Un flux de travail semi-automatisé pour la cryoconservation des spermatozoïdes de corail pour soutenir les biobanques et l’aquaculture

Résumé

Ce protocole décrit une voie semi-automatisée pour améliorer l’efficacité et la capacité de traitement et de cryoconservation du sperme d’espèces coralliennes menacées, dans le but de garantir la diversité génétique et de soutenir les efforts de restauration des récifs.

Résumé

Les récifs coralliens sont confrontés à une crise alors que la fréquence des épisodes de blanchissement causés par le réchauffement des océans augmente, entraînant la mort des coraux sur les récifs du monde entier. La perte subséquente de diversité génétique et de biodiversité peut diminuer la capacité des coraux à s’adapter au changement climatique, de sorte que les efforts visant à préserver la diversité existante sont essentiels pour maximiser les ressources disponibles pour la restauration des récifs aujourd’hui et à l’avenir. L’approche la plus efficace pour sécuriser la génétique à long terme est la cryoconservation et la biobanque, qui permettent le stockage congelé d’échantillons vivants à des températures cryogéniques dans de l’azote liquide indéfiniment. La cryoconservation du sperme des coraux est possible depuis 2012, mais la nature saisonnière de la reproduction des coraux signifie que les activités de biobanque sont limitées à quelques nuits par an lorsque le frai a lieu. Il est donc essentiel d’améliorer l’efficacité des flux de travail de traitement et de cryoconservation du sperme corallien pour maximiser ces possibilités limitées de biobanques. À cette fin, nous avons entrepris d’optimiser les voies de traitement de cryoconservation des spermatozoïdes de corail en nous appuyant sur les technologies existantes et en créant une approche semi-automatisée pour rationaliser l’évaluation, la manipulation et la cryoconservation des spermatozoïdes de corail. Le processus, qui combine l’analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdes, des cryoflacons à code-barres et une série de feuilles de données automatiques liées pour une édition simultanée par plusieurs utilisateurs, améliore l’efficacité du traitement des échantillons et de la gestion des métadonnées sur le terrain. Grâce à l’intégration avec des programmes de recherche transversaux tels que le Reef Restoration and Adaptation Program en Australie, la cryoconservation peut jouer un rôle crucial dans les programmes de restauration des récifs à grande échelle en facilitant la gestion génétique des populations aquacoles, en soutenant la recherche visant à améliorer la tolérance thermique et en prévenant l’extinction des espèces coralliennes. Les procédures décrites seront utilisées par les praticiens de la cryoconservation des coraux et des biobanques sur les récifs du monde entier et serviront de modèle pour la transition des technologies de cryoconservation des laboratoires de recherche aux applications à grande échelle.

Introduction

Les récifs coralliens du monde entier connaissent une perte d’espèces coralliennes, de populations et de diversité génétique en raison du réchauffement et de l’acidification des océans causés par le changement climatique, ce qui diminue la viabilité de ces habitats essentiels et a un impact sur les espèces qu’ils abritent ^1,2. L’approche la plus efficace pour sécuriser la génétique à long terme est la cryoconservation et la biobanque, qui permettent le stockage congelé d’échantillons vivants à des températures cryogéniques dans de l’azote liquide^{indéfiniment 3}. Le développement en 2012 de méthodes de cryoconservation des spermatozoïdes de corail⁴ a permis pour la première fois la biobanque de génétique de ces espèces et a conduit au développement de la première biobanque de génétique corallien en 2012⁵. Depuis lors, ce protocole de cryoconservation a été affiné⁶ et utilisé pour sécuriser la génétique de plus de 50 espèces de coraux dans le monde, dont 30 espèces provenant de la Grande Barrière de corail en Australie⁷. Le sperme de corail cryoconservé peut générer des coraux sains qui se développent normalement et ont été utilisés pour faciliter les expériences de flux de gènes assistées en Australie⁸ et dans les Caraïbes⁹. Alors que des technologies sont actuellement en cours de développement pour permettre la cryoconservation de types de tissus complexes tels que les larves¹⁰ et les tissus coralliens adultes^11,12, la cryoconservation des spermatozoïdes de corail est actuellement l’outil le plus établi disponible pour la biobanque de routine de la génétique corallienne.

