Basit 2D ve 3D hücre kültürlerini mümkün kılmak için tasarlanmış yenilikçi bir 3D baskılı ek parça

Özet

Bu yazıda, yeni tasarlanmış bir 3D baskılı ek, bir ko-kültür modeli olarak sunulmuş ve endotel hücreleri ile keratinositler arasındaki parakrin hücreler arası iletişimin incelenmesiyle doğrulanmıştır.

Özet

Farklı hücre tipleri arasındaki dolaylı iletişimin klasik analizleri, şartlandırılmış ortamların kullanılmasını gerektirir. Ayrıca, şartlandırılmış ortamın üretimi zaman alıcı ve fizyolojik ve patolojik koşullardan uzak kalmaktadır. Birkaç ko-kültür modeli ticari olarak mevcut olmasına rağmen, bunlar spesifik tahlillerle sınırlı kalır ve çoğunlukla iki tip hücre içindir.

Burada, çok sayıda fonksiyonel tahlil ile uyumlu 3D baskılı kesici uçlar kullanılmaktadır. Ek parça, 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğunun dört bölmeye ayrılmasına izin verir. Çok çeşitli kombinasyonlar ayarlanabilir. Ayrıca, bölmelerin her duvarında pencereler tasarlanmıştır, böylece her bölme arasında potansiyel hücreler arası iletişim, kültür ortamında hacme bağlı bir şekilde mümkün olur. Örneğin, parakrin hücreler arası iletişim, tek katmanlı, 3 boyutlu (sferoidler) veya her ikisini birleştirerek dört hücre tipi arasında incelenebilir. Ek olarak, farklı hücre tiplerinin bir karışımı aynı bölmede 2D veya 3D (organoidler) formatında ekilebilir. 3D baskılı eklerde bir tabanın olmaması, plaka üzerinde olağan kültür koşullarına, eki içeren plaka üzerinde olası kaplamaya ve optik mikroskopi ile doğrudan görselleştirmeye izin verir. Çoklu bölmeler, farklı hücre tiplerini bağımsız olarak toplama veya her bölmede RNA veya protein ekstraksiyonu için farklı reaktifler kullanma imkanı sağlar. Bu çalışmada, yeni 3D baskılı eki bir ko-kültür sistemi olarak kullanmak için ayrıntılı bir metodoloji sağlanmıştır. Bu esnek ve basit modelin çeşitli kapasitelerini göstermek için, daha önce yayınlanmış hücre iletişiminin fonksiyonel tahlilleri yeni 3D baskılı eklerde gerçekleştirildi ve tekrarlanabilir olduğu gösterildi. 3D baskılı ekler ve şartlandırılmış ortam kullanan geleneksel hücre kültürü benzer sonuçlara yol açtı. Sonuç olarak, 3D baskılı ek, yapışık hücre tiplerine sahip çok sayıda ko-kültür modeline uyarlanabilen basit bir cihazdır.

Giriş

İn vivo olarak, hücreler birbirleriyle doğrudan (hücre teması) veya dolaylı olarak (moleküllerin salgılanmasıyla) iletişim kurar. Hücre iletişimini incelemek için, doğrudan ko-kültür (farklı hücre tipleri aynı kuyuda doğrudan etkileşim halindedir) ve bölümlere ayrılmış ko-kültür (farklı hücre tipleri bir kültür sisteminin farklı bölmelerinde dolaylı etkileşim içindedir) gibi farklı ko-kültür modelleri ^{geliştirilebilir1}. Ayrıca, koşullu ortam, dolaylı etkileşimin, bir efektör hücre tipinin koşullu ortamında bulunan salgılanan moleküllerin bir yanıt veren hücre tip^1'e aktarılmasıyla sağlandığı ko-kültür sistemleri için kullanılabilir.

