Une méthode d’imagerie basée sur un smartphone pour le test d’évitement de pelouse de C. elegans

Résumé

Cet article décrit une méthode simple et peu coûteuse d’enregistrement du comportement d’évitement de pelouse de Caenorhabditis elegans, en utilisant des éléments facilement disponibles tels qu’un smartphone et un boîtier lumineux à diodes électroluminescentes (LED). Nous fournissons également un script Python pour traiter le fichier vidéo dans un format plus propice au comptage.

Résumé

Lorsqu’il est exposé à des bactéries toxiques ou pathogènes, le nématode Caenorhabditis elegans affiche un comportement appris d’évitement de la pelouse, dans lequel les vers quittent progressivement leur source de nourriture et préfèrent rester à l’extérieur de la pelouse bactérienne. Le test est un moyen facile de tester la capacité des vers à détecter les signaux externes ou internes pour répondre correctement aux conditions nocives. Bien qu’il s’agisse d’un test simple, le comptage prend beaucoup de temps, en particulier avec plusieurs échantillons, et les durées de test qui s’étendent sur la nuit sont gênantes pour les chercheurs. Un système d’imagerie capable d’imager de nombreuses plaques sur une longue période est utile mais coûteux. Ici, nous décrivons une méthode d’imagerie basée sur un smartphone pour enregistrer l’évitement de pelouse chez C. elegans. La méthode ne nécessite qu’un smartphone et un boîtier lumineux à diodes électroluminescentes (LED) pour servir de source de lumière transmise. En utilisant des applications gratuites de caméra time-lapse, chaque téléphone peut imager jusqu’à six plaques, avec une netteté et un contraste suffisants pour compter manuellement les vers à l’extérieur de la pelouse. Les films résultants sont transformés en fichiers d’entrelacement audio-vidéo (AVI) de 10 s pour chaque point horaire horaire, puis recadrés pour montrer chaque plaque afin de les rendre plus faciles à compter. Cette méthode est un moyen rentable pour ceux qui cherchent à examiner les défauts d’évitement et peut potentiellement être étendue à d’autres tests de C. elegans.

Introduction

Parmi les nombreux avantages de l’étude de C. elegans, son système nerveux simple offre la possibilité d’étudier comment les changements au niveau génétique et cellulaire affectent la fonction du réseau et le rendement comportemental. Malgré un nombre limité de neurones, C. elegans présente un large éventail de comportements complexes. L’un d’eux est l’évitement de la pelouse, dans lequel le nématode bactériivore réagit à une source de nourriture nocive en quittant la pelouse bactérienne. C. elegans évite les pelouses de bactéries pathogènes ^1,2,3, les pelouses de bactéries qui produisent des toxines ou sont enrichies de toxines^1,4, et même les bactéries exprimant l’ARNi dont l’élimination du gène cible est préjudiciable à la santé des vers ^4,5. Des études ont montré que les vers répondent à des signaux externes tels que les métabolites produits par les bactéries pathogènes ^1,6, ou les signaux internes qui indiquent que la nourriture les rend malades ^4,7. Ces signaux sont traités par des voies de signalisation conservées, telles que la voie de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) et la voie du facteur de croissance bêta transformant (TGFβ), et nécessitent une communication entre l’intestin et le système nerveux 4,6,7,8.

Bien que le test soit simple, le comportement appris se développe sur de nombreuses heures, souvent du jour au lendemain. Bien qu’il y ait des mutants qui sont incapables de partir, auquel cas marquer l’évitement à un seul moment est suffisant pour démontrer le défaut, de nombreux mutants finissent par partir mais sont plus lents à sortir. Pour ceux-ci, le mouvement des vers doit être suivi toutes les quelques heures, ce qui peut être difficile à faire du jour au lendemain. Le comptage lui-même prend également du temps, créant un décalage entre les plaques, et limitant ainsi le nombre de plaques pouvant être testées en même temps. L’utilisation d’une installation d’imagerie pour enregistrer plusieurs plaques simultanément pendant toute la durée du test serait très utile, mais le coût de l’installation peut être prohibitif, selon la situation financière du laboratoire de recherche.