À mesure que les impacts sur les populations de coraux ont augmenté, plusieurs pays ont lancé des programmes à grande échelle pour soutenir la restauration et l’adaptation des récifs (par exemple, le Reef Restoration and Adaptation Program [RRAP] en Australie¹³) ou pour sécuriser les populations de coraux en péril restantes (par exemple, Florida Coral Rescue aux États-Unis¹⁴). Dans le contexte de ces programmes, la cryoconservation peut être considérée comme une technologie habilitante, soutenant la recherche et la production de coraux à grande échelle, en plus de préserver la diversité génétique existante et de prévenir les extinctions. La cryoconservation des spermatozoïdes peut permettre un meilleur contrôle de la reproduction entre des populations physiquement ou temporellement séparées et peut permettre la gestion génétique des géniteurs pour sélectionner des caractéristiques souhaitables telles que la tolérance thermique ou la résistance aux maladies⁸. À ce jour, la biobanque de sperme de corail a été entreprise à une échelle relativement petite pour soutenir la gestion de la biodiversité⁷, de sorte qu’un certain niveau de mise à l’échelle sera nécessaire si l’on veut que cette biobanque atteigne son potentiel dans le cadre de ces programmes plus vastes de restauration des récifs. Comme pour tous les efforts de restauration des récifs basés sur la reproduction des coraux, le principal obstacle à l’augmentation des efforts de biobanque est la période limitée pendant laquelle les gamètes coralliens sont disponibles, car la ponte de la plupart des espèces de construction de récifs coïncide avec la pleine lune à la fin du printemps et au début de l’été¹⁵, ce qui signifie que les gamètes ne sont disponibles pour la cryoconservation et la biobanque que quelques nuits par an. De plus, dans les régions où la ponte de masse se produit, par exemple la Grande Barrière de corail, plusieurs espèces apparaissent généralement simultanément ou à quelques heures d’intervalle la même nuit¹⁵. Des améliorations à la voie de cryoconservation des spermatozoïdes sont donc nécessaires pour augmenter l’échelle et l’efficacité du traitement afin de maximiser la capacité des biobanques pendant ces brèves fenêtres de ponte annuelles, tout en assurant l’intégrité des échantillons et des métadonnées associées.

La cryoconservation et la biobanque de spermatozoïdes de corail impliquent plusieurs étapes clés, de la collecte des gamètes lors de la ponte à l’accession des échantillons dans la biobanque et la base de données (Figure 1). Le processus commence par la séparation des spermatozoïdes des ovules (chez les espèces hermaphrodites) ou la collecte des spermatozoïdes dans la colonne d’eau (chez les espèces gonochriques), suivie de l’évaluation de la motilité et de la concentration des spermatozoïdes. Les spermatozoïdes sont ensuite associés à un cryoprotecteur (concentration finale de 10 % v/v, diméthylsulfoxyde de méthyle, DMSO) dans de l’eau de mer filtrée (FSW) et refroidis à -20 °C/min dans un dispositif de refroidissement conçu sur mesure⁴. Les premières itérations de ce processus reposaient sur l’évaluation visuelle de la motilité et de la concentration des spermatozoïdes au moyen d’une microscopie à contraste de phase et d’un comptage par hémocytomètre, l’impression et l’étiquetage des tubes pendant le traitement des échantillons pour la cryoconservation, le pipetage manuel des échantillons de sperme dans des cryoflacons et le refroidissement sur un rack^{flottant 16} spécialement conçu. L’application de l’analyse de sperme assistée par ordinateur (CASA)¹⁷ et le développement d’un dispositif de refroidissement imprimé en^3D6 ont amélioré l’efficacité et la fiabilité de la cryoconservation des spermatozoïdes de corail, mais la voie de traitement des échantillons de sperme est restée en grande partie la même depuis sa création. Bien que cette approche convienne au traitement d’échantillons provenant d’un nombre modéré de colonies et d’espèces lors d’une nuit de frai, pour de grands volumes et un grand nombre de colonies (p. ex. échantillons individuels provenant de >10 colonies à la fois), il existe des goulots d’étranglement dans la voie de cryoconservation qui empêchent le traitement des échantillons en temps opportun (c.-à-d. dans les 2 heures suivant la libération des spermatozoïdes) sans dégradation du potentiel de fertilité des échantillons. Bien qu’il existe des systèmes de traitement des fluides à grande échelle pour les cryoflacons (par exemple, Thomas et ^al.18), ils sont généralement conçus pour le traitement de grands lots (c’est-à-dire plusieurs racks de cryoflacons) et ne conviennent pas au transport et à l’utilisation sur le terrain, de sorte qu’ils ne sont pas rentables pour cette application. Par conséquent, la présente étude visait à améliorer l’efficacité de la cryoconservation des spermatozoïdes de corail en introduisant des équipements et des méthodes d’automatisation portables et peu coûteux à des étapes clés du processus de traitement afin de maximiser le nombre d’échantillons qui pourraient être efficacement cryoconservés lors d’une nuit de frai.

Protocole

Les méthodes décrites dans le présent document peuvent être utilisées pour traiter et cryoconserver les spermatozoïdes d’espèces de coraux hermaphrodites et gonochriques. Une introduction générale et une introduction sur le frai des coraux et la collecte de gamètes pour la cryoconservation des spermatozoïdes pour les deux modes de reproduction peuvent être trouvées sur le cours de formation à la cryoconservation des coraux¹⁹ du Smithsonian’s National Zoo & Conservation Biology Institute. Les méthodes décrites ont été principalement développées à l’aide de gamètes provenant de colonies d’Acropora millepora prélevées dans le groupe de l’île Keppel dans la région de la mer de Woppaburra et dans le récif de Davies dans la région de la mer de Bindal, dans la Grande Barrière de corail en Australie. La collecte et l’utilisation de coraux et de gamètes ont été effectuées avec le consentement libre, préalable et éclairé des gardiens traditionnels des pays maritimes concernés. Les réactifs et l’équipement utilisés pour cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Pré-ponte - vérifications du système et préparation de la solution d’activation des spermatozoïdes et du cryodiluant

