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Résumé

Dans cette étude, une application dot-blot a été conçue pour détecter Leptospira dans les trois clades principaux dans des échantillons d’eau. Cette méthode permet d’identifier des quantités minimales d’ADN spécifiquement ciblées par une sonde marquée à la digoxigénine, facilement détectées par un anticorps anti-digoxigénine. Cette approche est un outil précieux et satisfaisant à des fins de dépistage.

Résumé

Le dot-blot est une technique simple, rapide, sensible et polyvalente qui permet d’identifier des quantités minimales d’ADN spécifiquement ciblées par hybridation par sonde en présence d’ADN porteur. Il est basé sur le transfert d’une quantité connue d’ADN sur un support solide inerte, tel qu’une membrane en nylon, à l’aide de l’appareil dot-blot et sans séparation électrophorétique. Les membranes en nylon ont l’avantage d’avoir une capacité de liaison élevée des acides nucléiques (400 μg/cm2), une résistance élevée et une charge positive ou neutre. La sonde utilisée est un fragment d’ADNsb très spécifique de 18 à 20 bases de long marqué à la digoxigénine (DIG). La sonde se conjuguera avec l’ADN de Leptospira . Une fois que la sonde s’est hybridée avec l’ADN cible, elle est détectée par un anticorps anti-digoxigénine, ce qui permet sa détection facile grâce à ses émissions révélées dans un film radiographique. Les points avec une émission correspondront aux fragments d’ADN d’intérêt. Cette méthode utilise le marquage non isotopique de la sonde, qui peut avoir une demi-vie très longue. L’inconvénient de cet immuno-marqueur standard est une sensibilité plus faible que celle des sondes isotopiques. Néanmoins, elle est atténuée par le couplage de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et des tests dot-blot. Cette approche permet l’enrichissement de la séquence cible et sa détection. De plus, il peut être utilisé comme une application quantitative par rapport à une dilution en série d’un étalon bien connu. Une application dot-blot pour détecter Leptospira dans les trois clades principaux dans des échantillons d’eau est présentée ici. Cette méthodologie peut être appliquée à de grandes quantités d’eau une fois qu’elles ont été concentrées par centrifugation pour fournir des preuves de la présence d’ADN leptospiralé. Il s’agit d’un outil précieux et satisfaisant à des fins de dépistage général, et il peut être utilisé pour d’autres bactéries non cultivables qui peuvent être présentes dans l’eau, améliorant ainsi la compréhension de l’écosystème.

Introduction

La leptospirose chez l’homme provient principalement de sources environnementales 1,2. La présence de Leptospira dans les lacs, les rivières et les ruisseaux est un indicateur de la transmission de la leptospirose chez les animaux sauvages et les animaux domestiques et de production qui peuvent éventuellement entrer en contact avec ces plans d’eau 1,3,4. De plus, Leptospira a été identifié dans des sources non naturelles, notamment dans les eaux usées, l’eau stagnante et l’eau du robinet 5,6.

Leptospira est une bactérie distribuée dans le monde entier 7,8, et le rôle de l’environnement dans sa préservation et sa transmission a été bien reconnu. Leptospira peut survivre dans l’eau potable sous un pH variable et des minéraux9, et dans des plans d’eau naturels1. Il peut également survivre pendant de longues périodes dans l’eau distillée10, et sous un pH constant (7,8), il peut survivre jusqu’à 152 jours11. De plus, Leptospira peut interagir dans des consortiums bactériens pour survivre à des conditions difficiles12,13. Il peut faire partie de biofilms en eau douce avec Azospirillum et Sphingomonas et est même capable de croître et de supporter des températures supérieures à 49 °C14,15. Il peut également se multiplier dans un sol gorgé d’eau et rester viable jusqu’à 379 jours16, préservant sa capacité à provoquer la maladie jusqu’à un an17,18. Cependant, on sait peu de choses sur l’écologie des masses d’eau et sur la façon dont elle y est distribuée.

Depuis sa découverte, l’étude du genre Leptospira s’est basée sur des tests sérologiques. Ce n’est qu’au cours du siècle actuel que les techniques moléculaires sont devenues plus répandues dans l’étude de ce spirochète. Le dot-blot a été à peine utilisé pour son identification à l’aide (1) d’une sonde isotopique basée sur l’ARNr 16S et sur une répétition de séquence inter-simple (ISSR)19,20, (2) en tant qu’immunodosage basé sur le nanogold pour la leptospirose humaine appliquée à l’urine21, ou (3) en tant que test basé sur des anticorps pour des échantillons d’urine bovine22. La technique est tombée en désuétude car elle était à l’origine basée sur des sondes isotopiques. Cependant, il s’agit d’une technique bien connue qui, associée à la PCR, donne de meilleurs résultats et est considérée comme sûre en raison de l’utilisation de sondes non isotopiques. La PCR joue un rôle crucial dans l’enrichissement de l’ADN de Leptospira en amplifiant un fragment d’ADN spécifique qui peut être trouvé à l’état de traces dans un échantillon. Au cours de chaque cycle de PCR, la quantité du fragment d’ADN ciblé est doublée dans la réaction. À la fin de la réaction, l’amplicon a été multiplié par un facteur de plus d’un million23. Le produit amplifié par PCR, souvent non visible dans l’électrophorèse de l’agarose, devient visible par hybridation spécifique avec une sonde marquée DIG dans le dot-blot 24,25,26.