Pour résoudre ce problème, nous avons mis au point une méthode très simple qui utilise des smartphones pour enregistrer les tests d’évitement. Chaque téléphone peut enregistrer des vidéos time-lapse de jusqu’à six plaques de dosage. Pour fournir de la lumière transmise, nous utilisons un boîtier lumineux à diodes électroluminescentes (LED) qui peut être facilement acheté en ligne. Les plaques d’essai sont placées sur une plate-forme surélevée, soutenue par des tunnels rectangulaires creux, qui concentrent la lumière entrante, créant un contraste. Nous fournissons également un script Python qui convertit les vidéos en fichiers AVI (Audio Video Interleave) montrant des clips de 10 s de chaque point horaire de l’heure. Les vidéos sont ensuite recadrées sur des plaques individuelles et enregistrées dans des fichiers séparés pour être utilisées pour le comptage manuel.

La méthode fournit une procédure peu coûteuse qui est également extrêmement facile à utiliser, en utilisant des articles qui sont facilement disponibles pour la plupart des gens. Ici, nous décrivons la méthode en utilisant le test bien établi d’évitement des pelouses contre l’agent pathogène humain Pseudomonas aeruginosa (PA14), dont le protocole a déjà été décrit ^2,9. Enfin, nous examinons également les considérations et les limites de la méthode d’imagerie pour ceux qui veulent l’appliquer à d’autres expériences comportementales de C. elegans.

Protocole

1. Installation de l’appareil d’imagerie (Figure 1A-E)

1. Assurez-vous qu’un appareil photo de smartphone avec les exigences minimales suivantes est disponible :
   Appareil photo 12 mégapixels (MP)
   Résolution vidéo 1080p
   5 Go d’espace de stockage (la vidéo de 20 min est de 3 à 4 Go)
   Application vidéo time-lapse de la boutique d’applications (applications gratuites disponibles)
2. Placez le boîtier lumineux LED sur le rack inférieur de l’incubateur à 25 °C où le test aura lieu.
3. Pour masquer le motif en pointillés sur la surface lumineuse LED, étalez deux feuilles de mouchoirs pour couvrir toute la surface de la boîte LED.
4. Faire une platine surélevée pour l’échantillon (Figure 1A,D). L’étage surélevé est une feuille de plastique transparente soutenue par des tunnels rectangulaires creux. Les tunnels fonctionnent comme un condensateur pour focaliser la lumière, offrant un meilleur contraste avec l’échantillon (Figure 1C). Assurez-vous que les parois du tunnel sont un peu sombres pour minimiser la diffusion de la lumière. Cette étude a utilisé des boîtes en papier brun. La dimension du tunnel est de 5,5 cm x 17 cm x 4,5 cm (L x L x H). Le boîtier lumineux LED peut accueillir jusqu’à cinq tunnels.
5. Placez un autre rack au-dessus de la scène pour placer les téléphones à enregistrer (Figure 1B,E). Chaque téléphone enregistrera trois à six plaques (une à deux rangées de trois plaques), alors ajustez la hauteur du rack en conséquence. Celle-ci sera située à environ 15 cm au-dessus du spécimen (figure 1B).
6. Placez une multiprise à l’intérieur de l’incubateur pour brancher les téléphones pendant l’enregistrement de nuit.

2. Préparation des tampons et des milieux

1. Préparer le tampon M9 en ajoutant 3 g de KH_2PO4, 6 g de Na2HPO₄, et 5 g de NaCl à 1 L de_H2Odistillé. Stériliser à l’autoclavage à₁₂₁°C pendant 20 min. Refroidir le tampon, puis ajouter 1 mL de 1 M de_MgSO4.
2. Préparer le tampon KPO 4 1 M en ajoutant 108,3 g de KH₂PO 4 et 35,6 g de K2HPO₄ à 1 L de _H2O. Ajustez le pH à 6,0 en ajoutantKOH. Stériliser à l’autoclavage.
3. Préparer la solution de blanchiment des vers en mélangeant 1 mL d’eau de Javel, 0,4 mL de NaOH 1 M et 2,6 mL de_H2O.
4. Préparer des plaques de gélose pour milieu de croissance des nématodes (NGM).
   1. Ajouter 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone de bacto et 17 g de gélose bacto dans une fiole de 3 L. Ajouter 975 ml d’eau distillée et insérer une barre d’agitation.
   2. Stériliser à l’autoclavage, puis refroidir à 55 °C et ajouter 1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans de l’éthanol), 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4 et 25 mL de tampon KPO₄ 1 M (pH_6,0). Remuer pour bien mélanger. Verser dans des assiettes de 6 cm. Laissez les assiettes sécher pendant au moins 2 jours.
5. Ensemencer des plaques de gélose NGM avec OP50 E. coli en pipetant environ 1 mL d’une culture de nuit d’OP50 pour former une pelouse de bactéries. Laisser à température ambiante (RT) jusqu’à ce que vous soyez prêt à être utilisé.