1. Vérifiez que le lecteur de codes-barres est chargé, actif et configuré pour saisir les données de la feuille de calcul en tant que saisie de cellule horizontale. Consultez le manuel d’utilisation du lecteur de codes-barres pour personnaliser ce paramètre.
2. Préparez des solutions mères concentrées d’activation de spermatozoïdes de corail pour CASA.
   REMARQUE : Des gants jetables doivent être portés lors de la manipulation de produits chimiques pour la préparation de la solution d’activation.
   1. Préparez une solution mère d’albumine sérique bovine (BSA) à 30 % (5 ml) en dissolvant 1,5 g de BSA dans 4 ml d’eau stérile purifiée de culture tissulaire à l’aide d’un chauffe-tube réglé à 37 °C ou en tenant le tube dans les mains en coupe, en agitant doucement périodiquement (ne pas agiter le flacon).
   2. Une fois en solution, porter jusqu’au volume final (5 ml) avec de l’eau de culture tissulaire, étiqueter le tube avec la date et marquer « 30 % BSA in H₂O ».
   3. Conserver au réfrigérateur (4 °C) jusqu’à 2 semaines.
   4. Préparez une solution mère de 60 mM de caféine (25 mL) en dissolvant 0,2913 g de caféine dans 24 mL d’eau de mer filtrée (FSW).
   5. Une fois en solution, porter jusqu’au volume final (25 mL) à l’aide du FSW, étiqueter le tube avec la date et marquer « 60 mM de caféine dans le FSW ».
   6. Conserver au réfrigérateur jusqu’à 1 mois.
      REMARQUE : La solubilité maximale de la caféine dans le FSW est d’environ 71 mM.
3. Préparez une solution de travail d’activation des spermatozoïdes pour les échantillons de sperme à ~10⁹ spermatozoïdes/mL (0,9% BSA + 12 mM de caféine dans le FSW).
   1. Pour une solution de travail de 10 ml, combinez 2,0 ml de solution mère de caféine 60 mL + 0,3 mL de solution mère BSA à 30 % + 7,7 mL de FSW.
   2. Étiquetez le tube avec la date et « solution de travail d’activation des spermatozoïdes - 0,9% BSA + 12 mM de caféine ».
   3. Préparer chaque jour d’utilisation, conserver à température ambiante (19-30 °C) et jeter la solution inutilisée à la fin de la journée.
4. Préparer des solutions cryoprotectrices (cryodiluants). Assurez-vous de porter des gants jetables lors de la manipulation du cryoprotecteur DMSO.
   REMARQUE : Le FSW est préparé avec des concentrations variables de cryoprotecteur en fonction de la concentration initiale de spermatozoïdes dans un échantillon et de la concentration finale souhaitée de spermatozoïdes d’aliquotes cryoconservées. Lors de la préparation du cryodiluant, s’assurer que le FSW est aliquote dans le tube de 50 mL avant l’ajout de DMSO.
   1. Prélever l’eau de mer brute du système de réservoir dans lequel les coraux sont conservés avant le frai (salinité de ~35 ppt).
   2. Filtrez l’eau de mer brute à l’aide d’un système de filtration par bouchon de bouteille relié à une pompe à vide avec un filtre à membrane apyrogène de 0,2 μm.
   3. Pour une concentration de spermatozoïdes ≥2 × 10⁹ spermatozoïdes/mL, préparer 20 % de DMSO dans du FSW en combinant 10 mL de DMSO + 40 mL de FSW dans un tube de 50 mL.
   4. Pour une concentration de spermatozoïdes <2 × 10⁹ spermatozoïdes/mL, préparer 30 % de DMSO dans du FSW en combinant 15 mL de DMSO + 35 mL de FSW dans un tube de 50 mL.
   5. Étiquetez le tube avec la date et la concentration de DMSO, c’est-à-dire 30 % de DMSO ou 20 % de DMSO.
   6. Préparer chaque jour d’utilisation, conserver à température ambiante (19-30 °C) et jeter la solution inutilisée à la fin de chaque journée.
      REMARQUE : Le mélange de DMSO et de FSW crée une réaction exothermique, et le cryodiluant doit être préparé bien avant l’utilisation pour permettre le refroidissement à température ambiante. Le FSW peut être stocké à 4 °C pour la préparation du cryodiluant afin de contrebalancer cette génération de chaleur.
5. Préparez l’enregistreur de données de thermocouple.
   1. Pour mesurer la vitesse de refroidissement approximative de chaque cycle de cryoconservation, placez un flacon cryogénique contenant 10 % de DMSO en FSW avec une sonde thermocouple insérée à travers le couvercle dans une fente d’échantillon du support de cryoconservation à côté des échantillons de sperme.
   2. Pour fabriquer un flacon de thermocouple, percez ou faites fondre un petit trou dans le capuchon du cryoflacon à code-barres et insérez un thermocouple de type K ou T à travers l’ouverture. Poussez l’extrémité de la sonde du thermocouple vers le bas à un niveau tel qu’elle se trouve au milieu de l’échantillon lorsque le flacon est rempli, en maintenant l’extrémité de la sonde centrée dans le flacon pour éviter tout contact avec la paroi intérieure du flacon. Fermez le capuchon et maintenez la sonde du thermocouple en place avec de la colle chaude.
   3. À l’aide de gants jetables, remplissez le flacon cryogénique à code-barres avec un volume de 10 % de DMSO en FSW égal au volume de l’échantillon de sperme à cryoconserver.
   4. Préparez du DMSO frais à 10 % dans du FSW et remplissez quotidiennement les flacons de thermocouple.