La technique dot-blot est simple, robuste et adaptée à de nombreux échantillons, ce qui la rend accessible aux laboratoires disposant de ressources limitées. Il a été utilisé dans une variété d’études sur les bactéries, y compris (1) les bactéries buccales27, (2) d’autres types d’échantillons tels que les aliments et les matières fécales28, et (3) l’identification de bactéries incultivables29, souvent en accord avec d’autres techniques moléculaires. Parmi les avantages offerts par la technique dot-blot figurent : (1) La membrane a une capacité de liaison élevée, capable de lier plus de 200 μg/cm2 d’acides nucléiques et jusqu’à 400 μg/cm2 ; (2) Les résultats Dot-blot peuvent être interprétés visuellement sans nécessiter d’équipement spécial, et (3) ils peuvent être stockés pendant des années à température ambiante (RT).

Le genre Leptospira a été classé en clades pathogènes, intermédiaires et saprophytes30,31. La distinction entre ces clades peut être obtenue sur la base de gènes spécifiques tels que lipL41, lipL32 et l’ARNr 16S. LipL32 est présent dans les clades pathogènes et présente une grande sensibilité dans divers outils sérologiques et moléculaires, alors qu’il est absent chez les espèces de saprophytes21. Le gène ménager lipL41 est connu pour son expression stable et utilisé dans les techniques moléculaires32, tandis que le gène de l’ARNr 16S est utilisé pour leur classification.

Cette méthodologie peut être appliquée à de grands volumes d’eau une fois qu’ils ont été concentrés par centrifugation. Il permet d’évaluer différents points et profondeurs au sein d’un plan d’eau afin de détecter la présence d’ADN leptospiralé et du clade auquel il appartient. Cet outil est précieux à des fins de dépistage écologique et général et peut également être utilisé pour détecter d’autres bactéries non cultivables qui peuvent être présentes dans l’eau.

De plus, les tests PCR et dot-blot sont techniquement et économiquement abordables pour un large éventail de laboratoires, même ceux qui ne disposent pas d’équipements sophistiqués ou coûteux. Cette étude vise à appliquer le dot-blot à base de digoxigénine pour l’identification des trois clades de Leptospira dans des échantillons d’eau prélevés dans des plans d’eau naturels.

Souches bactériennes
Douze sérovars de Leptospira (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi et Wolffi) ont été inclus dans cette étude. Ces sérotypes font partie de la collection du Département de microbiologie et d’immunologie de la Faculté de médecine vétérinaire et de zootechnie de l’Université nationale autonome du Mexique, et ils sont actuellement utilisés dans le test de microagglutination (MAT).

Tous les sérotypes de Leptospira ont été cultivés dans l’EMJH, et leur ADN a été extrait à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN commerciale (voir le tableau des matériaux). Un mélange d’ADN génomique des douze sérovars a été utilisé comme contrôle positif pour le clade pathogène de Leptospira . En tant que contrôle positif du clade intermédiaire de Leptospira , l’ADN génomique de la souche BUT6 du sérotype Hurstbridge de Leptospira fainei a été inclus, et en tant que contrôle positif du clade des saprophytes de Leptospira , l’ADN génomique de la sérotype de Leptospira biflexa de la souche Patoc I a également été inclus.

Les témoins négatifs étaient constitués d’un plasmide vide, d’ADN provenant de bactéries non apparentées (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii et Escherichia coli) et d’eau de qualité PCR, qui a servi de témoin non matriciel.

Échantillons d’eau
Douze échantillons choisis ont été prélevés à l’aide d’une méthode d’échantillonnage stratifié-aléatoire du Centre de recherche biologique et aquacole de Cuemanco (CIBAC) (19° 16' 54 » N 99° 6' 11 » O). Ces échantillons ont été obtenus à trois profondeurs : superficielle, 10 et 30 cm (figures 1A, B). Les procédures de collecte de l’eau n’ont eu aucun impact sur les espèces menacées ou protégées. Chaque échantillon a été prélevé dans un tube à microcentrifuger stérile de 15 ml. Pour recueillir l’échantillon, chaque tube a été doucement immergé dans l’eau, rempli à la profondeur sélectionnée, puis scellé. Les échantillons ont été maintenus à 22 °C et rapidement transportés au laboratoire pour être traités.

Chaque échantillon a été concentré par centrifugation dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL à 8000 x g pendant 20 min à température ambiante. Cette étape a été répétée jusqu’à ce que tous les échantillons soient concentrés dans un seul tube, qui a ensuite été utilisé pour l’extraction de l’ADN (figure 1C).

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Figure 1 : Concentration des échantillons d’eau par centrifugation. (A) Bassins d’échantillonnage d’eau, et (B) Cours d’eau naturels. (C) Traitement d’échantillons d’eau par centrifugation en plusieurs étapes autant de fois que nécessaire (n). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Extraction de l’ADN
L’ADN total a été isolé à l’aide d’un kit d’ADN génomique commercial conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Les extractions d’ADN ont été éluées dans 20 μL de tampon d’élution, et la concentration d’ADN a été déterminée par un spectrophotomètre UV à 260-280 nm, et stockée à 4 °C jusqu’à l’utilisation.

Amplification par PCR
Les cibles de la PCR étaient les 16 gènes de l’ARNrS, lipL41 et lipL32, qui identifient l’ADN du genre Leptospira et permettent de distinguer les trois clades : pathogène, saprophyte et intermédiaire. Les conceptions des amorces et des sondes étaient basées sur les travaux antérieurs d’Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., et Branger et al.33,34,35,36,37. La séquence de chaque sonde, amorce et fragment amplifié est décrite dans le Tableau 1, et leur alignement avec les séquences de référence est fourni dans le Fichier supplémentaire 1, le Fichier supplémentaire 2, le Fichier supplémentaire 3, le Fichier supplémentaire 4 et le Fichier supplémentaire 5. Les réactifs de PCR et les conditions de thermocyclage sont décrits dans la section protocole.