Parakrin hücre iletişim çalışmaları söz konusu olduğunda, dolaylı ko-kültür sistemleri, hücre etkileşimlerini in vivo olarak güçlü bir şekilde yansıtan modeller sağlar. Dolaylı eş-kültür sistemleri geliştirilmiş ve ticarileştirilmiştir, bu da dolaylı eş-kültür modellerinin kurulmasına olanak sağlamıştır ^2,3. Ne yazık ki, çoğu dolaylı ko-kültür sistemi sadece iki bölme sağlar. Diğer dolaylı ko-kültür sistemleri çoklu bölmeler sağlar, ancak bu makalede bildirilen sisteme kıyasla daha az ölçeklenebilirler. Bazıları mikroskop altında klasik bir görselleştirmeye izin vermez ve genellikle belirli uygulama yöntemleri sunarlar. Çeşitli çalışmalarda, farklı hücre tipleri arasındaki parakrin iletişim, koşullu ortam modeli 4,5,6,7 ile incelenmiştir. Bu, dolaylı ko-kültür sistemlerine kıyasla daha kolay bir araştırma yöntemidir, çünkü belirli yöntemlerin veya materyallerin oluşturulmasını gerektirmez¹. Öte yandan, şartlandırılmış ortamın hazırlanması zaman alıcıdır ve yalnızca tek yönlü hücre sinyalizasyonu (efektörden yanıtlayıcıya) hakkında bilgi ^sağlar1.

Bu yazıda, hücre iletişimini araştırmak için yeni ve basit bir yol önerilmiştir. Doğrudan veya dolaylı etkileşimde ve 2D veya 3D formatlarında çeşitli hücre tiplerinin kombinasyonuna izin veren basılı ekler, ko-kültür modellerinin kolayca kurulması için çok sayıda avantaj sunar. 6 oyuklu plakaların kuyucuklarına yerleştirilmek üzere uyarlanmış olan 3D baskılı ek parça daireseldir ve kuyunun dört bölmeye ayrılmasına izin verir (iki büyük bölme ve iki küçük bölme; Şekil 1A). 3D baskılı ekler, bir tabanın olmaması ile karakterize edilir. Böylece hücreler, ekin yerleştirildiği plaka ile doğrudan temas halindedir. Ek olarak, her bölme diğerlerinden bağımsız olarak kaplanabilir. Ayrıca, hücre davranışı optik mikroskoplar altında kolayca takip edilebilir. Ek parçanın her duvarında iletişim pencerelerinin varlığı, farklı ortak kültür deneyleri yapmak için ortak bir ortamın en uygun zamanda eklenmesine izin verir. Çeşitli hücre tipleri arasındaki doğrudan ve/veya dolaylı iletişimi incelemek için çok sayıda ko-kültür kombinasyonu gerçekleştirilebilir. Örneğin, tek tabakalı ve/veya 3 boyutlu (sferoidler) dört farklı hücre tipi arasında dolaylı bir ko-kültür modeli tasarlanabilir. Doğrudan ve dolaylı ko-kültür modellerinin bir kombinasyonu, aynı bölmede farklı hücre tiplerinin karıştırılmasıyla da gerçekleştirilebilir. Karmaşık yapıların (organoidler, doku eksplantı vb.) farklı hücre tipleri üzerindeki etkisi, yapılabilecek modellere başka bir örnek olabilir. Ayrıca, 3D baskılı ekler, hücre biyolojisi fonksiyonel tahlilleri (proliferasyon, migrasyon, psödotüp oluşumu, farklılaşma vb.) ve biyokimya testleri (DNA, RNA, protein, lipitlerin ekstraksiyonu, vb.) ile uyumludur. Son olarak, 3D baskılı ekler, aynı deneyde aynı anda farklı tahlilleri farklı bölmelerde birleştirme imkanı ile çok çeşitli ko-kültür modellerinin deneysel şemalarını sağlar.

3D baskılı eklerin bazı kapasiteleri, bunları hızlı ve kullanımı kolay bir ortak kültür modeli olarak doğrulamak için sunulmuştur. Parakrin hücre iletişimi üzerine daha önce yayınlanmış bir çalışma ile karşılaştırıldığında, 3D baskılı eklerin değerli bir ko-kültür modeli olma yeteneği gösterilmiştir. Bu noktayı değerlendirmek için, keratinositler tarafından endotel hücre proliferasyonunun ve migrasyonunun düzenlenmesi, 3D baskılı insert sistemi ile şartlandırılmış ortam kullanan klasik sistem arasında karşılaştırıldı. 3D baskılı kesici uçlar, şartlandırılmış medya kullanan geleneksel sisteme kıyasla benzer sonuçların hızlı bir şekilde elde edilmesini sağlar. Gerçekten de, 3D baskılı ekler, şartlandırılmış ortam üretme zorunluluğu olmadan ve aynı deneyde proliferasyon ve migrasyon testlerini paralel olarak gerçekleştirme olasılığı ile her iki yönde hücre etkileşimlerini incelemek için sağlam bir model sağlar.

