Laissez sécher le revêtement comme indiqué par le fabricant dans des conditions stériles.

3. Ensemencement des cellules

1. Cultivez les kératinocytes de la gaine radiculaire externe (KORS) et les cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines (HDMEC) selon les recommandations du fabricant. Préparez la suspension cellulaire une fois que les cellules atteignent la confluence.
   1. Jeter le milieu des flacons et ajouter 5 mL de trypsine pour détacher les cellules (voir le tableau des matériaux).
   2. Placer la fiole contenant le KORS à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 5 min. Incuber le flacon contenant les HDMEC pendant 5 min à température ambiante.
   3. Mélanger la solution de trypsine contenant le KORS avec 5 mL de milieu de cellules souches mésenchymateuses (MSC_M) complété par 5 % de sérum de veau fœtal (FBS) et de facteurs de croissance (milieu basal avec trousse de supplémentation, voir le tableau des matériaux). Mélanger la solution de trypsine contenant les HDMEC avec 5 mL de milieu cellulaire endothélial (EC_M) complété par 5 % de FBS et de facteurs de croissance (voir le tableau des matériaux).
   4. Transférer les cellules dans un tube conique stérile de 15 ml. Centrifuger les suspensions KORS et HDMEC à 200 x g pendant 5 min à température ambiante.
   5. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 2 mL du milieu respectif.
   6. Mélanger 10 μL de la suspension cellulaire avec 10 μL de colorant bleu trypan (voir le tableau des matériaux).
   7. Ajouter 10 μL du mélange dans la chambre de la lame de comptage.
   8. Insérez la lame de comptage dans le système de comptage des cellules (voir le tableau des matériaux) et détectez le numéro de cellule et la viabilité.
   9. Préparez la suspension cellulaire à une concentration de 0,5 x 10⁵ cellules/mL dans le milieu respectif.
      REMARQUE : Si les différents types de cellules nécessitent des temps d’adhérence différents et/ou pour atteindre la confluence idéale, l’ensemencement des cellules peut être effectué à des moments différents selon les types de cellules.
2. Distribuer 800 μL à 1 mL de suspension cellulaire dans les grands compartiments individuels et 100 à 150 μL dans les petits compartiments individuels à l’aide d’une pipette.
   1. Ensemencer le KORS à raison de 1 x 10 5 cellules/mL dans du MSC_M complété par⁵% de FBS et des facteurs de croissance dans l’un des grands compartiments.
   2. Semence HDMEC dans EC_M complétée par 5 % de FBS et de facteurs de croissance à 2,5 x 10³ cellules/mL dans les petits compartiments et à 1,25 x 10⁵ cellules/mL dans l’autre grand compartiment.
      REMARQUE : L’essai de prolifération peut être effectué dans les petits compartiments, et les tests de migration et de viabilité peuvent être effectués dans les grands compartiments. La concentration des cellules ensemencées a été optimisée selon les recommandations du fabricant. Cette concentration permet une bonne viabilité des cellules après 24 à 48 h d’incubation.
3. Placer la plaque de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO₂ ou dans les conditions habituelles pour permettre l’adhésion et/ou la maturation des cellules.
   REMARQUE : Incuber les cellules pendant 24 à 48 h sans changer le milieu. Si nécessaire, le support des compartiments peut être modifié indépendamment.

4. Mise en œuvre de la co-culture (Figure 1Bd)

NOTE : La mise en place de la co-culture correspond au moment où le milieu commun est ajouté. L’ajout d’un milieu unique pour tous les types de cellules dans les différents compartiments offre la possibilité d’une communication paracrine entre les cellules en raison de la présence de fenêtres de communication (trous ovoïdes dans les parois des inserts imprimés en 3D). Pour mettre en œuvre la co-culture, suivez les étapes 4.1 à 4.3.

1. Videz les milieux de culture des différents compartiments des inserts à l’aide d’une pipette. Dans le cas d’une culture de cellules sphéroïdes 3D, jetez le milieu très doucement.
2. Rincez les cellules avec 1 mL de PBS chaud à 37 °C dans les grands compartiments et 200 μL de PBS chaud à 37 °C dans les petits compartiments. Assurez-vous d’un lavage doux pour ne pas détacher les cellules.
3. Ajouter 3 mL d’un milieu commun choisi pour être compatible avec tous les types de cellules.
   NOTA : Dans cette étude, l’EC_{basale M} (sans FBS ni facteurs de croissance) est utilisée. Assurez-vous que le support recouvre tous les compartiments (niveau au-dessus des fenêtres de communication [trous ovoïdes dans les murs], comme illustré à la figure 1A).
4. Placer la plaque contenant les co-cultures à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24 à 48 h.