Les produits d’amplification ont été visualisés par séparation électrophorétique sur un gel d’agarose à 1 % dans un TAE (40 mM de base Tris, 20 mM d’acide acétique et 1 mM d’EDTA ; pH 8,3), à 60 V pendant 45 min avec détection au bromure d’éthidium, comme le montre la figure supplémentaire 1. L’ADN génomique obtenu à partir de chaque sérotype a été utilisé avec des concentrations allant de 6 x 106 à 1 x 104 copies équivalentes génomiques (GEq) dans chaque réaction PCR, sur la base de la taille du génome de L. interrogans (4 691, 184 pb)38 pour Leptospira pathogène, de la taille du génome de L. biflexa (3 956, 088 pb)39 pour Leptospira saprophyte, et la taille du génome de la souche BUT6 du sérovar de L. fainei Hurstbridge (4 267, 324 pb) avec le numéro d’accession AKWZ00000000,2.

La sensibilité des sondes a été évaluée à l’aide de l’ADN de chaque sérotype pathogène, de la souche sérovar Patoc I de L. biflexa et de la souche BUT6 de Hurstbridge sérovar de L. fainei . Pour évaluer la spécificité de la PCR et de l’essai d’hybridation par transfert de points, on a inclus de l’ADN de bactéries non apparentées.

Tableau 1 : Amorces et sondes PCR pour amplifier les produits d’identification des clades pathogènes, saprophytes et intermédiaires de Leptospira. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Essai d’hybridation dot-blot
La technique est appelée dot-blot car les trous dans lesquels l’échantillon d’ADN est placé ont une forme de point, et lorsqu’ils sont aspirés pour être fixés en place par aspiration sous vide, ils acquièrent cette forme. Cette technique a été mise au point par Kafatos et al.40. La technique permet la semi-quantification de Leptospira dans chaque échantillon positif à la PCR. Le protocole consiste en une dénaturation avec du NaOH 0,4 M à température ambiante, des échantillons avec de l’ADN de Leptospira de 30 ng à 0,05 ng, correspondant à 6 x 106 à 1 x 104 leptospires, sont tamponnés sur une membrane en nylon avec un appareil de transfert de points de 96 puits. Après l’immobilisation, l’ADN est lié à la membrane par l’exposition à une lumière UV de 120 mJ. Chaque sonde d’ADN est conjuguée avec la digoxigénine-11 dUTP par une étape de catalyse terminale de la transférase à l’extrémité 3' (la digoxigénine est un stéroïde végétal obtenu à partir de Digitalis purpurea, utilisé comme rapporteur41). Suite à l’hybridation rigoureuse de la sonde d’ADN marquée (50 pmol) à la température spécifique sur l’ADN cible, les hybrides d’ADN sont visualisés par la réaction de chimiluminescence avec l’anticorps anti-digoxigénine phosphatase alcaline conjugué de manière covalente avec son substrat CSPD. La luminescence est capturée par l’exposition à un film radiographique (figure 2).

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Figure 2 : Étapes de la procédure pour le test PCR-dot-blot. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

1. Préparation de l’échantillon

  1. Concentrer chaque échantillon d’eau dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL par centrifugation à 8 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Répétez cette étape, autant de fois que nécessaire, pour concentrer l’échantillon dans un volume de 250 μL.
  2. Utilisez le kit d’extraction d’ADN conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
  3. Effectuez la PCR spécifique en fonction de la sonde dot-blot qui sera utilisée (Tableau 1).
    1. Effectuez les amplifications dans des tubes PCR d’un volume final de 25 μL contenant 1 tampon X, 2,5 unités de Taq polymérase, 1 μM de chaque amorce, 0,2 mM de chaque dNTP, 1,5 mM MgCl2 et 100 ng d’ADN cible de chaque échantillon d’eau ou ADN génomique de référence.
    2. Programmer la réaction de PCR dans un thermocycleur en fonction des conditions de thermocyclage (Tableau 2).
    3. Conservez les réactions à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
  4. Placez 10 μL de chaque produit PCR à éponger dans un puits séparé d’une plaque à 96 puits.
  5. Ajouter 40 μL d’ÉT dans chaque puits et mélanger par pipetage.
    REMARQUE : La plaque à 96 puits peut être scellée et stockée à 4 °C pendant la nuit. Suivez les instructions fournies dans le Fichier supplémentaire 6 pour préparer les tampons et les solutions pour le protocole. La figure 3 illustre les étapes de la préparation des échantillons.

Tableau 2 : Conditions de thermocyclage par PCR pour les gènes 16S, lipL41 et lipL32. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Figure 3 : PCR et préparation de l’échantillon. En appliquant le protocole spécifique de PCR, le produit de PCR a été transféré sur une plaque de microtitration et 40 μL d’ET ont été ajoutés à chaque puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Assemblage de l’appareil dot-blot

REMARQUE : L’assemblage de l’appareil dot-blot est illustré à la figure 4. Pendant la procédure, portez des gants pour manipuler les solutions alcalines et protéger la membrane en nylon de la contamination.