2. Préparation et évaluation du sperme

1. Pour les espèces hermaphrodites (p. ex. les espèces Acropora ), prélever les faisceaux de gamètes à la surface de l’eau à l’aide d’une pipette de transfert de 3 mL et les placer dans un tube de 50 mL étiqueté à raison de 5 mL de faisceaux de gamètes sur 5 mL d’eau de mer (volume total de 10 mL).
2. Pour les espèces gonochoriques, prélever les spermatozoïdes près de la bouche du polype à l’aide d’une pipette de transfert de 3 mL et placer l’échantillon dans un tube de 50 mL marqué, puis passer directement à l’étape 2.8.
   REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’utiliser des gants jetables pour le prélèvement et la manipulation d’échantillons de gamètes, mais on peut les porter si vous le souhaitez. Il faut se laver soigneusement les mains à l’eau douce ou changer de gants entre chaque échantillon de gamètes pour éviter la contamination croisée.
3. Pour les espèces hermaphrodites, agitez les faisceaux de spermatozoïdes en faisant doucement tourner l’échantillon à la main jusqu’à ce que les faisceaux se soient séparés.
   REMARQUE : Certaines espèces de Montipora ont une toxine dans les œufs, il faut donc les laisser se désagréger lentement avec un minimum d’agitation pour éviter d’endommager les spermatozoïdes.
4. Laissez l’échantillon reposer pendant 2 minutes dans un support tubulaire pour permettre aux œufs de flotter à la surface et aux spermatozoïdes de se déposer (les œufs formeront une couche rose/brune à la surface, et les ovules individuels seront visibles ; voir la figure 1i).
5. Pour séparer les spermatozoïdes et éliminer les ovules contaminants, aspirez doucement les spermatozoïdes du fond du tube à l’aide d’une pipette de transfert propre de 3 ml.
6. Transférez l’échantillon de sperme dans une passoire cellulaire de 100 μm posée sur un nouveau tube à centrifuger stérile de 50 mL. L’échantillon doit s’écouler facilement à travers le filtre. Tapotez le filtre pour encourager l’écoulement de l’échantillon et, si nécessaire, une pipette de transfert propre peut être utilisée pour prélever tout échantillon résiduel sous le filtre. Retirez le filtre, puis fermez le tube sans serrer pour permettre l’échange d’air.
7. Étiquetez l’échantillon de sperme filtré avec l’ID de la colonie et transférez l’échantillon vers le poste de travail d’évaluation du sperme.
8. Ouvrez le fichier de la fiche technique automatique de la biobanque de corail (Fichier supplémentaire 1). Dans l’onglet d’évaluation du sperme, saisissez les métadonnées de la colonie de coraux (colonnes A-H).
9. Préparez les spermatozoïdes pour l’évaluation CASA.
   1. Mélangez bien l’échantillon de sperme et prélevez une aliquote de 10 μL dans un tube de microcentrifugation vide de 1,8 mL.
   2. Ajouter immédiatement 0,390 ml de solution d’activation des spermatozoïdes par goutte à goutte sur 10 à 20 s, en mélangeant doucement les spermatozoïdes dans la solution. Cela donne un rapport de dilution de 1:39 (spermatozoïdes/solution, v/v) (ou facteur de dilution de 40), ce qui fournit une concentration appropriée pour l’évaluation CASA (~50 × 10⁶/mL) si la concentration de spermatozoïdes bruts est de ~2 × 10⁹ spermatozoïdes/mL. Retournez le tube 5 fois et agissez le couvercle du tube avant de l’ouvrir pour déposer la solution au fond du tube.
      REMARQUE : La concentration de spermatozoïdes pour CASA doit être comprise entre 8 et 50 × 10⁶/mL pour permettre un suivi précis des spermatozoïdes¹⁷. Une solution supplémentaire de travail d’activation des spermatozoïdes peut être ajoutée à l’aliquote de spermatozoïdes bruts pour réduire la concentration si nécessaire. Recalculez le taux de dilution et entrez cette valeur dans la feuille de calcul. Dans les cas où de nombreux échantillons doivent être traités simultanément, les tubes de microcentrifugation de 1,8 ml peuvent être préchargés avec 0,390 ml de solution de travail d’activation des spermatozoïdes avec l’aliquote de 10 μL d’échantillon de sperme ajoutée directement à celui-ci, puis bien mélangés en inversant le tube de 10 × et en agitant le couvercle du tube avant de l’ouvrir.
10. Évaluer la motilité des spermatozoïdes et la concentration de l’échantillon activé à l’aide de l’analyse des spermatozoïdes assistée par ordinateur (CASA), comme décrit dans Zuchowicz et ^coll.17 , en plaçant 4 μL de suspension de spermatozoïdes activés sur une chambre de comptage Makler²⁰ , ou par évaluation visuelle et comptage par hémocytomètre sous microscopie à contraste de phase, comme décrit dans Hagedorn et ^coll.4.
    REMARQUE : La chambre Makler et la lamelle doivent être bien nettoyées avec de l’éthanol à 70%, puis de l’eau distillée, et essuyées avec une lingette de tissu non pelucheuse entre les échantillons.
11. Entrez le facteur de dilution des spermatozoïdes utilisé pour l’évaluation CASA et entrez les sorties CASA pour la concentration de spermatozoïdes (millions/mL), la motilité totale (%) et la motilité progressive (%) dans la fiche technique automatique.
    REMARQUE : Des mesures CASA supplémentaires, notamment la vitesse de trajectoire moyenne (VAP), la vitesse en ligne droite (VSL) et la vitesse curviligne (VCL), peuvent éventuellement être incluses dans la feuille de données automatique ou récupérées ultérieurement à partir de fichiers CASA enregistrés.
12. Inscrivez la concentration de spermatozoïdes sur le tube d’échantillon de sperme filtré et transférez l’échantillon vers le poste de cryoconservation dans le même ordre que lors de la séparation et du traitement du paquet.

