Um inserto inovador impresso em 3D projetado para permitir culturas de células 2D e 3D diretas

Resumo

Neste artigo, um novo inserto impresso em 3D é apresentado como um modelo de co-cultura e validado através do estudo da comunicação intercelular parácrina entre células endoteliais e queratinócitos.

Resumo

As análises clássicas da comunicação indireta entre diferentes tipos celulares requerem o uso de meios condicionados. Além disso, a produção de meios condicionados permanece demorada e distante de condições fisiológicas e patológicas. Embora alguns modelos de co-cultura estejam comercialmente disponíveis, eles permanecem restritos a ensaios específicos e são principalmente para dois tipos de células.

Aqui, são usados insertos impressos em 3D que são compatíveis com inúmeros ensaios funcionais. A pastilha permite a separação de um poço de uma placa de 6 poços em quatro compartimentos. Uma ampla gama de combinações pode ser definida. Além disso, janelas são projetadas em cada parede dos compartimentos para que a comunicação intercelular potencial entre cada compartimento seja possível no meio de cultura de forma dependente do volume. Por exemplo, a comunicação intercelular parácrina pode ser estudada entre quatro tipos celulares em monocamada, em 3D (esferoides) ou combinando ambos. Além disso, uma mistura de diferentes tipos de células pode ser semeada no mesmo compartimento em formato 2D ou 3D (organoides). A ausência de fundo nos insertos impressos em 3D permite as condições usuais de cultura na placa, possível revestimento na placa que contém o inserto e visualização direta por microscopia óptica. Os múltiplos compartimentos oferecem a possibilidade de coletar diferentes tipos celulares de forma independente ou de utilizar, em cada compartimento, diferentes reagentes para extração de RNA ou proteínas. Neste estudo, uma metodologia detalhada é fornecida para usar o novo inserto impresso em 3D como um sistema de co-cultura. Para demonstrar várias capacidades deste modelo flexível e simples, ensaios funcionais de comunicação celular previamente publicados foram realizados nos novos insertos impressos em 3D e demonstraram ser reprodutíveis. As pastilhas impressas em 3D e a cultura celular convencional em meio condicionado levaram a resultados semelhantes. Em conclusão, o inserto impresso em 3D é um dispositivo simples que pode ser adaptado a inúmeros modelos de co-culturas com tipos celulares aderentes.

Introdução

In vivo, as células se comunicam entre si diretamente (contato celular) ou indiretamente (por secreção de moléculas). Para estudar a comunicação celular, diferentes modelos de co-cultura podem ser desenvolvidos, como o co-cultivo direto (os diferentes tipos celulares estão em interação direta no mesmo poço) e o co-cultivo compartimentado (os diferentes tipos celulares estão em interação indireta em diferentes compartimentos de um sistema de cultura)¹. Além disso, meios condicionados podem ser usados para sistemas de co-cultura, onde a interação indireta é possibilitada por moléculas secretadas contidas no meio condicionado de um tipo de célula efetora sendo transferida para uma célula respondedora tipo¹.

No caso de estudos de comunicação celular parácrina, sistemas de co-cultura indireta fornecem modelos que refletem fortemente as interações celulares in vivo. Sistemas de cocultura indireta têm sido desenvolvidos e comercializados, permitindo o estabelecimento de modelos de cocultura indireta ^2,3. Infelizmente, a maioria dos sistemas de co-cultura indireta fornece apenas dois compartimentos. Outros sistemas de co-cultura indireta fornecem múltiplos compartimentos, mas são menos escaláveis em comparação com o sistema relatado no presente manuscrito. Alguns deles não permitem uma visualização clássica ao microscópio e, muitas vezes, apresentam métodos específicos de aplicação. Em vários estudos, a comunicação parácrina entre diferentes tipos celulares é investigada pelo modelo de meios^{condicionados} 4,5,6,7. Esta é uma maneira mais fácil de investigação em comparação com sistemas de co-cultura indireta, pois não requer métodos ou materiais específicos para serem estabelecidos¹. Por outro lado, a preparação de meios condicionados é demorada e fornece informações apenas sobre a sinalização celular unidirecional (efetor para respondedor)¹.