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Figure 4 : Assemblage de l’appareil Dot-blot. Le papier filtre et la membrane en nylon (préalablement humidifiée dans 10 X SSPE) doivent être disposés dans le bon ordre. L’ensemble doit être fermement fixé avec les vis avant d’appliquer le vide. Chaque puits doit être lavé avec de l’ÉT, et les produits PCR sont chargés dans leurs puits respectifs. Après avoir transféré le produit PCR à travers la membrane, chaque puits est lavé à nouveau avec du TE et laissé sécher. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Coupez la membrane en nylon (voir tableau des matériaux) et le papier filtre en feuilles de 12 x 8,5 cm.
  2. Marquez la membrane avec un marqueur permanent.
  3. Faites une encoche avec des ciseaux sur un bord pour indiquer la bonne orientation. Utilisez la marque pour vous souvenir de la commande de l’échantillon.
  4. Humidifier la membrane et le papier filtre avec 10 tampons salins-phosphate de sodium-EDTA (SSPE ; 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4 et 0,02 M EDTA, pH 7,4) (Dossier supplémentaire 6). Manipulez la membrane à l’aide d’une pince à épiler propre à bout émoussé.
  5. Assemblez la chambre dot-blot ; Tout d’abord, le papier filtre, puis la membrane sur le joint en plastique. Fixez le couvercle avec les vis de manière transversale.
  6. Raccordez la chambre à l’aspirateur, placez 100 μL d’ÉT dans chaque puits, maintenez l’aspirateur pendant 1 min, puis arrêtez-le.
  7. Mettre le vide à basse vitesse et charger 50 μL de chaque échantillon dans le puits correspondant sur la membrane de l’appareil dot-blot (en suivant la distribution membranaire prédéterminée).
    REMARQUE : Homogénéiser chaque échantillon dans la plaque d’hémagglutination à 96 puits avant de le placer dans la chambre dot-blot.
  8. Laissez l’aspirateur sécher la membrane. Si nécessaire, frappez doucement la chambre pour libérer les bulles dans l’échantillon.
  9. Lavez bien chacun en y plaçant 100 μL de TE avec un aspirateur continu et en le laissant sécher.
    REMARQUE : Une fois le transfert terminé, il est crucial d’arrêter d’abord la pompe et de la détacher. Le non-respect de cette consigne peut entraîner la pénétration d’un reflux dans l’appareil. L’ADN n’a pas besoin d’une étape de dénaturation si une membrane en nylon chargée positivement est utilisée, mais si l’on utilise un autre support inerte, une étape de pré-dénaturation et une dénaturation à base d’alcalis peuvent être nécessaires41.

3. Dénaturation et fixation de l’ADN

REMARQUE : La figure 5 illustre la procédure de fixation de la membrane d’ADN.

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Figure 5 : Procédure de fixation de l’ADN et de la membrane. L’ADN est dénaturé dans une solution alcaline. Ensuite, il est neutralisé avec 10 X SSPE et la membrane est séchée. Ensuite, la membrane est transilluminée. La membrane est réhydratée avec 2 X SSPE et pré-hybridée pendant la nuit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Incuber la membrane avec 0,4 M de NaOH pendant 10 min à température ambiante.
  2. Équilibrez la membrane avec 10 X SSPE pendant 10 min à température ambiante.
  3. Sécher la membrane à 80 °C pendant 2 h.
  4. Transilluminatez avec une lumière UV de 120 mJ pendant 3 min. Assurez-vous que les échantillons sont orientés face vers le bas vers la source de lumière UV. Si vous utilisez un réticulant UV, vérifiez que les échantillons sont orientés vers le haut et répétez cette étape deux fois.
    REMARQUE : La membrane doit être complètement sèche avant la réticulation UV. L’ADN sera immobilisé par une liaison covalente à la membrane en nylon. Chaque réticulation prend environ 18'' à 1' avec une dose d’irradiation UV optimale, pour la plupart des expériences d’hybridation, d’environ 0,6-0,8 kJ/m2.
    L’exposition aux rayons UV est nocive pour les yeux et la peau. Portez un équipement de protection approprié et évitez de vous exposer à la peau nue.
  5. Laver la membrane avec 2 X SSPE pendant 10 min.
  6. Pliez soigneusement la membrane et insérez-la dans le tube d’hybridation (utilisez un tube de microcentrifugation de 15 ml).
  7. Ajouter 10 mL de la solution de préhybridation (Fichier supplémentaire 6) dans le tube et incuber à 42 °C pendant la nuit. Assurez-vous que le tube a été correctement scellé pour éviter toute fuite.

4. Hybridation

  1. Retirer 5 mL de la solution de pré-hybridation du tube d’hybridation. Pour utiliser les 5 ml une deuxième fois, conservez-les dans un autre tube et conservez-les à -4 °C.
  2. Ajouter 15 μL de la sonde étiquetée (tableau 1) dans le tube d’hybridation. Rincez l’embout dans la solution pour vous assurer que la sonde étiquetée a été bien instillée dans la dilution.
    REMARQUE : La liaison de la sonde d’ADN n’est pas aussi forte que celle de la liaison antigène-anticorps. Par conséquent, les changements dans la concentration de la sonde ou de l’ADN dans l’échantillon peuvent influencer l’intensité de la fluorescence émise. Les sondes d’ADN sont stœchiométriques, c’est-à-dire que le nombre de molécules de sonde liées à l’ADN est équivalent au nombre de molécules d’ADN présentes dans la solution. La figure 6 illustre l’hybridation de la sonde.
  3. Incuber à 42 °C pendant la nuit.
  4. Effectuer le marquage DIG de la sonde ADN. Suivez les instructions spécifiées dans le tableau 3 pour mélanger les réactifs, puis incubez le mélange à 37 °C pendant 1 h. Ensuite, ajoutez 80 μL d’eau distillée et stockez la sonde à queue à 4 °C.