3. Dilution des spermatozoïdes et équilibrage des cryoprotecteurs

1. Au poste de cryoconservation, ouvrez le même fichier de biobanque de corail que celui utilisé par le poste de travail d’évaluation du sperme et sélectionnez l’onglet Cryoconservation . Vérifiez l’étiquette du tube d’échantillon de sperme et identifiez l’entrée correspondante en vérifiant l’identifiant de la colonie (colonne C). Si vous n’accédez pas simultanément au même fichier de feuille de données automatique entre les postes de travail, entrez manuellement les données dans l’ID de la colonie (colonne C) et la concentration de spermatozoïdes (colonne F) dans la feuille de données automatique.
2. À l’aide d’une pipette sérologique, mesurez le volume de l’échantillon de spermatozoïdes en aspirant l’échantillon dans la pipette et en l’expulsant dans le même tube ; entrez la valeur dans la colonne E.
3. Vérifiez la colonne I calculée automatiquement pour la concentration de cryoprotecteur requise et la colonne H pour le volume de cryodiluant à ajouter (tableau 1).
4. Démarrez une minuterie pendant 10 minutes et, à l’aide d’une pipette sérologique, commencez immédiatement à ajouter le cryodiluant, goutte à goutte, en mélangeant doucement l’échantillon, en veillant à ce que des gants jetables soient portés pour la manipulation du DMSO.
5. Noter le temps d’ajout du cryodiluant dans la colonne P.

Concentration de spermatozoïdes	Cryodiluant	Taux de dilution (spermatozoïdes :cryodiluant)	Concentration finale de DMSO dans l’échantillon de sperme (%)
< 2 × 109/mL	30 % de DMSO dans le FSW	2:1	10%
≥ 2 × 109/mL	20 % de DMSO dans le FSW	1:1	10%

Tableau 1 : Concentration de cryodiluant et taux de dilution pour la cryoconservation des spermatozoïdes de corail, sur la base de l’évaluation de la concentration totale de spermatozoïdes dans l’échantillon à cryoconserver.

4. Cryoconservation des spermatozoïdes

1. Lisez la colonne K pour déterminer le nombre de cryoflacons à remplir. Celui-ci est calculé automatiquement à partir du volume total de spermatozoïdes et du volume souhaité par flacon (1 ml dans la plupart des cas). Pendant la période d’incubation de 10 minutes, passez aux étapes 4.2 à 4.6.
2. Débouchez les cryoflacons stériles à code-barres et placez-les sur une surface propre/stérile.
3. Facultatif : Écrivez le # d’exécution sur chaque flacon cryogénique à l’aide d’un marqueur permanent ; Cela peut faciliter l’identification rapide des échantillons en vue de leur intégration dans la biobanque.
4. À l’aide d’une pipette sérologique et d’une pipette aliquote réglée sur le volume d’échantillon souhaité (1 mL), aliquote les échantillons dans des flacons cryogéniques à code-barres non bouchés et des flacons rebouchés.
5. Placez un flacon de thermocouple et tous les flacons d’échantillons pleins sur un support cryogénique vide à température ambiante. Assurez-vous que la surface du code-barres est tournée vers l’extérieur sur tous les flacons.
6. Si nécessaire, placez des cryoflacons factices supplémentaires contenant 10 % de DMSO dans le FSW dans tous les espaces vides du rack cryogénique pour vous assurer que tous les espaces sont occupés.
7. Entrez le numéro de série dans la feuille de données automatique (colonne U) et scannez le numéro de série du rack cryogénique (code QR) dans la colonne V.
8. Placez le curseur dans la bonne cellule de la colonne Z et balayez le flacon de thermocouple, suivi de tous les tubes cryoviaux chargés sur le rack (à partir de la colonne AA ). Évitez d’incliner la grille sur le côté pour éviter que l’échantillon ne pénètre dans le filetage du flacon.
9. Pendant le balayage, vérifiez que les données sont saisies dans la bonne cellule et que tous les cryoflacons ont été scannés une fois.
10. Mettez de côté les racks chargés et scannés pour le reste de la période d’équilibrage du cryoprotecteur et préparez la cuve de refroidissement pour la cryoconservation.
11. Remplissez le récipient de refroidissement du rack cryogénique avec de l’azote liquide jusqu’au niveau prédéterminé approprié nécessaire au refroidissement à environ −20 °C/min.
    REMARQUE : L’azote ne doit être utilisé que dans des zones bien ventilées car il existe un risque d’asphyxie. Des chaussures fermées, des lunettes de sécurité/écrans faciaux et des gants cryogéniques doivent être portés lors de la manipulation d’azote liquide. Reportez-vous aux lignes directrices de l’établissement pour obtenir des informations spécifiques sur la manipulation et l’utilisation de l’azote liquide.
12. À la fin de la période d’équilibrage du cryoprotecteur de 10 minutes, connectez la sonde du thermocouple à l’enregistreur de données et commencez l’enregistrement, puis placez doucement le rack cryogénique complet dans le récipient de refroidissement et appliquez le couvercle.
13. Inscrivez l’heure de début dans la colonne Q.
14. Une fois que le flacon de thermocouple indique -80 °C ou moins sur l’enregistreur de données, trempez les échantillons dans de l’azote liquide en transférant l’insert du rack cryogénique dans un bain d’azote liquide dans un récipient séparé tel qu’une boîte en polystyrène.
15. Retirez les cryoflacons du support et transférez-les dans un entrepôt sec pour être transportés vers la biobanque.