Neste artigo, uma nova e simples forma de investigar a comunicação celular é proposta. Permitindo a combinação de vários tipos celulares em interação direta ou indireta e em formatos 2D ou 3D, os insertos impressos apresentam inúmeras vantagens para a fácil montagem de modelos de co-cultura. Adaptado para ser colocado nos poços de placas de 6 poços, o inserto impresso em 3D é circular e permite a separação do poço em quatro compartimentos (dois grandes compartimentos e dois pequenos compartimentos; Figura 1A). As pastilhas impressas em 3D são caracterizadas pela ausência de um fundo. Assim, as células ficam em contato direto com a placa na qual a pastilha é colocada. Além disso, cada compartimento pode ser revestido independentemente dos outros. Além disso, o comportamento celular pode ser facilmente acompanhado em microscópios ópticos. A presença de janelas de comunicação em cada parede da pastilha permite a adição, no momento ideal, de um meio comum para realizar diferentes experimentos de co-cultura. Inúmeras combinações de co-cultura podem ser realizadas para estudar a comunicação direta e/ou indireta entre vários tipos celulares. Por exemplo, um modelo de co-cultura indireta entre quatro tipos diferentes de células em monocamada e/ou em 3D (esferoides) pode ser projetado. Uma combinação de modelos de co-cultura direta e indireta também pode ser realizada misturando diferentes tipos celulares no mesmo compartimento. O efeito de estruturas complexas (organoides, explantes teciduais, etc.) sobre diferentes tipos celulares poderia ser outro exemplo de modelos que podem ser feitos. Além disso, as inserções impressas em 3D são compatíveis com ensaios funcionais de biologia celular (proliferação, migração, formação de pseudotubos, diferenciação, etc.) e com testes bioquímicos (extração de DNA, RNA, proteínas, lipídios, etc.). Finalmente, os insertos impressos em 3D fornecem uma ampla gama de esquemas experimentais de modelos de co-cultura com a possibilidade de combinar simultaneamente diferentes ensaios no mesmo experimento nos diferentes compartimentos.

Algumas capacidades dos encartes impressos em 3D são apresentadas para validá-los como um modelo de co-cultura rápido e fácil de usar. Em comparação com um estudo publicado anteriormente sobre comunicação celular parácrina, a capacidade das pastilhas impressas em 3D de serem um valioso modelo de co-cultura é demonstrada. Para avaliar esse ponto, a regulação da proliferação e migração de células endoteliais pelos queratinócitos foi comparada entre o sistema de inserção impresso em 3D e o sistema clássico usando meios condicionados. Os insertos impressos em 3D permitem a obtenção de resultados semelhantes rapidamente em relação ao sistema convencional que utiliza meios condicionados. De fato, as pastilhas impressas em 3D fornecem um modelo robusto para estudar interações celulares em ambas as direções sem a necessidade de produzir meios condicionados e com a possibilidade de realizar em paralelo os ensaios de proliferação e migração em um mesmo experimento.

Para concluir, neste artigo, um novo modelo pronto para uso para estudar a comunicação celular é proposto. Compatíveis com todos os tipos celulares aderentes, as pastilhas impressas em 3D permitem realizar inúmeras combinações de co-cultura que visam estar mais próximas das condições in vivo .

Protocolo

NOTA: Os insertos 3D (Figura 1A) são adquiridos comercialmente e impressos usando uma resina fotopolimérica que é biocompatível com cultura de células e autoclavagem (consulte a Tabela de Materiais). Nesta seção, um protocolo detalhado para estabelecer o modelo de co-cultura por inserções é descrito (ver Figura 1B). Alguns exemplos de aplicações também são fornecidos.

1. Colocação da pastilha esterilizada nas placas de 6 poços

1. Misturar os dois componentes fornecidos no kit (ver Tabela de Materiais), silício alimentar (reagente A) e catalisador (reagente B), numa proporção de 10:1 (v/v) de acordo com as instruções do fabricante. (Figura 1B). Use uma espátula esterilizada a etanol 70% para misturar os dois componentes.
   NOTA: O volume da mistura de silicone a ser preparada depende do número de pastilhas a serem fixadas. Um excesso de catalisador pode fazer com que a mistura de silício se solidifique muito rápido.
2. Aplicar as pastilhas sobre a mistura de silicone com uma pinça de modo que a mistura seja homogeneamente distribuída na borda inferior das pastilhas (Figura 1Bb). Coloque as pastilhas nos orifícios de uma placa de 6 poços e aplique uma pressão suave sobre as pastilhas para garantir que as pastilhas estejam em contato próximo com a placa para evitar qualquer vazamento do meio de cultura celular (Figura 1Bc).
3. Colocar a placa a 37 °C para apoiar o processo de solidificação do silício durante 1 h.
   NOTA: O tempo de solidificação depende da quantidade de catalisador que foi adicionada.
4. Após a solidificação, esterilizar as placas com as pastilhas imergindo-as em banho de etanol 70% por 30 min a 1 h.
5. Descarte o álcool por pipetagem e deixe a placa secar (tampa aberta) durante a noite em uma capa de cultura celular.
   NOTA: O álcool deve ser totalmente evaporado antes de realizar o próximo passo para evitar a fixação celular e toxicidade. A placa pronta para uso contendo as pastilhas pode ser armazenada por vários dias antes do uso em condições secas e estéreis à temperatura ambiente.