Sonuç olarak, bu yazıda hücre iletişimini incelemek için yeni ve kullanıma hazır bir model önerilmiştir. Tüm yapışık hücre tipleriyle uyumlu olan 3D baskılı ekler, in vivo koşullara daha yakın olmayı amaçlayan çok sayıda ko-kültür kombinasyonunun gerçekleştirilmesine olanak tanır.

Protokol

NOT: 3D ekler (Şekil 1A) ticari olarak temin edilir ve hücre kültürü ve otoklavlama ile biyouyumlu bir fotopolimer reçine kullanılarak basılır (Malzeme Tablosuna bakın). Bu bölümde, eklerle ko-kültür modelini oluşturmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır (bkz. Şekil 1B). Bazı uygulama örnekleri de verilmiştir.

1. Sterilize edilmiş ek parçanın 6 oyuklu plakalara yerleştirilmesi

1. Kitte verilen iki bileşeni (Malzeme Tablosuna bakın), gıda silikonunu (reaktif A) ve katalizörü (reaktif B) üreticinin talimatlarına göre 10:1 (v/v) oranında karıştırın. (Şekil 1Ba). İki bileşeni karıştırmak için %70 etanol ile sterilize edilmiş bir spatula kullanın.
   NOT: Hazırlanacak silikon karışımının hacmi, sabitlenecek ek parça sayısına bağlıdır. Fazla katalizör, silikon karışımının çok hızlı katılaşmasına neden olabilir.
2. Karışımın uçların alt kenarında homojen bir şekilde dağılması için ekleri silikon karışımın üzerine cımbızla uygulayın (Şekil 1Bb). Ekleri 6 oyuklu bir plakanın kuyularına yerleştirin ve hücre kültürü ortamının herhangi bir sızıntısını önlemek için eklerin plaka ile yakın temas halinde olduğundan emin olmak için uçlara hafif bir baskı uygulayın (Şekil 1Bc).
3. Silikonun katılaşma sürecini 1 saat desteklemek için plakayı 37 °C'ye koyun.
   NOT: Katılaşma süresi, eklenen katalizör miktarına bağlıdır.
4. Katılaşmadan sonra, plakaları 30 dakika ila 1 saat boyunca% 70 etanol banyosuna daldırarak eklerle sterilize edin.
5. Alkolü pipetleyerek atın ve plakayı bir hücre kültürü kapağında gece boyunca kurumaya bırakın (kapak açık).
   NOT: Hücre fiksasyonunu ve toksisiteyi önlemek için bir sonraki adımı gerçekleştirmeden önce alkol tamamen buharlaştırılmalıdır. Ekleri içeren kullanıma hazır plaka, oda sıcaklığında kuru ve steril koşullarda kullanılmadan önce birkaç gün saklanabilir.

2. Poli-L-lizin veya poli-HEMA gibi kaplamalar (İsteğe bağlı adım)

NOT: Bu deneyde kaplama yapılmamıştır ve eklerin kaplanma olasılığı hakkında bilgi vermek için adımlar verilmiştir.

1. Kaplama çözeltisini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
2. Ek parçanın kaplanması için en büyük bölmeler için 200-400 μL'lik bir hacim ve en küçük bölmeler için 50-100 μL'lik bir hacim düşünün. Kaplama çözeltisini ayrı bölmelere ekleyin.
3. Kaplamanın steril koşullar altında üretici tarafından belirtildiği şekilde kurumasını bekleyin.