Discussion

La voie de traitement semi-automatisée décrite dans ce protocole permet le traitement efficace et la cryoconservation du sperme des coraux afin de sécuriser la génétique des espèces menacées et de soutenir les efforts de restauration et d’adaptation des récifs. La motivation pour le développement de ce protocole était l’absence de systèmes existants adaptés aux exigences de débit de la cryoconservation des spermatozoïdes coralliens et de l’utilisation de cryovioles, car les systèmes de traitement à haut débit pour la cryoconservation des spermatozoïdes sont généralement basés sur l’emballage d’échantillons dans des paillettes françaises de 0,25 ml ou 0,5 ml^21,22. À titre de comparaison, les cryoflacons sont généralement utilisés soit à petite échelle pour le traitement à faible débit (p. ex., cryoconservation d’échantillons de laboratoire pour la recherche^23,24), soit dans des systèmes de traitement à haut débit d’échantillons en vrac à l’aide d’équipement coûteux et non portable (p. ex., traitement de cultures cellulaires pour l’industrie^18,25). Nous avons également étudié le potentiel d’utilisation d’un système de débouchage automatique pour rationaliser le retrait et le remplacement des bouchons cryoviaux, mais les systèmes n’étaient disponibles que pour des cryoflacons individuels ou pour des racks cryoviaux entiers, de sorte qu’ils ne fournissaient pas de solution rentable. À l’heure actuelle, plusieurs groupes dans le monde utilisent le protocole de cryoconservation conçu par Hagedorn et ^al.4 pour sécuriser la diversité génétique des coraux, et il est important que ce travail continue de s’étendre à d’autres récifs dans le monde. Par conséquent, une considération majeure dans l’élaboration du protocole actuel était la nécessité d’utiliser des technologies rentables et accessibles qui pourraient être facilement mises en œuvre par ces autres groupes, et qui ne seraient pas prohibitives pour les nouveaux groupes souhaitant commencer la cryoconservation du sperme de corail.

Un élément clé du protocole décrit est l’amélioration de la gestion des métadonnées d’échantillon via des feuilles de calcul liées dans Microsoft Excel. La saisie des données est généralement simple, mais il convient de noter que la modification des informations dans les feuilles de données automatiques ne doit se faire qu’en supprimant et en saisissant à nouveau des informations, car les fonctions rapides (par exemple, Ctrl + C, Ctrl + V) pour modifier les données affecteront potentiellement les entrées simultanées par d’autres utilisateurs et peuvent causer des problèmes de liaison de données entre les feuilles de calcul. Un élément important des métadonnées est un identificateur unique (à savoir, l’identifiant de la colonie) qui est lié à la colonie donneuse et qui est attaché à l’échantillon à toutes les étapes de la voie de traitement. Il est essentiel que les tubes d’échantillon soient clairement étiquetés avec l’identification de la colonie au moment du prélèvement des paquets, et que cette information soit transcrite avec précision sur tous les nouveaux tubes dans lesquels l’échantillon est transféré pendant la préparation (p. ex., pendant le filtrage pour séparer les ovules et les spermatozoïdes, ou pour l’ajout de cryodiluant). Bien que le protocole permette le transfert automatique des informations sur la qualité des échantillons de l’opérateur CASA au poste de cryoconservation, des problèmes peuvent survenir lorsque la couverture Internet ou Wi-Fi est faible. En cas de retard de transfert de données, il est recommandé que les deux postes de travail travaillent hors ligne et conservent des feuilles de données automatiques distinctes qui peuvent être rapprochées par la suite. Il est donc recommandé que l’opérateur CASA inscrive la concentration de l’échantillon sur le tube d’échantillonnage comme sauvegarde pour s’assurer que ces informations sont à portée de main pour la préparation de la cryoconservation en cas de retard dans le téléchargement des métadonnées entre les ordinateurs.