2. Revestimentos como poli-L-lisina, ou poli-HEMA (etapa opcional)

OBS: O revestimento não é realizado neste experimento, e são fornecidas as etapas para informar quanto à possibilidade de revestimento dos insertos.

1. Prepare a solução de revestimento de acordo com as instruções do fabricante.
2. Considere um volume de 200-400 μL para os compartimentos maiores e um volume de 50-100 μL para os compartimentos menores para o revestimento da pastilha. Adicione a solução de revestimento aos compartimentos individuais.
3. Deixe o revestimento secar conforme indicado pelo fabricante em condições estéreis.

3. Semeadura das células

1. Cultivar os queratinócitos da bainha radicular externa (KORS) e as células endoteliais microvasculares dérmicas humanas (HDMECs), conforme recomendação do fabricante. Prepare a suspensão celular assim que as células atingirem a confluência.
   1. Eliminar o meio dos frascos e adicionar 5 ml de tripsina para separar as células (ver Tabela de Materiais).
   2. Colocar o balão contendo o KORS a 37 °C com 5% de CO₂ durante 5 min. Incubar o balão contendo os HDMECs durante 5 min à temperatura ambiente.
   3. Misturar a solução de tripsina contendo o KORS com 5 mL de meio de células-tronco mesenquimais (CTM_M) suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB) e fatores de crescimento (meio basal com kit suplementar, ver Tabela de Materiais). Misturar a solução de tripsina contendo os HDMECs com 5 mL de meio de célula endotelial (EC_M) suplementado com 5% de SFB e fatores de crescimento (ver Tabela de Materiais).
   4. Transfira as células para um tubo cônico estéril de 15 mL. Centrifugar as suspensões KORS e HDMEC a 200 x g por 5 min à temperatura ambiente.
   5. Eliminar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL do respectivo meio.
   6. Misturar 10 μL da suspensão celular com 10 μL de corante azul de tripano (ver Tabela de Materiais).
   7. Adicionar 10 μL da mistura à câmara da lâmina de contagem.
   8. Insira a lâmina de contagem no sistema de contagem de células (consulte Tabela de Materiais) e detecte o número de células e a viabilidade.
   9. Preparar a suspensão celular na concentração de 0,5 x 10⁵ células/mL no respectivo meio.
      NOTA: Se os diferentes tipos celulares requerem diferentes tempos de aderência e/ou para atingir a confluência ideal, a semeadura celular pode ser feita em diferentes pontos de tempo de acordo com os tipos celulares.
2. Distribuir 800 μL a 1 mL da suspensão celular nos grandes compartimentos individuais e 100-150 μL nos pequenos compartimentos individuais com uma pipeta.
   1. Semeando o KORS a 1 x 10 5 células/mL em CTM_M suplementada com⁵% de SFB e fatores de crescimento em um dos grandes compartimentos.
   2. HDMEC em EC_M suplementada com 5% de SFB e fatores de crescimento a 2,5 x 10³ células/mL nos compartimentos pequenos e a 1,25 x 10⁵ células/mL no outro compartimento grande.
      NOTA: O ensaio de proliferação pode ser realizado nos pequenos compartimentos, e os ensaios de migração e viabilidade podem ser realizados nos grandes compartimentos. A concentração das células semeadas foi otimizada de acordo com as recomendações do fabricante. Esta concentração permite uma boa viabilidade das células após 24-48 h de incubação.
3. Colocar a placa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO₂ ou nas condições habituais para permitir a adesão e/ou maturação celular.
   NOTA: Incubar as células por 24-48 h sem alterar o meio. Se necessário, o meio dos compartimentos pode ser trocado independentemente.

4. Implementação da co-cultura ( Figura 1Bd)

NOTA: A implementação da co-cultura corresponde ao momento em que o meio comum é adicionado. A adição de um meio único para todos os tipos celulares nos diferentes compartimentos proporciona a possibilidade de comunicação parácrina entre as células devido à presença de janelas de comunicação (orifícios ovoides nas paredes das pastilhas impressas em 3D). Para implementar a cocultura, siga as etapas 4.1-4.3.