3. Préparation de plaques NGM à haute peptone (pour PA14)

NOTE: Ces plaques doivent être fabriquées au moins 5 jours avant le test.

1. Faire NGM contenant 0,35% de peptone. Mélanger 0,3 g de NaCl, 0,35 g de peptone de bacto et 1,7 g de gélose bacto dans une fiole Erlenmeyer de 250 mL. Ajouter 97,5 ml d’eau distillée et insérer une barre d’agitation.
2. Couvrir l’embouchure de la fiole avec une feuille d’aluminium et un autoclave à 121 °C pendant 20 min.
3. Refroidir à 55 °C et ajouter 0,1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans de l’éthanol), 0,1 mL de 1 M CaCl2, 0,1 mL de 1 M MgSO4 et 2,5 mL de tampon KPO₄ 1 M (pH_6,0). Remuer pour bien mélanger.
4. Verser le NGM à haute peptone dans des boîtes de Petri de 35 mm.
5. Sécher les assiettes pendant au moins 2 jours.

4. Synchroniser les vers par blanchiment

REMARQUE: Commencez cette étape 3 jours avant le test.

1. Prenez des assiettes contenant des vers adultes gravides et rassemblez-les dans un microtube de 1,7 ml en lavant les assiettes avec un tampon M9.
2. Retirer autant de liquide que possible, puis ajouter 400 μL de solution de blanchiment. Attendez environ 4-5 minutes avec des vortex intermittents, jusqu’à ce que les corps des vers adultes se brisent, libérant les œufs.
3. Ajouter un tampon M9 pour remplir le reste du microtube afin de diluer la solution de blanchiment. Rotation à vitesse maximale (12 000 à 13 000 x g) pendant 1-2 s. Retirez le surnageant et lavez trois fois de plus avec le tampon M9.
4. Transférer les œufs dans une boîte de Petri vide de 35 mm contenant du tampon M9. Laisser les œufs éclore pendant la nuit à 20 °C. En l’absence de nourriture, les vers éclos s’arrêteront au stade larvaire L1, synchronisant le stade de développement de tous les vers.
   REMARQUE: Enrober la boîte de Petri de 35 mm avec une solution de gélatine (0,05% de gélatine dans de l’eau autoclavée) peut empêcher les œufs de coller au fond et minimiser la perte d’œufs.
5. Le lendemain, transférer les vers du stade L1 sur des plaques de NGM ensemencées OP50.
6. Incuber les vers à 20 °C pendant 53-54 h jusqu’à ce que les vers atteignent le stade larvaire L4.

5. Préparation de bactéries ( Pseudomonas aeruginosa, PA14)

REMARQUE: Commencez cette étape 4 jours avant le test.

1. Streak a décongelé les bactéries à partir de -80 °C sur une plaque de gélose Luria Bertani (LB) sans antibiotique et incuber pendant une nuit à 37 °C.
   REMARQUE: Utilisez toujours des bactéries fraîches. Les plaques striées doivent être conservées à 4 °C pendant 1 semaine au maximum.
2. Inoculer une seule colonie dans 3 ml de bouillon de roi et cultiver pendant la nuit dans un incubateur à agitation à 37 °C.
3. Le lendemain, ensemencer 7 μL de la culture de nuit sur les plaques NGM à haute peptone et incuber à 37 °C pendant 24 h.
4. Déplacer les plaques ensemencées à TA et incuber pendant encore 24 heures avant utilisation. Une fois prêt, utilisez la plaque dans les 24 heures suivantes.

6. Préparation à l’enregistrement

REMARQUE: Faites-le juste avant le test.

1. Branchez le smartphone sur la multiprise connectée à une prise de courant. Assurez-vous de désactiver le paramètre de verrouillage automatique pour empêcher le téléphone de revenir à l’écran de verrouillage pendant l’enregistrement.
2. Ouvrez l’application de caméra time-lapse et réglez l’intervalle de time-lapse sur 2 s. Réglez la qualité vidéo sur 1080p à 30 ips.
3. Placez le smartphone avec l’écran vers le haut pour enregistrer avec la caméra arrière. Vérifiez l’écran pour vous assurer que les tunnels de la boîte en papier s’insèrent dans le champ de vision.