Le choix de lecteurs de codes-barres et de cryoflacons à code-barres utilisés pour ce protocole peut être varié en fonction du budget et de la disponibilité du produit ; Cependant, certains éléments clés doivent être pris en compte dans leur sélection. Le lecteur de codes-barres doit avoir la capacité de personnaliser les paramètres, en particulier la possibilité de modifier les spécifications de saisie des données et la direction de la saisie des données. Les feuilles de données automatiques utilisées pour ce protocole utilisent la saisie horizontale, mais à certaines occasions (par exemple, l’adhésion à la biobanque ou pour d’autres utilisations en laboratoire) la saisie verticale peut être requise, il est donc important que cette fonctionnalité soit personnalisable. Bien que le protocole puisse être utilisé avec les codes-barres 1D et 2D, il est recommandé que les cryoflacons sélectionnés aient un composant lisible par l’homme (par exemple, les codes-barres 1D comprennent généralement un numéro unique) pour permettre la vérification croisée de l’entrée de l’échantillon pendant la cryoconservation. En plus de la saisie des échantillons, le lecteur de codes-barres peut être utilisé pour automatiser la saisie de certains champs de métadonnées en créant et en imprimant des codes QR pour des informations qui sont répétées sur tous les échantillons (par exemple, les noms d’espèces, les dates et les emplacements des récifs) avant le frai. Ces informations peuvent ensuite être saisies rapidement et facilement dans les fiches techniques automatiques en les scannant avec le lecteur de codes-barres. De plus, en attachant des codes-barres de numéro de série à chaque rack cryogénique et sonde thermocouple, il est également possible de relier chaque cycle de cryoconservation à un ensemble spécifique d’équipements dans la base de données, ce qui est utile pour le contrôle de la qualité et pour identifier les composants qui nécessitent une réparation ou un remplacement.

Les facteurs limitants dans le traitement sont souvent le temps passé à attendre que les paquets se brisent et le temps nécessaire pour filtrer et séparer les spermatozoïdes des ovules avant la CASA et la cryoconservation. Dans la mesure du possible, il est recommandé de traiter les échantillons dans l’ordre dans lequel les paquets se séparent ; Cependant, des gains d’efficacité supplémentaires peuvent être réalisés grâce à la gestion stratégique des commandes de traitement d’échantillons. Par exemple, s’il y a 5 cryoflacons ou moins par colonie en raison de faibles volumes d’échantillons (c’est-à-dire moins de 3 mL de spermatozoïdes par colonie) ou d’une faible concentration de spermatozoïdes nécessitant une dilution 2:1 avec du cryodiluant (c’est-à-dire moins de 2 × 10⁹/mL), il est préférable d’ajouter du cryodiluant à deux échantillons de colonie en même temps afin qu’ils puissent être analysés ensemble sur le même support cryogénique (total # emplacements disponibles = 11), plutôt que de les exécuter séparément avec des mannequins remplissant les espaces vides. De plus, il est possible de faire fonctionner plusieurs racks cryogéniques simultanément (pour des échantillons d’un volume de >6 ml) à condition de veiller à ce que tous les processus puissent être terminés dans le temps d’équilibrage du cryodiluant de 10 minutes, ce qui peut encore augmenter le débit d’échantillons. Cependant, lors de l’exécution de plusieurs racks cryogéniques ou de la combinaison de plusieurs colonies sur un seul rack cryogénique, il faut veiller à ce que les métadonnées de cryoconservation soient attribuées au bon échantillon dans la feuille de données automatique, en particulier si les échantillons sont cryoconservés dans un ordre différent de leur évaluation CASA.

En plus du développement du flux de travail semi-automatisé, la présente description du protocole fournit également deux comparaisons méthodologiques liées à la concentration des spermatozoïdes qui visent à améliorer l’analyse des spermatozoïdes et les résultats de la cryoconservation. En général, le prélèvement de 5 mL de faisceaux de gamètes sur 5 mL d’eau de mer (volume total de 10 mL) entraînera une concentration de spermatozoïdes égale ou supérieure à 2 × 10⁹ cellules/mL, mais il y a des occasions où la concentration de spermatozoïdes peut être plus faible en raison de différences d’espèces ou de la rupture des faisceaux pendant la collecte. L’utilisation d’un cryodiluant DMSO à concentration plus élevée (30 % v/v) réduit la quantité de spermatozoïdes dilués afin de minimiser les variations d’un lot à l’autre de la concentration de spermatozoïdes dans le cryovial. Il est important de noter que l’utilisation de 30 % de DMSO pour atteindre la concentration finale de DMSO n’a pas d’impact sur les paramètres de concentration ou de motilité après dégel, comme le montrent les données représentatives de la figure 3. La deuxième comparaison méthodologique offre une alternative aux lames de chambre à lamelle fixe à usage unique généralement utilisées pour le CASA. Le principal défi lié à l’utilisation de lames disponibles dans le commerce pour l’analyse des spermatozoïdes de corail est qu’elles peuvent avoir un impact sur la précision de l’évaluation de la motilité en raison de l’adhérence des spermatozoïdes au revêtement de la lame. L’utilisation de la solution d’activation permet de résoudre ce problème dans de nombreux échantillons, mais pas tous, de sorte qu’il est toujours recommandé d’effectuer une analyse CASA distincte pour la motilité à l’aide d’une simple lame pour garantir la fiabilité et la cohérence. L’utilisation d’une chambre de comptage Makler permet de surmonter la nécessité d’analyser la concentration et la motilité séparément, et améliore potentiellement la précision des mesures de concentration (Figure 2), il est donc recommandé de l’utiliser avec le protocole actuel. Compte tenu de cette divergence dans les mesures de concentration, une constatation qui a déjà été signalée²⁰, il est important de toujours enregistrer les détails des lames dans la base de données en même temps que les données sur la qualité du sperme et, dans la mesure du possible, d’être cohérent dans le type de lame de chambre utilisé pour minimiser les variations d’un lot à l’autre et aider à assurer des calculs fiables des ratios spermatozoïdes/ovules pour les fécondations.