1. Esvazie os meios de cultura dos diferentes compartimentos das pastilhas usando uma pipeta. No caso de uma cultura de células esferoides 3D, descarte o meio com muita delicadeza.
2. Enxaguar as células com 1 mL de PBS aquecido a 37 °C nos compartimentos grandes e 200 μL de PBS aquecido a 37 °C nos compartimentos pequenos. Certifique-se de lavar suavemente para não desprender as células.
3. Adicionar 3 mL de um meio comum selecionado para ser compatível com todos os tipos celulares.
   NOTA: Neste estudo, o EC_M basal (sem SFB e fatores de crescimento) é usado. Certifique-se de que o meio cubra todos os compartimentos (nível acima das janelas de comunicação [orifícios ovoides nas paredes], como mostra a Figura 1A).
4. Colocar a placa contendo as co-culturas a 37 °C com 5% de CO₂ durante 24-48 horas.

5. Observação, contagem e raspagem de células

1. Observar a morfologia e contar o número de células dos diferentes compartimentos durante o experimento em microscópio óptico após 24-48 h de incubação.
   NOTA: O número esperado de células depende dos tipos de células utilizadas (tamanho, morfologia, etc.) e do tamanho do compartimento. Neste experimento, entre 0,5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/mL e entre 0,25 x 10 6-0,75 x 10 ⁶ HDMECs/mL são contados nos grandes compartimentos.
2. Destacar as células usando tripsina para contagem de suspensão celular.
   NOTA: Para a solução de descolamento celular, considere um volume de 100-500 μL para os compartimentos maiores e um volume de 10-50 μL para os compartimentos menores.
3. Verificar a viabilidade utilizando a coloração azul de tripano (ver passos 3.1.6-3.1.8).

6. Limpeza de pastilhas para reciclagem

1. Remova as pastilhas da placa de 6 poços no final do experimento por uma leve torção (Figura 1Be).
2. Remova o silicone das pastilhas puxando-o. Se necessário, use uma espátula para remover o silicone restante preso às paredes dos insertos (Figura 1Bf).
3. Lave as pastilhas com detergentes convencionais para cultura de células e materiais de limpeza (exemplo fornecido na Tabela de Materiais).
4. Esterilizar as pastilhas para uso futuro em autoclave (ciclo sólido, 121 °C por 20 min) ou imergindo-as em banho de etanol 70% por 1 h.
   NOTA: A partir desta etapa, dois exemplos de ensaios possíveis (ensaios de proliferação e migração) são descritos usando os insertos impressos em 3D (Figura 1Bd).

7. Ensaio de proliferação celular - ensaio WST-1

1. Siga as etapas 1-3.1 para cultivar as células.
   NOTA: Siga o passo nesta seção para implementar o sistema de co-cultura, a fim de investigar o efeito do secretoma KORS na proliferação de HDMEC. As células KORS são utilizadas para comparar os dados publicados anteriormente⁸.
   1. Semeando o KORS a 1 x 10 5 células/mL em meio de células-tronco mesenquimais (CTM_M) suplementado com⁵% de SFB e fatores de crescimento nos grandes compartimentos.
   2. Colocar a placa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO₂ durante 24 horas.
   3. Semeando as HDMECs em meio de células endoteliais (EC_M) suplementado com 5% de SFB e fatores de crescimento a 2,5 x 10³ células/mL nos pequenos compartimentos.
   4. Colocar a placa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO₂ durante 24-48 horas.
   5. Eliminar o meio de todos os compartimentos e implementar o sistema de co-cultura pela adição de 3 mL de EC_M basal não suplementado (meio de cultura celular comum para todos os compartimentos das pastilhas impressas em 3D).
2. Diluir o WST-1 no meio de cultura de células comuns EC_M (diluição final 1:10) para preparar a solução de WST-1.
   NOTA: Para o volume de solução WST-1, prepare pelo menos 500 μL de solução extra para o branco.
3. Descarte o meio de cultura celular da inserção por pipetagem.
4. Adicionar a solução WST-1 aos compartimentos seleccionados (150 μL para os compartimentos pequenos e 600 μL para os compartimentos grandes). Colocar a placa a 37 °C com 5% de CO₂.
5. Após o tempo ideal de incubação celular de 30 min, transfira 100 μL do meio de incubação de cada condição em uma placa de 96 poços.
6. Avaliar a reação colorimétrica utilizando um leitor de microplacas entre 420 nm e 480 nm.
   1. Coloque a placa no leitor de microplacas e clique no botão editar um novo protocolo.
   2. Selecione o tipo específico de placa de 96 poços (consulte Tabela de Materiais) usada e o comprimento de onda de 450 nm.
   3. Clique no botão iniciar medição.