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Figure 6 : Hybridation de la sonde. Le volume du tampon d’hybridation est ajusté et la sonde marquée à la digoxigénine est incorporée pour permettre l’hybridation de la sonde pendant la nuit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 3 : Réactifs pour le marquage des sondes à la digoxigénine (DIG). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

5. Chimiluminescence (marquage anti-DIG)

  1. Lavez la membrane deux fois avec 2 X SSPE/0,1 % SDS à température ambiante pendant 10 min.
  2. Incuber la membrane avec 5 X SSPE/0,1 % SDS à la température de recuit de la sonde pendant 15 min.
    REMARQUE : Dans cette étape, utilisez un récipient avec un couvercle pour maintenir la température aussi longtemps que possible. Assurez une température uniforme et constante sur toute la membrane. Le volume approximatif de chaque lavage est de 100 mL de la solution indiquée.
  3. Lavez la membrane une fois avec le tampon 1 (fichier supplémentaire 6) à température ambiante pendant 5 min.
  4. Laver la membrane une fois avec le tampon 2 (fichier supplémentaire 6) à température ambiante pendant 30 min.
  5. Lavez la membrane avec le tampon 2 et ajoutez l’anticorps anti-digoxigénine (15 μL) (voir le tableau des matériaux), puis incubez pendant 45 min (le temps d’incubation peut varier de 30 à 60 min). Cet anticorps secondaire marque la sonde pour la détection.
    REMARQUE : La membrane peut être stockée dans le tampon 2 avec l’anticorps anti-digoxigénine pendant une nuit à 4-8 °C. Le marquage anti-DIG du processus de chimiluminescence est illustré à la figure 7.

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Figure 7 : Marquage anti-DIG du procédé de chimiluminescence. Les acides nucléiques non liés sont éliminés avec des solutions tampons. La sonde est alignée avec l’ADN cible et l’excédent est éliminé. La membrane est bloquée avec le tampon de blocage 1 X, et l’anticorps anti-DIG est ajouté (1:10000). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Chimiluminescence (application sur substrat)

  1. Lavez la membrane deux fois dans le tampon 1 à température ambiante pendant 15 min.
  2. Laver une fois dans le tampon 3 (voir fichier supplémentaire 6) à température ambiante pendant 5 min, en laissant la membrane drainer la majeure partie du tampon, le laissant presque sec.
  3. Ajouter le CSPD prêt à l’emploi (phosphate de phényle disodique 3-(4-méthoxyspiro {1,2-dioxétane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] décan}-4-yl), voir le tableau des matériaux), et laisser reposer pendant 5 min, (avec les doigts humides, homogénéiser le CSPD d’un côté à l’autre).
  4. Placez la membrane dans un sac en plastique transparent (12,5 x 9 cm) qui s’adapte aux dimensions de la membrane. Éliminez soigneusement les bulles d’air, répartissez uniformément le CSPD et thermoscellez le sac.
  5. Incuber la membrane dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 minutes (cela peut aller jusqu’à 30 minutes) et assurez-vous que la membrane contenant les échantillons est placée vers le bas afin qu’elle soit bien immergée. Assurez-vous que la température reste constante et bien répartie sur la membrane.
  6. Séchez le sac en plastique et fixez-le avec du scotch sur un film radiographique déjà utilisé. Cela permettra une manipulation facile pendant la procédure d’exposition.
    REMARQUE : La figure 8 montre l’application du procédé de chimiluminescence sur substrat.

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Figure 8 : Application du procédé de chimiluminescence sur substrat. L’anticorps libre est retiré et le substrat CSPD (1:250) est ajouté à la membrane. La réaction est activée par l’incubation à 37 °C et la membrane est disposée de manière à enregistrer la chimiluminescence dans un film radiographique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

7. Chimiluminescence (détection)

  1. Effectuez la procédure d’exposition. Dans la chambre noire, préparez les solutions de développement et de fixation (voir tableau des matériaux) dans les plateaux respectifs.
  2. Dans l’obscurité, placez soigneusement la membrane fixe face à un nouveau film radiographique et insérez-la dans une cassette radiographique (voir tableau des matériaux).
  3. Enregistrez le temps d’exposition. Le temps d’exposition peut varier de 1 min à 30 min ou plus. Commencez par 5 minutes et ajustez le temps en conséquence.
  4. Humidifier le film radiographique dans une solution de révélateur pendant 1 à 3 min et rincer doucement à l’eau du robinet (15-45 s).
  5. Humidifier le film radiographique dans une solution fixatrice pendant 1 à 3 min et rincer doucement à l’eau du robinet (45 s).
  6. Laissez le film radiographique sécher à l’air libre et documentez le test dans une boîte à lumière blanche visible.
    REMARQUE : Évitez de secouer la membrane pendant le temps d’exposition aux rayons X. Le processus de détection est illustré à la figure 9.
  7. Passez à l’interprétation du résultat. Dans le film radiographique exposé, les points avec émission peuvent être localisés visuellement et correspondent aux fragments d’ADN avec hybridation de la sonde. L’intensité du signal émis dépend de la luminescence et de la durée de l’exposition.
    REMARQUE : Les membranes peuvent être stockées séchées entre du papier filtre pendant plusieurs mois à température ambiante.