Le processus semi-automatisé décrit dans le présent document offre une voie normalisée et efficace pour la cryoconservation et la mise en banque de sperme d’espèces coralliennes menacées, tout en préservant la biosécurité et la qualité des échantillons. Le protocole décrit est facilement transférable et relativement peu coûteux à mettre en œuvre dans les programmes du monde entier qui s’efforcent de sécuriser la diversité corallienne existante en utilisant la cryopréservation, ce qui sera essentiel pour prévenir les extinctions et maximiser les ressources disponibles pour les efforts de restauration des récifs maintenant et à l’avenir.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ovation ALI-Q 2 VS Pipette Controller - Aliquotting pipette	Vistalab	2100-1005	Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
5 mL serological pipettes (bulk)	Thermo Scientific	Nunc 170355	Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
10 mL serological pipettes (bulk)	Thermo Scientific	Nunc  170356	Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
P2 0.2–2 µL pipettor	Gilson	F144054M	Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P10 1–10 µL pipettor	Gilson	F144055M	Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P20 2–20 µL pipettor	Gilson	F144056M	Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P200 20–200 µL pipettor	Gilson	F144058M	Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P1000 100–1000 µL pipettor	Gilson	F144059M	Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
Vacuum pump	Millipore	WP6122050	Preparation of filtered sea water for solution preparation
Reusable bottle-top filtration system	Thermo Scientific	DS0320-5045	Preparation of filtered sea water for solution preparation
0.22-µm filter discs, mixed cellulose esters	Merck Millipore	GSWP04700	Preparation of filtered sea water for solution preparation
Filtered sea water	N/A	–	Base medium for sperm activation and cryoprotectant solutions
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D4540	Cryoprotectant chemical used at a final concentration of 10% v/v in filtered seawater for sperm cryopreservation
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750	Used to activate sperm motility
BSA heat shock fraction	Sigma-Aldrich	A9647	Used to minimise sperm adherance to CASA well slides
15-mL tubes - racked	Thermo Scientific	339651	Preparation of sperm activation solution
50-mL tubes racked	Thermo Scientific	339653	For collection of gamete bundles and filtered sperm samples
Transfer pipettes	Thermo Scientific	Samco 202PK	To aid collection of gamete bundles from the water surface
100-µm filter baskets	Fisher Scientific	22363549	To exclude eggs during separation of the sperm sample
Eppendorf racks	Interpath	511029	Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Eppendorf 1.5-mL tube	Eppendorf	30120086	Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Glass coverslips 18x18 mm	Brand	4700 45	Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Plain glass slides, precleaned, 75x25 mm	Corning	2947	Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Haemocytometer	Hausser Scientific	1492	Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
CASA slides (Leja 20-µm 4 chamber, SC-20-01-04-B)	IMV Technologies	025107	Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Makler sperm counting chamber (CASA)	IVFStore	SM-373	Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
accu-bead® counting beads	Hamilton-Thorne	710111	Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
CASA system + laptop	Hamilton Thorne	Ceros II	Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Safety Glasses	Generic	–	Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Lab coat	Long sleeve, full length	–	Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Cryogloves (pair)	Tempshield	Mid-Arm	Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Medium forceps	Generic	–	For removing cryopreserved samples from the cryo racks and manipulating samples in liquid nitrogen
Barcode scanner (2D compatible)	Zebra	DS2278	For reading 1D and 2D barcodes on cryovials for sample management
2.0-mL CryoStorage Vial, external thread, pre-capped, 2D SafeCode (DataMatrix/ECC200), linear and human readable	Eppendorf	30079434	Barcoded cryovials for cryopreservation of sperm samples
Cryovial rack	Simport	T315	Rack to hold cryovials, with locking base to allow for one hand de-capping and capping
Freezing racks	Custom	–	Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing rack lid	Custom	–	Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing Thermos – 1.5 Litre 18/8 Stainless Steel Double-Wall Vacuum Food Container	Isosteel	VA-9683	Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Lab timers	Generic	–	For timing of cryoprotectant equilibration prior to cryopreservation
Nitrogen bath 9L	BelArt	M16807-9104	For quenching samples during cryopreservaton and holding samples during sorting and handling
Thermocouple data logger- multichannel	Omega	HH520	Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Thermocouple probe – Type K	Omega	5SC-TT-K-30-36	Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Cryo pens/coloured permanent pen	Staedtler Lumocolor	318	Optional for marking cryovial lids to assist with sample management
Dry Shipper - charged	Taylor Wharton	CXR100, or CX500	For transfer of cryopreserved samples from field/collection sites to the biorepository for storage