5. Observation, comptage et grattage des cellules

1. Observer la morphologie et compter le nombre de cellules des différents compartiments pendant l’expérience sous un microscope optique après 24-48 h d’incubation.
   NOTE : Le nombre de cellules attendues dépend des types de cellules utilisées (taille, morphologie, etc.) et de la taille du compartiment. Dans cette expérience, entre 0,5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/mL et entre 0,25 x 10^6-0,75 x 10⁶ HDMECs/mL sont comptés dans les grands compartiments.
2. Détachez les cellules à l’aide de trypsine pour le comptage des suspensions cellulaires.
   REMARQUE : Pour la solution de détachement des cellules, considérez un volume de 100 à 500 μL pour les plus grands compartiments et un volume de 10 à 50 μL pour les plus petits compartiments.
3. Vérifiez la viabilité à l’aide d’une coloration au bleu trypan (voir les étapes 3.1.6 à 3.1.8).

6. Nettoyage des inserts pour le recyclage

1. Retirez les inserts de la plaque à 6 puits à la fin de l’expérience en les tournant légèrement (Figure 1Be).
2. Retirez le silicone des inserts en le tirant. Si nécessaire, utilisez une spatule pour retirer le silicium restant collé aux parois des inserts (Figure 1Bf).
3. Lavez les inserts avec des détergents et des produits de nettoyage conventionnels pour cultures cellulaires (exemple fourni dans le tableau des matériaux).
4. Stériliser les inserts pour une utilisation ultérieure en autoclave (cycle solide, 121 °C pendant 20 min) ou en les immergeant dans un bain d’éthanol à 70% pendant 1 h.
   NOTE : À partir de cette étape, deux exemples de tests possibles (tests de prolifération et de migration) sont décrits à l’aide des inserts imprimés en 3D (Figure 1Bd).

7. Essai de prolifération cellulaire - Essai WST-1

1. Suivez les étapes 1 à 3.1 pour cultiver les cellules.
   REMARQUE : Suivez l’étape décrite dans cette section pour mettre en œuvre le système de co-culture afin d’étudier l’effet du sécrétome KORS sur la prolifération HDMEC. Les cellules KORS sont utilisées pour comparer les données publiées précédemment⁸.
   1. Ensemencer le KORS à raison de 1 x 10 5 cellules/mL dans un milieu de cellules souches mésenchymateuses (MSC_M) complété par⁵ % de FBS et des facteurs de croissance dans les grands compartiments.
   2. Placer la plaque de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24 h.
   3. Ensemencer les HDMECs dans un milieu de cellules endothéliales (EC_M) complété par 5% de FBS et de facteurs de croissance à raison de 2,5 x 10³ cellules/mL dans les petits compartiments.
   4. Placez la plaque de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24 à 48 h.
   5. Éliminer les milieux de tous les compartiments et mettre en œuvre le système de co-culture par l’ajout de 3 mL d’EC_M basale non supplémentée (milieu de culture cellulaire commun à tous les compartiments des inserts imprimés en 3D).
2. Diluer WST-1 dans le milieu de culture cellulaire commun EC_M (dilution finale 1 :10) pour préparer la solution WST-1.
   REMARQUE : Pour le volume de la solution WST-1, préparer au moins 500 μL de solution supplémentaire pour le blanc.
3. Éliminez le milieu de culture cellulaire de l’insert par pipetage.
4. Ajouter la solution WST-1 aux compartiments sélectionnés (150 μL pour les petits compartiments et 600 μL pour les grands compartiments). Placez l’assiette à 37 °C avec 5 % de CO₂.
5. Après le temps d’incubation cellulaire optimal de 30 minutes, transférez 100 μL du milieu d’incubation de chaque condition sur une plaque à 96 puits.
6. Évaluer la réaction colorimétrique à l’aide d’un lecteur de microplaques entre 420 nm et 480 nm.
   1. Placez la plaque sur le lecteur de microplaques et cliquez sur le bouton modifier un nouveau protocole.
   2. Sélectionnez le type spécifique de plaque à 96 puits (voir le tableau des matériaux) utilisé et la longueur d’onde de 450 nm.
   3. Cliquez sur le bouton démarrer la mesure.