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Figure 9 : Détection du processus de chimiluminescence. Dans des conditions sombres, la membrane est exposée à un film radiographique à l’intérieur d’une cassette à rayons X. Ensuite, on l’a laissé reposer pendant le temps d’exposition, puis le film radiographique a été développé et fixé. Enfin, il a été séché à l’air libre et interprété. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

8. Procédure de déshybridation membranaire

  1. Lavez la membrane deux fois pendant 10 minutes avec de l’eau distillée.
  2. Laver la membrane pendant 20 min avec 0,4 M de NaOH à 53 °C (deux fois).
  3. Lavez deux fois la membrane pendant 10 min avec 2 X SSPE.
  4. Laissez la membrane sécher à température ambiante.
  5. Conservez la membrane et revenez à l’étape 3.5 du protocole.
    REMARQUE : La membrane peut être stockée dans le tampon de pré-hybridation pendant la nuit à 4-8 °C. Le lendemain, redémarrer avec une incubation à 42 °C pendant 1 h, permettant au tampon de pré-hybridation d’atteindre la température. Ensuite, passez à l’étape 3.5 du protocole.

Résultats

Pour évaluer l’efficacité de la technique, l’ADN génomique de cultures pures de chaque sérovar de Leptospira a été utilisé, ainsi que la sonde spécifique au clade. Des membranes ont été préparées avec 100 ng d’ADN génomique par réaction PCR pour chaque sérotype, suivis de huit ADN génomiques de bactéries non apparentées et de concentrations variables d’ADN génomique des sérovars ad hoc de Leptospira. Chaque test comprenait des contrôles positifs, négatifs et non matrimoniau...

Discussion

Les étapes critiques de la technique dot-blot comprennent (1) l’immobilisation de l’ADN, (2) le blocage des sites de liaison libres sur la membrane avec de l’ADN non homologue, (3) la complémentarité entre la sonde et le fragment cible dans des conditions de recuit, (4) l’élimination de la sonde non hybridée et (5) la détection de la molécule rapporteure41.

La PCR-Dot-blot présente certaines limites, telles que la technique ne fournit pas d’information...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous sommes redevables à la collection Leptospira du Département de Microbiologie et d’Immunologie, Faculté de Médecine Vétérinaire et de Zootechnie, Université Nationale Autonome du Mexique. Nous sommes reconnaissants pour le généreux don des souches de référence Leptospira  ; Leptospira fainei sérovar Hurstbridge souche BUT6 et Leptospira biflexa sérovar Patoc souche Patoc I au Dr Alejandro de la Peña Moctezuma. Nous remercions le Dr José Antonio Ocampo Cervantes, le coordinateur du CIBAC, et le personnel pour leur soutien logistique. EDT s’inscrivait dans le cadre du programme Terminal Project pour les étudiants de premier cycle de l’Université autonome métropolitaine-Campus Cuajimalpa. Nous remercions le logiciel Biorender.com pour la création des figures 1 et 3 à 9.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Purelink DNA extraction kitInvitrogenK182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)PromegaM3001
Whatman filter paper, grade 1,MerkWHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 mRoche11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibodyRoche11093274910
Medium Base EMJHDifcoS1368JAA
Leptospira Enrichment EMJHDifcoBD 279510
Blocking ReagentRoche11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphateMerk11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring spermSigma AldrichD3159
Developer CarestreamCarestream Health IncGBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTPRoche11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)PromegaH5032
Ficoll 400Sigma AldrichF8016
Fixer CarestreamCarestream Health IncGBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNaSigma AldrichL5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONaSigma AldrichL-9150It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40)Sigma AldrichPVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)Sigma Aldrich9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl)Sigma Aldrich7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma Aldrich151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma Aldrich1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)Sigma-Aldrich7558-79-4
Terminal transferase, recombinantRoche3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl)Sigma-Aldrich1185-53-1
SSPE 20XSigma-AldrichS2015-1LIt can be Home-made following Supplementary File 6
PrimersSigma-AldrichOn demandFollow table 1
ProbesSigma-AldrichOn demandFollow table 1
Equipment
Nanodrop™ One SpectrophotometerThermo-ScientificND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpmSigma-Aldrich1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µlGilsonSKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)AxygenMCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved)Axygen3208
Disposable Pipette tips 1-10 µlAxygenT-300
Disposable Pipette tips 1-200 µlAxygenTR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-DotBIORAD1706545
Portable Hergom SuctionHergom7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)HoeferPH90-115V
UV CrosslinkerHoeferUVC-500
Thermo Hybaid PCR Express ThermocyclerHybaidHBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17Fuji