8. Ensaio de migração celular - dispositivo de duas câmaras de migração

1. Siga as etapas 1-3.1 para cultivar as células.
   NOTA: Siga as etapas nesta seção para implementar o sistema de co-cultura a fim de investigar o efeito do secretoma KORS na proliferação de HDMEC.
   1. Semeando o KORS a 1 x 10 5 células/mL em CTM_M suplementada com⁵% de SFB e fatores de crescimento em um dos grandes compartimentos.
   2. Colocar a placa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO₂ durante 24 horas.
   3. Coloque o dispositivo de duas câmaras de migração no outro grande compartimento de inserções.
   4. Semeando os HDMECs em EC_M suplementado com 5% de SFB e fatores de crescimento a 7 x 10⁵ células/poço do dispositivo das duas câmaras de migração.
   5. Colocar a placa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO₂ durante 24 horas.
   6. Descarte a mídia e o dispositivo das duas câmaras de migração após 24 h ou em um momento ideal de acordo com o tipo de célula que está migrando. Implementar o sistema de co-cultura pela adição de 3 mL de EC_M basal não suplementada.
      NOTA: Prossiga com cuidado para não desanexar as células. Se as células forem realmente sensíveis ao descolamento induzido pela adição de meio comum, retire o dispositivo de duas câmaras de migração após a adição do meio comum.
2. Observe e tire uma foto da superfície coberta pelas células em diferentes momentos em um microscópio de contraste de fase com aumento de 10x.
   NOTA: As fotos são tiradas com um microscópio de contraste de fase (ver Tabela de Materiais). As imagens são salvas em uma chave USB e, em seguida, analisadas pelo plugin da ferramenta de cicatrização de feridas do software (consulte Tabela de Materiais).
3. Meça a superfície descoberta usando um software clássico de análise quantitativa.
   1. Abra a imagem no software e ative a ferramenta de cicatrização de feridas disponível na lista de macros.
   2. Clique no botão m para medir a superfície descoberta da imagem de migração.
   3. A superfície descoberta é calculada de acordo com a seguinte fórmula:
      Porcentagem de cobertura = ([área média sem células em T0 − área sem células no tempo T]/área média sem células em T0) × 100.
      NOTA: As inserções impressas em 3D são totalmente adaptadas à maioria das técnicas de biologia celular (como o ensaio de formação de pseudotubos, culturas 3D) e para experimentos de bioquímica (como a extração de DNA, RNA, proteína).

Resultados

No presente trabalho, um sistema de co-cultivo otimizado foi descrito para obter dados robustos, confiáveis e significativos comparáveis aos métodos clássicos através do uso de meios condicionados. As inserções impressas em 3D mimetizam as condições do microambiente in vivo de diferentes tipos celulares em interação, superando as dificuldades e a demorada produção de meios condicionados a montante nos experimentos. Um estudo publicado anteriormente foi reconduzido para analisar as interações indir...

Discussão

A comunicação celular indireta é comumente investigada usando meios condicionados ou dispositivos de sistemas de co-cultura. A preparação de meios condicionados é demorada a montante nos experimentos, e esse método é restrito a análises de efeitos unilaterais. O estudo anterior de Colin-Pierre et al.⁸ utilizando meios condicionados foi realizada a comunicação celular indireta entre dois tipos celulares (HDMECs e KORS). Os dados deste estudo anterior demonstraram o efeito do mei...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave	Getinge	APHP	Solid cycle, 121 °C for 20 min
Biomed Clear	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France)
Cell culture detergents	Tounett	A18590/0116
Cell Proliferation Reagent WST-1	Roche	11,64,48,07,001
Counting slide	NanoEnTek	EVE-050
Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm	Ibidi	80206	two-migration chambers device.
Endothelial cell medium	ScienCell	1001	Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503).
EVE Automated cell counter	NanoEnTek	NESCT-EVE-001E
EVOS XL Core	Fisher Scientific	AMEX1200	10x of magnification
Food silicon reagent and catalyst kit	Artificina	RTV 3428 A and B	(10:1)
FORM 3B printer	Formlabs	PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC	Impression performed by 3D-Morphoz company
Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC)	ScienCell	2000
Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS )	ScienCell	2420
Macro Wound Healing Tool Software	ImageJ		Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays)
Mesenchymal stem cell medium	ScienCell	7501	Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503)
Microplate reader SPECTRO star NANO	BMG Labtech		BMG LABTECH software
PBS	Promocell	C-40232	Without Ca2+ / Mg2+
Trypan Blue Stain	NanoEnTek	EBT-001
Trypsin / EDTA	Promocell	C-41020	Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature
96-well plate Nunclon Delta Surface	Thermoscientific	167008