8. Test de migration cellulaire - dispositif à deux chambres de migration

1. Suivez les étapes 1 à 3.1 pour cultiver les cellules.
   REMARQUE : Suivez les étapes de cette section pour mettre en œuvre le système de co-culture afin d’étudier l’effet du sécrétome KORS sur la prolifération HDMEC.
   1. Ensemencer le KORS à raison de 1 x 10 5 cellules/mL dans du MSC_M complété par⁵% de FBS et des facteurs de croissance dans l’un des grands compartiments.
   2. Placer la plaque de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24 h.
   3. Placez le dispositif à deux chambres de migration dans l’autre grand compartiment d’inserts.
   4. Ensemencer les HDMECs dans EC_M complété par 5% de FBS et de facteurs de croissance à 7 x 10⁵ cellules/puits du dispositif à deux chambres de migration.
   5. Placer la plaque de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24 h.
   6. Jetez le milieu et le dispositif à deux chambres de migration après 24 h ou à un moment optimal selon le type de cellule qui migre. Mettre en œuvre le système de co-culture par l’ajout de 3 mL d’EC_M basale non supplémentée.
      REMARQUE : Procédez avec précaution pour ne pas détacher les cellules. Si les cellules sont vraiment sensibles au décollement induit par l’ajout de milieu commun, retirez le dispositif à deux chambres de migration après l’ajout du milieu commun.
2. Observez et prenez une photo de la surface recouverte par les cellules à différents moments sous un microscope à contraste de phase à un grossissement de 10x.
   REMARQUE : Les photos sont prises à l’aide d’un microscope à contraste de phase (voir le tableau des matériaux). Les images sont enregistrées sur une clé USB puis analysées par le plugin d’outil de cicatrisation du logiciel (voir Table des matériaux).
3. Mesurez la surface non couverte à l’aide d’un logiciel d’analyse quantitative classique.
   1. Ouvrez l’image sur le logiciel et activez l’outil de cicatrisation disponible dans la liste des macros.
   2. Cliquez sur le bouton m pour mesurer la surface non couverte de l’image de migration.
   3. La surface non couverte est calculée selon la formule suivante :
      Pourcentage de couverture = ([surface moyenne sans cellules à T0 − surface sans cellules à l’instant T]/surface moyenne sans cellules à T0) × 100.
      NOTE : Les inserts imprimés en 3D sont totalement adaptés à la plupart des techniques de biologie cellulaire (telles que le test de formation de pseudotubes, les cultures 3D) et pour les expériences de biochimie (telles que l’extraction d’ADN, d’ARN, de protéines).

Résultats

Dans le présent travail, un système de co-culture optimisé a été décrit pour obtenir des données robustes, fiables et significatives comparables aux méthodes classiques grâce à l’utilisation de milieux conditionnés. Les inserts imprimés en 3D imitent les conditions du microenvironnement in vivo de différents types de cellules en interaction en surmontant les difficultés et la production fastidieuse de milieux conditionnés en amont des expériences. Une étude précédemment publiée a été reme...

Discussion

La communication cellulaire indirecte est couramment étudiée à l’aide de milieux conditionnés ou de dispositifs de système de co-culture. La préparation des milieux conditionnés prend beaucoup de temps en amont des expériences, et cette méthode est limitée à des analyses unilatérales des effets. L’étude précédente de Colin-Pierre et al.⁸ à l’aide de milieux conditionnés a été menée sur la communication cellulaire indirecte entre deux types de cellules (HDMECs et ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave	Getinge	APHP	Solid cycle, 121 °C for 20 min
Biomed Clear	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France)
Cell culture detergents	Tounett	A18590/0116
Cell Proliferation Reagent WST-1	Roche	11,64,48,07,001
Counting slide	NanoEnTek	EVE-050
Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm	Ibidi	80206	two-migration chambers device.
Endothelial cell medium	ScienCell	1001	Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503).
EVE Automated cell counter	NanoEnTek	NESCT-EVE-001E
EVOS XL Core	Fisher Scientific	AMEX1200	10x of magnification
Food silicon reagent and catalyst kit	Artificina	RTV 3428 A and B	(10:1)
FORM 3B printer	Formlabs	PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC	Impression performed by 3D-Morphoz company
Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC)	ScienCell	2000
Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS )	ScienCell	2420
Macro Wound Healing Tool Software	ImageJ		Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays)
Mesenchymal stem cell medium	ScienCell	7501	Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503)
Microplate reader SPECTRO star NANO	BMG Labtech		BMG LABTECH software
PBS	Promocell	C-40232	Without Ca2+ / Mg2+
Trypan Blue Stain	NanoEnTek	EBT-001
Trypsin / EDTA	Promocell	C-41020	Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature
96-well plate Nunclon Delta Surface	Thermoscientific	167008