7. Essai d’évitement de pelouse

1. À l’aide d’un pic en fil de platine, transférer 30 vers synchronisés au stade L4 (53-54 h de L1) sur la plaque PA14. Placez les vers au milieu de la pelouse bactérienne. Pour chaque condition de cette étude, deux plaques ont été testées (c.-à-d. 60 vers par condition).
2. Placez les deux plaques sur la platine surélevée de l’appareil d’enregistrement, le couvercle tourné vers le bas. Le côté avec la gélose sera orienté vers le haut vers la caméra.
3. Sur l’écran du smartphone, appuyez sur l’emplacement de la plaque pour que l’appareil photo puisse effectuer la mise au point sur les plaques d’essai. Il est utile d’avoir une étiquette ou une écriture sur la plaque car l’appareil photo peut l’utiliser pour faire la mise au point correctement.
   REMARQUE: L’écriture sur le fond des plaques n’interfère pas avec l’imagerie des vers tant qu’elle est vers le bord. Heureusement, les vers restent près de la pelouse même après leur départ, de sorte qu’une vue dégagée n’est nécessaire que de la zone immédiate entourant la pelouse.
4. Démarrez l’enregistrement.
5. Une fois l’enregistrement commencé, ajoutez d’autres plaques à la scène. Il peut y avoir un temps de latence important entre les plaques en raison du temps qu’il faut pour transférer les vers par cueillette. Notez le temps de latence par la suite afin que chaque condition puisse être comptée au moment où elle a commencé.
6. Record pendant 20 h à partir du dernier jeu de plaques placées sur la scène. Dans la vidéo finale en accéléré, 20 h d’enregistrement donneront une vidéo de 20 minutes.
   REMARQUE: Il peut être utile de compter les vers directement à partir des plaques après le test, au moins au début pour les premières occasions. Cela peut être comparé aux valeurs obtenues par imagerie vidéo pour s’assurer qu’elles donnent des chiffres similaires.

8. Traitement de la vidéo à l’aide du script Python

1. Transférez le fichier vidéo sur un ordinateur pour traitement. L’extension sera un fichier MOV (iPhone) ou MP4 (Android).
2. Utilisez un code Python pour traiter les vidéos. Le code peut être trouvé à github.com/khyoon201/wormavoid.
3. Pour exécuter les scripts Python, assurez-vous que les éléments suivants sont préinstallés sur l’ordinateur : ffmpeg, un outil de conversion de fichiers vidéo (les instructions d’installation se trouvent sur son site Web, ffmpeg.org/download), et les paquets Python os, pandas, tkinter et ffmpeg-python.
4. Trouvez les dimensions et les coordonnées de chaque plaque à l’aide du script extract_frame.py .
   1. Exécutez le script extract_frame.py . Une fenêtre apparaîtra pour sélectionner le fichier vidéo stocké sur l’ordinateur. Une fois l’exécution terminée, un fichier jpeg portant le même nom apparaîtra dans le même répertoire.
   2. Ouvrez le fichier jpeg dans ImageJ (imagej.org).
   3. Dans le menu, choisissez Analyser > Définir les mesures. Assurez-vous que la case Display Label (Afficher l’étiquette ) est cochée (Figure 2A). Fermez la fenêtre.
   4. À l’aide de l’outil Ligne droite , mesurez le diamètre d’une plaque en traçant une ligne à travers elle, puis en choisissant Analyser > Mesure dans le menu. Si la vidéo est en 1080p, chaque plaque aura une largeur d’environ 480 pixels. Notez ces informations et fermez la fenêtre Résultats .
   5. À l’aide de l’outil Multipoint , marquez les points en haut à gauche de chaque plaque. Ces points deviendront le coin supérieur gauche des vidéos recadrées (Figure 2B). L’ordre est important; dans l’ordre de démarrage des plaques. Après avoir créé un point pour toutes les plaques, choisissez Analyser > mesurer dans le menu. Les mesures, y compris les coordonnées X et Y des points, apparaîtront dans la fenêtre Résultats.
   6. Pour traiter plusieurs vidéos, répétez le processus dans ImageJ avec d’autres fichiers jpeg. Toutes les coordonnées X et Y seront répertoriées dans la même fenêtre de résultats .
   7. Enregistrez la fenêtre Résultats dans un fichier csv. Le fichier doit être enregistré dans le même répertoire que les fichiers vidéo.
5. Trouvez l’heure de début de chaque plaque.
   1. Regardez le film, sur l’ordinateur ou le téléphone, et notez les heures de début de chaque jeu de plaques placées sous l’appareil photo.
   2. Ouvrez le fichier Résultats.csv avec les coordonnées et ajoutez une colonne « start ». Pour chaque ligne correspondant à des plaques individuelles, inscrivez l’heure de début appropriée, en secondes, dans la colonne « début » (par exemple, si l’heure de début est 0:00:08, entrez 8). Sauvegarder.
      Remarque : Le nom de colonne doit être « start » (en minuscules, sans guillemets) pour être reconnu par le script suivant pour le rognage et le rognage.
6. Recadrez et découpez les vidéos.
   1. Exécutez le script crop_n_trim.py .
   2. Lorsque vous y êtes invité, choisissez le fichier Results.csv .
      Remarque : Assurez-vous que le fichier Résultats.csv et tous les fichiers vidéo sont dans le même répertoire.
   3. Entrez les dimensions de la plaque. Entrez la valeur en pixels indiquée précédemment.
      REMARQUE: Le script va maintenant lire chaque ligne du fichier Résultats.csv pour trouver le fichier vidéo correct en lisant le nom du fichier dans la colonne « étiquette » et recadrer selon les coordonnées indiquées dans les colonnes « X » et « Y ». L’heure de début de chaque plaque sera déterminée par l’heure indiquée dans la colonne « début ». Une fois l’exécution du script terminée, un dossier portant le même nom que le film apparaîtra, suivi de l’heure de début (par exemple, « Movie1_8 »), dans lequel des vidéos de 10 s correspondant à chaque point horaire du test seront enregistrées.