Références

  1. Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055 (2020).
  2. Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387, 65-97 (2015).
  3. Tripathy, D. N., Hanson, L. E. Leptospires from water sources at Dixon Springs Agricultural Center. Journal of Wildlife Diseases. 9 (3), 209-212 (1973).
  4. Smith, D. J., Self, H. R. Observations on the survival of Leptospira australis A in soil and water. The Journal of Hygiene. 53 (4), 436-444 (1955).
  5. Karpagam, K. B., Ganesh, B. Leptospirosis: a neglected tropical zoonotic infection of public health importance-an updated review. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 39 (5), 835-846 (2020).
  6. Casanovas-Massana, A., et al. Spatial and temporal dynamics of pathogenic Leptospira in surface waters from the urban slum environment. Water Research. 130, 176-184 (2018).
  7. Costa, F., et al. Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003898 (2015).
  8. Mwachui, M. A., Crump, L., Hartskeerl, R., Zinsstag, J., Hattendorf, J. Environmental and behavioural determinants of Leptospirosis transmission: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003843 (2015).
  9. Andre-Fontaine, G., Aviat, F., Thorin, C. Waterborne Leptospirosis: Survival and preservation of the virulence of pathogenic Leptospira spp. in fresh water. Current Microbiology. 71 (1), 136-142 (2015).
  10. Trueba, G., Zapata, S., Madrid, K., Cullen, P., Haake, D. Cell aggregation: A mechanism of pathogenic Leptospira to survive in freshwater. International Microbiology: the Official Journal of the Spanish Society for Microbiology. 7 (1), 35-40 (2004).
  11. Smith, C. E., Turner, L. H. The effect of pH on the survival of leptospires in water. Bulletin of the World Health Organization. 24 (1), 35-43 (1961).
  12. Barragan, V. A., et al. Interactions of Leptospira with environmental bacteria from surface water. Current Microbiology. 62 (6), 1802-1806 (2011).
  13. Abdoelrachman, R. Comparative investigations into the influence of the presence of bacteria on the life of pathogenic and apathogenic leptospirae. Antonie van Leeuwenhoek. 13 (1), 21-32 (1947).
  14. Singh, R., et al. Microbial diversity of biofilms in dental unit water systems. Applied and Environmental Microbiology. 69 (6), 3412-3420 (2003).
  15. Kumar, K. V., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. Coexistence and survival of pathogenic leptospires by formation of biofilm with Azospirillum. FEMS Microbiology Ecology. 91 (6), 051 (2015).
  16. Yanagihara, Y., et al. Leptospira Is an environmental bacterium that grows in waterlogged soil. Microbiology Spectrum. 10 (2), 0215721 (2022).
  17. Gillespie, R. W., Ryno, J. Epidemiology of leptospirosis. American Journal of Public Health and Nation’s Health. 53 (6), 950-955 (1963).
  18. Bierque, E., et al. Leptospira interrogans retains direct virulence after long starvation in water. Current Microbiology. 77 (10), 3035-3043 (2020).
  19. Zhang, Y., Dai, B. Marking and detection of DNA of leptospires in the dot-blot and situ hybridization with digoxigenin-labeled probes. Journal of West China University of Medical Sciences. 23 (4), 353-435 (1992).
  20. Mérien, F., Amouriaux, P., Perolat, P., Baranton, G., Saint Girons, I. Polymerase chain reaction for detection of Leptospira spp. in clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 30 (9), 2219-2224 (1992).
  21. Veerapandian, R., et al. Silver enhanced nano-gold dot-blot immunoassay for leptospirosis. Journal of Microbiological Methods. 156, 20-22 (2019).
  22. Junpen, S., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  23. Ishmael, F. T., Stellato, C. Principles and applications of polymerase chain reaction: basic science for the practicing physician. Annals of Allergy, Asthma & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, & Immunology. 101 (4), 437-443 (2008).
  24. Boerner, B., Weigelt, W., Buhk, H. J., Castrucci, G., Ludwig, H. A sensitive and specific PCR/Southern blot assay for detection of bovine herpesvirus 4 in calves infected experimentally. Journal of Virological Methods. 83 (1-2), 169-180 (1999).
  25. Curry, E., Pratt, S. L., Kelley, D. E., Lapin, D. R., Gibbons, J. R. Use of a Combined duplex PCR/Dot-blot assay for more sensitive genetic characterization. Biochemistry Insights. 1, 35-39 (2008).
  26. Pilatti, M. M., Ferreira, S. d. e. A., de Melo, M. N., de Andrade, A. S. Comparison of PCR methods for diagnosis of canine visceral leishmaniasis in conjunctival swab samples. Research in Veterinary Science. 87 (2), 255-257 (2009).
  27. Conrads, G., et al. PCR reaction and dot-blot hybridization to monitor the distribution of oral pathogens within plaque samples of periodontally healthy individuals. Journal of Periodontology. 67 (10), 994-1003 (1996).
  28. Langa, S., et al. Differentiation of Enterococcus faecium from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus strains by PCR and dot-blot hybridisation. International Journal of Food Microbiology. 88 (2-3), 197-200 (2003).
  29. Francesca, C., Lucilla, I., Marco, F., Giuseppe, C., Marisa, M. Identification of the unculturable bacteria Candidatus arthromitus in the intestinal content of trouts using dot-blot and Southern blot techniques. Veterinary Microbiology. 156 (3-4), 389-394 (2012).
  30. Arent, Z., Pardyak, L., Dubniewicz, K., Plachno, B. J., Kotula-Balak, M. Leptospira taxonomy: then and now. Medycyna Weterynaryjna. 78 (10), 489-496 (2022).
  31. Thibeaux, R., et al. Biodiversity of environmental Leptospira: Improving identification and revisiting the diagnosis. Frontiers in Microbiology. 9, 816 (2018).
  32. Carrillo-Casas, E. M., Hernández-Castro, R., Suárez-Güemes, F., de la Peña-Moctezuma, A. Selection of the internal control gene for real-time quantitative RT-PCR assays in temperature treated Leptospira. Current Microbiology. 56 (6), 539-546 (2008).