3. Hücrelerin tohumlanması

1. Dış kök kılıfının (KORS) keratinositlerini ve insan dermal mikrovasküler endotel hücrelerini (HDMEC'ler) üretici tarafından önerildiği şekilde kültürleyin. Hücreler birleştiğinde hücre süspansiyonunu hazırlayın.
   1. Ortamı şişelerden atın ve hücreleri ayırmak için 5 mL tripsin ekleyin (bkz.
   2. KORS içeren şişeyi 37 °C'de %5 CO₂ ile 5 dakika bekletin. HDMEC'leri içeren şişeyi oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
   3. KORS içeren tripsin solüsyonunu,% 5 fetal sığır serumu (FBS) ve büyüme faktörleri (ek kit ile bazal besiyeri, bkz. Malzeme Tablosu) ile desteklenmiş 5 mL mezenkimal kök hücre ortamı (MSC_M) ile karıştırın. HDMEC'leri içeren tripsin çözeltisini,% 5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş 5 mL endotel hücre ortamı (EC_M) ile karıştırın (bkz.
   4. Hücreleri 15 mL'lik steril konik bir tüpe aktarın. KORS ve HDMEC süspansiyonlarını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
   5. Süpernatanı atın ve hücreleri ilgili ortamın 2 mL'sinde yeniden süspanse edin.
   6. 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi boya ile karıştırın (bkz.
   7. Sayma slaytının haznesine 10 μL karışım ekleyin.
   8. Sayma slaytını hücre sayma sistemine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve hücre numarasını ve canlılığını tespit edin.
   9. Hücre süspansiyonunu ilgili ortamda 0.5 x 10⁵ hücre / mL konsantrasyonda hazırlayın.
      NOT: Farklı hücre tipleri farklı yapışma süreleri gerektiriyorsa ve/veya ideal birleşmeye ulaşmak için hücre tohumlaması hücre tiplerine göre farklı zaman noktalarında yapılabilir.
2. 800 μL ila 1 mL hücre süspansiyonunu tek tek büyük bölmelere ve 100-150 μL'yi bir pipetle ayrı küçük bölmelere dağıtın.
   1. KORS'u 1 x 10 5 hücre/mL'de MSC_M'de tohumlayın, büyük bölmelerden birinde%⁵ FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiştir.
   2. EC_M'deki tohum HDMEC, küçük bölmelerde 2.5 x 10³ hücre/mL'de ve diğer büyük bölmede 1.25 x 10⁵ hücre/mL'de %5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiştir.
      NOT: Proliferasyon testi küçük bölmelerde, migrasyon ve canlılık deneyleri ise büyük bölmelerde gerçekleştirilebilir. Ekilen hücrelerin konsantrasyonu, üreticinin tavsiyelerine göre optimize edilmiştir. Bu konsantrasyon, 24-48 saatlik inkübasyondan sonra hücrelerin iyi bir şekilde yaşamasını sağlar.
3. Hücre kültürü plakasını 37 °C'de %5 CO₂ ile veya hücre yapışmasına ve/veya olgunlaşmasına izin vermek için normal koşullar altında yerleştirin.
   NOT: Ortamı değiştirmeden hücreleri 24-48 saat inkübe edin. Gerekirse, bölmelerin ortamı bağımsız olarak değiştirilebilir.

4. Ortak kültürün uygulanması (Şekil 1Bd)

NOT: Ortak kültürün uygulanması, ortak ortamın eklendiği zamana karşılık gelir. Farklı bölmelerdeki tüm hücre tipleri için benzersiz bir ortamın eklenmesi, iletişim pencerelerinin (3D baskılı eklerin duvarlarındaki oval delikler) varlığı nedeniyle hücreler arasında parakrin iletişim imkanı sağlar. Ortak kültürü uygulamak için 4.1-4.3 adımlarını izleyin.

1. Bir pipet kullanarak eklerin farklı bölmelerinin kültür ortamını boşaltın. 3D sferoid hücre kültürü durumunda, ortamı çok nazikçe atın.
2. Hücreleri büyük bölmelerde 1 mL 37 °C sıcak PBS ve küçük bölmelerde 200 μL 37 °C sıcak PBS ile durulayın. Hücreleri ayırmamak için nazikçe yıkadığınızdan emin olun.
3. Tüm hücre tipleri için uyumlu olacak şekilde seçilen ortak bir ortamdan 3 mL ekleyin.
   NOT: Bu çalışmada bazal EC_M (FBS ve büyüme faktörleri olmadan) kullanılmıştır. Ortamın tüm bölmeleri kapladığından emin olun ( Şekil 1A'da gösterildiği gibi iletişim pencerelerinin [duvarlardaki oval delikler] üzerindeki seviye).
4. Ko-kültürleri içeren plakayı 37 °C'de %5 CO₂ ile 24-48 saat yerleştirin.

5. Hücre gözlemi, sayma ve kazıma

1. Morfolojiyi gözlemleyin ve deney sırasında 24-48 saatlik inkübasyondan sonra optik mikroskop altında farklı bölmelerin hücre sayısını sayın.
   NOT: Beklenen hücre sayısı, kullanılan hücre tiplerine (boyut, morfoloji vb.) ve bölme boyutuna bağlıdır. Bu deneyde, büyük bölmelerde 0.5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/mL arasında ve 0.25 x 10 6-0.75 x 10 ⁶ HDMECs/mL arasında sayılmıştır.
2. Hücre süspansiyonu sayımı için tripsin kullanarak hücreleri ayırın.
   NOT: Hücre ayırma çözümü için, en büyük bölmeler için 100-500 μL'lik bir hacim ve en küçük bölmeler için 10-50 μL'lik bir hacim düşünün.
3. Tripan mavisi boyamayı kullanarak canlılığı kontrol edin (bkz. adım 3.1.6-3.1.8).