9. Comptage manuel à l’aide d’ImageJ

1. Ouvrez chaque fichier AVI dans ImageJ.
2. Comptez les vers visibles à l’extérieur de la pelouse. Les vers qui se chevauchent dans un cadre se séparent généralement dans un autre cadre afin qu’ils puissent être comptés correctement.
3. Calculez le taux d’occupation pour chaque point temporel :
   Taux d’occupation = (vers totaux - nombre de vers à l’extérieur de la pelouse)/vers totaux
   REMARQUE: Les vers entreront et sortiront de la pelouse pendant la vidéo, mais cela ne modifiera pas de manière significative les résultats. Essayez d’utiliser le nombre qui semble être la moyenne, ou le nombre de vers au point horaire exact (5 s dans la vidéo).

Résultats

La première vidéo produite par le script est à 1 h du début du test. La vidéo pendant 0 h n’est pas enregistrée, car les vers commencent le test à l’intérieur de la pelouse, de sorte que le taux d’occupation est toujours de 100%.

Les vers N2 de type sauvage sont comparés aux mutants npr-1, dont le défaut d’évitement de la pelouse est bien établi dans la littérature ^6,10 (Figure 3A-E

Discussion

L’imagerie du comportement des animaux, plutôt que de s’appuyer sur l’observation directe, est non seulement pratique, mais présente également l’avantage de laisser une documentation visuelle. Cela permet une analyse aveugle par une tierce personne objective, ou pourrait même être utilisé pour une analyse automatisée à l’aide de techniques de reconnaissance d’images. Malgré les avantages, l’équipement standard généralement offert est élevé en coût, de sorte que l’on s’engage à la configu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Petri dish	SPL	#10035
Bacto agar	BD	#214010
Bacto Peptone	BD	#211677
CaCl2	DAEJUNG	2507-1400
Cholesterol	BioBasic	CD0122
Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4)	JUNSEI	84120-0350
Glycerol	BioBasic	GB0232
King B Broth	MB cell	MB-K0827
LED light box multi-pad	Artmate	N/A	This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1
MgSO4	DAEJUNG	5514-4400
Plastic paper sleeve (clear)	Smead	#85753	Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	JUNSEI	84185-0350
Power strip			To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets.
Smartphone	N/A	N/A	Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps
Sodium chloride(NaCl)	DAEJUNG	#7548-4100
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)	YAKURI	#31727