  33. Azali, M. A., Yean Yean, C., Harun, A., Aminuddin Baki A, N. N., Ismail, N. Molecular characterization of Leptospira spp. in environmental samples from North-Eastern Malaysia revealed a pathogenic strain, Leptospira alstonii. Journal of Tropical Medicine. 2016, 2060241 (2016).
  34. Ahmed, N., et al. Multilocus sequence typing method for identification and genotypic classification of pathogenic Leptospira species. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 5, 28 (2006).
  35. Bourhy, P., Collet, L., Brisse, S., Picardeau, M. Leptospira mayottensis sp. nov., a pathogenic species of the genus Leptospira isolated from humans. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 64, 4061-4067 (2014).
  36. Weiss, S., et al. An extended Multilocus Sequence Typing (MLST) scheme for rapid direct typing of Leptospira from clinical samples. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), e0004996 (2016).
  37. Branger, C., et al. Polymerase chain reaction assay specific for pathogenic Leptospira based on the gene hap1 encoding the hemolysis-associated protein-1. FEMS Microbiology Letters. 243 (2), 437-445 (2005).
  38. Ren, S. X., et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).
  39. Picardeau, M., et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis. PLOS One. 3 (2), e1607 (2008).
  40. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Research. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  41. Bhat, A. I., Rao, G. P. Dot-blot hybridization technique. Characterization of Plant Viruses. , 303-321 (2020).
  42. Yadav, J. P., Batra, K., Singh, Y., Singh, M. Comparative evaluation of indirect-ELISA and Dot-blot assay for serodetection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae antibodies in poultry. Journal of Microbiological Methods. 189, 106317 (2021).
  43. Malinen, E., Kassinen, A., Rinttilä, T., Palva, A. Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria. Microbiology. 149, 269-277 (2003).
  44. Wyss, C., et al. Treponema lecithinolyticum sp. nov., a small saccharolytic spirochaete with phospholipase A and C activities associated with periodontal diseases. International Journal of Systematic Bacteriology. 49, 1329-1339 (1999).
  45. Shah, J. S., I, D. C., Ward, S., Harris, N. S., Ramasamy, R. Development of a sensitive PCR-dot-blot assay to supplement serological tests for diagnosing Lyme disease. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 37 (4), 701-709 (2018).
  46. Niu, C., Wang, S., Lu, C. Development and evaluation of a dot-blot assay for rapid determination of invasion-associated gene ibeA directly in fresh bacteria cultures of E. coli. Folia microbiologica. 57 (6), 557-561 (2012).
  47. Wetherall, B. L., McDonald, P. J., Johnson, A. M. Detection of Campylobacter pylori DNA by hybridization with non-radioactive probes in comparison with a 32P-labeled probe. Journal of Medical Microbiology. 26 (4), 257-263 (1988).
  48. Kolk, A. H., et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a nonradioactive detection system. Journal of Clinical Microbiology. 30 (10), 2567-2575 (1992).
  49. Scherer, L. C., et al. PCR colorimetric dot-blot assay and clinical pretest probability for diagnosis of Pulmonary Tuberculosis in smear-negative patients. BMC Public Health. 7, 356 (2007).
  50. Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. The Clinical Biochemist Reviews. 29, S49-S52 (2008).
  51. Zhang, Y., Dai, B. Detection of Leptospira by dot-blot hybridization with photobiotin- and 32P-labeled DNA. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 130-132 (1992).
  52. Terpstra, W. J., Schoone, G. J., ter Schegget, J. Detection of leptospiral DNA by nucleic acid hybridization with 32P- and biotin-labeled probes. Journal of Medical Microbiology. 22 (1), 23-28 (1986).
  53. Shukla, J., Tuteja, U., Batra, H. V. DNA probes for identification of leptospires and disease diagnosis. The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 35 (2), 346-352 (2004).
  54. Jiang, N., Jin, B., Dai, B., Zhang, Y. Identification of pathogenic and nonpathogenic leptospires by recombinant probes. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 26 (1), 1-5 (1995).
  55. Fach, P., Trap, D., Guillou, J. P. Biotinylated probes to detect Leptospira interrogans on dot-blot hybridization or by in situ hybridization. Letters in Applied Microbiology. 12 (5), 171-176 (1991).
  56. Huang, N., Dai, B. Assay of genomic DNA homology among strains of different virulent leptospira by DNA hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 122-125 (1992).
  57. Dong, X., Dai, B., Chai, J. Homology study of leptospires by molecular hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (1), 1-4 (1992).
  58. Komminoth, P. Digoxigenin as an alternative probe labeling for in situ hybridization. Diagnostic Molecular Pathology: The American Journal of Surgical Pathology, part B. 1 (2), 142-150 (1992).
  59. Saengjaruk, P., et al. Diagnosis of human leptospirosis by monoclonal antibody-based antigen detection in urine. Journal of Clinical Microbiology. 40 (2), 480-489 (2002).
  60. Okuda, M., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of canine Leptospira antibodies using recombinant OmpL1 protein. The Journal of Veterinary Medical Science. 67 (3), 249-254 (2005).
  61. Suwimonteerabutr, J., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  62. Kanagavel, M., et al. Peptide-specific monoclonal antibodies of Leptospiral LigA for acute diagnosis of leptospirosis. Scientific reports. 7 (1), 3250 (2017).
  63. Levett, P. N. Leptospirosis. Clinical Microbiology Reviews. 14 (2), 296-326 (2001).
  64. Monahan, A. M., Callanan, J. J., Nally, J. E. Proteomic analysis of Leptospira interrogans shed in urine of chronically infected hosts. Infection and Immunity. 76 (11), 4952-4958 (2008).
  65. Rojas, P., et al. Detection and quantification of leptospires in urine of dogs: a maintenance host for the zoonotic disease leptospirosis. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 29 (10), 1305-1309 (2010).

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