6. Geri dönüşüm için temizlik ekleyin

1. Deneyin sonunda 6 oyuklu plakadan ekleri hafif bir bükülme ile çıkarın (Şekil 1Be).
2. Silikonu çekerek eklerden çıkarın. Gerekirse, eklerin duvarlarına yapışmış kalan silikonu çıkarmak için bir spatula kullanın (Şekil 1Bf).
3. Ekleri geleneksel hücre kültürü deterjanları ve temizlik malzemeleriyle yıkayın (örn.ampMalzeme Tablosunda verilmiştir).
4. Ekleri ileride bir otoklavda (katı döngü, 20 dakika boyunca 121 °C) veya 1 saat boyunca %70 etanol banyosuna daldırarak kullanmak üzere sterilize edin.
   NOT: Bu adımdan, 3D baskılı ekler kullanılarak iki olası test örneği (proliferasyon ve migrasyon deneyleri) açıklanmaktadır (Şekil 1Bd).

7. Hücre proliferasyon testi - WST-1 testi

1. Hücreleri kültürlemek için 1-3.1 arasındaki adımları izleyin.
   NOT: KORS sekretomunun HDMEC proliferasyonu üzerindeki etkisini araştırmak için ko-kültür sistemini uygulamak için bu bölümdeki adımı izleyin. KORS hücreleri, daha önce yayınlanan verileri karşılaştırmak için kullanılır⁸.
   1. KORS'u 1 x 10 5 hücre / mL'de mezenkimal kök hücre ortamında (MSC_M) tohumlayın, büyük bölmelerde%⁵ FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiştir.
   2. Hücre kültürü plakasını 24 saat boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C'ye yerleştirin.
   3. HDMEC'leri, küçük bölmelerde 2.5 x 10³ hücre / mL'de% 5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş endotel hücre ortamında (EC_M) tohumlayın.
   4. Hücre kültürü plakasını 24-48 saat boyunca %5 CO₂ ile 37 °C'ye yerleştirin.
   5. Ortamı tüm bölmelerden atın ve 3 mL takviye edilmemiş bazal EC_M (3D baskılı eklerin tüm bölmeleri için ortak hücre kültürü ortamı) ekleyerek ko-kültür sistemini uygulayın.
2. WST-1 çözeltisini hazırlamak için WST-1'i EC_M ortak hücre kültürü ortamında (1:10 son seyreltme) seyreltin.
   NOT: WST-1 çözeltisinin hacmi için, boşluk için en az 500 μL ekstra çözelti hazırlayın.
3. Pipetleme yoluyla hücre kültürü ortamını çekirdekten atın.
4. WST-1 solüsyonunu seçilen bölmelere ekleyin (küçük bölmeler için 150 μL ve büyük bölmeler için 600 μL). Plakayı %5 CO ile 37 °C'ye getirin₂.
5. Optimum 30 dakikalık hücre inkübasyon süresinden sonra, her koşuldan 100 μL inkübasyon ortamını 96 oyuklu bir plaka üzerine aktarın.
6. 420 nm ile 480 nm arasında bir mikroplaka okuyucu kullanarak kolorimetrik reaksiyonu değerlendirin.
   1. Plakayı mikroplaka okuyucuya koyun ve yeni bir protokol düzenle düğmesine tıklayın.
   2. Kullanılan 96 oyuklu plakanın özel tipini ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 450 nm dalga boyunu seçin.
   3. Ölçümü başlat düğmesine tıklayın.

8. Hücre migrasyon tahlili - iki migrasyon odası cihazı

1. Hücreleri kültürlemek için 1-3.1 arasındaki adımları izleyin.
   NOT: KORS sekretomunun HDMEC proliferasyonu üzerindeki etkisini araştırmak amacıyla ko-kültür sistemini uygulamak için bu bölümdeki adımları izleyin.
   1. KORS'u 1 x 10 5 hücre/mL'de MSC_M'de tohumlayın, büyük bölmelerden birinde%⁵ FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiştir.
   2. Hücre kültürü plakasını 24 saat boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C'ye yerleştirin.
   3. İki migrasyon haznesi cihazını diğer büyük ek bölmesine yerleştirin.
   4. İki migrasyon odası cihazının 7 x 10 5 hücresinde/kuyusunda%⁵ FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş EC_M'deki HDMEC'leri tohumlayın.
   5. Hücre kültürü plakasını 24 saat boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C'ye yerleştirin.
   6. Ortamı ve iki migrasyon odası cihazını 24 saat sonra veya taşınan hücre tipine göre en uygun zamanda atın. Ko-kültür sistemini, 3 mL takviye edilmemiş bazal EC_M ilavesiyle uygulayın.
      NOT: Hücreleri ayırmamak için dikkatli bir şekilde ilerleyin. Hücreler, ortak ortamın eklenmesiyle indüklenen ayrılmaya karşı gerçekten hassassa, ortak ortamın eklenmesinden sonra iki migrasyon odası cihazını çekin.
2. 10x büyütmede faz kontrast mikroskobu altında farklı zaman noktalarında hücrelerin kapladığı yüzeyi gözlemleyin ve fotoğrafını çekin.
   NOT: Resimler faz kontrast mikroskobu ile çekilmiştir (bkz. Resimler bir USB anahtarına kaydedilir ve daha sonra yazılımın yara iyileştirme aracı eklentisi tarafından analiz edilir (bkz.
3. Klasik kantitatif analiz yazılımını kullanarak ortaya çıkarılan yüzeyi ölçün.
   1. Görüntüyü yazılımda açın ve makro listesinde bulunan yara iyileştirme aracını etkinleştirin.
   2. Geçiş görüntüsünün açıkta kalan yüzeyini ölçmek için m düğmesine tıklayın.
   3. Ortaya çıkarılan yüzey aşağıdaki formüle göre hesaplanır:
      Kapsama yüzdesi = ([T0'da hücresiz ortalama alan − T zamanında hücresiz alan]/T0'da hücresiz ortalama alan) × 100.
      NOT: 3D baskılı ekler, hücre biyolojisi tekniklerinin çoğuna (psödotüp oluşum testi, 3D kültürler gibi) ve biyokimya deneylerine (DNA, RNA, protein ekstraksiyonu gibi) tamamen uyarlanmıştır.

Sonuçlar

Bu çalışmada, şartlandırılmış ortamların kullanımı yoluyla klasik yöntemlerle karşılaştırılabilir sağlam, güvenilir ve anlamlı veriler elde etmek için optimize edilmiş bir ko-kültür sistemi tanımlanmıştır. 3D baskılı ekler, deneylerde zorlukların ve zaman alıcı koşullu ortam üretiminin üstesinden gelerek, etkileşim halindeki farklı hücre tiplerinin in vivo mikroçevre koşullarını taklit eder. Saç foliküllerinde bulunan iki hücre tipi arasındaki dolaylı etkileşimler...

Tartışmalar

Dolaylı hücre iletişimi genellikle koşullu ortam veya ko-kültür sistemi cihazları kullanılarak araştırılır. Şartlandırılmış ortam hazırlama, deneylerde yukarı yönde zaman alıcıdır ve bu yöntem tek taraflı etki analizleriyle sınırlıdır. Colin-Pierre ve arkadaşları tarafından yapılan önceki çalışma.⁸ şartlandırılmış ortam kullanılarak, iki hücre tipi (HDMEC'ler ve KORS) arasındaki dolaylı hücre iletişimi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu ?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave	Getinge	APHP	Solid cycle, 121 °C for 20 min
Biomed Clear	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France)
Cell culture detergents	Tounett	A18590/0116
Cell Proliferation Reagent WST-1	Roche	11,64,48,07,001
Counting slide	NanoEnTek	EVE-050
Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm	Ibidi	80206	two-migration chambers device.
Endothelial cell medium	ScienCell	1001	Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503).
EVE Automated cell counter	NanoEnTek	NESCT-EVE-001E
EVOS XL Core	Fisher Scientific	AMEX1200	10x of magnification
Food silicon reagent and catalyst kit	Artificina	RTV 3428 A and B	(10:1)
FORM 3B printer	Formlabs	PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC	Impression performed by 3D-Morphoz company
Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC)	ScienCell	2000
Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS )	ScienCell	2420
Macro Wound Healing Tool Software	ImageJ		Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays)
Mesenchymal stem cell medium	ScienCell	7501	Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503)
Microplate reader SPECTRO star NANO	BMG Labtech		BMG LABTECH software
PBS	Promocell	C-40232	Without Ca2+ / Mg2+
Trypan Blue Stain	NanoEnTek	EBT-001
Trypsin / EDTA	Promocell	C-41020	Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature
96-well plate Nunclon Delta Surface	Thermoscientific	167008