Technique de nage horizontale en forme de U pour la préparation de spermatozoïdes de haute qualité avec un faible indice de fragmentation de l’ADN

Résumé

Ce protocole décrit une méthode de criblage de spermatozoïdes de haute qualité avec un faible indice de fragmentation de l’ADN en utilisant les caractéristiques de motilité des spermatozoïdes et la thigmotaxie. La méthode utilise un couloir de nage horizontal en forme de U, permettant aux spermatozoïdes de haute qualité d’atteindre le côté opposé à travers des gouttelettes tampons, tandis que les spermatozoïdes morts, les débris cellulaires et les impuretés sont exclus.

Résumé

Le sperme humain est un mélange complexe comprenant des spermatozoïdes progressivement mobiles, des spermatozoïdes non progressivement mobiles, des spermatozoïdes immobiles, des débris cellulaires et du plasma séminal visqueux. Les spermatozoïdes de haute qualité font référence aux spermatozoïdes progressivement mobiles avec une morphologie normale, qui présentent souvent un indice de fragmentation de l’ADN (DFI) plus faible et un potentiel de fécondation plus élevé. La préparation de spermatozoïdes de haute qualité est une étape critique de la technologie de procréation assistée par l’homme. La méthode traditionnelle de préparation des spermatozoïdes, la centrifugation à gradient de densité discontinu (DGC), prend du temps et demande beaucoup de main-d’œuvre. Une centrifugation répétée peut endommager l’ADN des spermatozoïdes, affectant ainsi la fécondation ultérieure et le développement de l’embryon. Cette étude présente une méthode de nage horizontale en forme de U (UHS) pour préparer l’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI), qui élimine considérablement les effets néfastes de la centrifugation sur l’ADN des spermatozoïdes. La méthode UHS consiste à créer une voie UHS à l’aide d’un milieu de fertilisation à l’intérieur d’une parabole opératoire ICSI. Une microgouttelette de milieu de fertilisation de 10 μL est placée au point de départ sur le côté gauche de la voie UHS pour retenir le sperme. Deux gouttelettes tampons supplémentaires de 10 μL de milieu de fertilisation sont positionnées à intervalles réguliers le long de la section centrale gauche de la voie, toutes les gouttelettes étant reliées par le milieu de fertilisation. La boîte est ensuite recouverte d’huile de culture et incubée pendant une nuit à 37 °C avec 6 % de CO₂ pour équilibrer. Par la suite, 3 μL de sperme sont ajoutés à la microgouttelette au point de départ. Des spermatozoïdes de haute qualité nagent sur le côté droit de la voie UHS, facilitant leur aspiration dans l’aiguille d’injection ICSI. Les spermatozoïdes morts, les débris cellulaires et autres impuretés visqueuses restent en grande partie au point initial ou dans les gouttelettes tampons. Nous avons traité simultanément 21 échantillons de sperme en utilisant les techniques UHS et DGC et comparé leurs DFI. Les résultats ont montré que l’IFD dans le groupe DGC était de 5,5 % ± 3,2 %, tandis que l’IFD dans le groupe UHS était de 1,7 % ± 1,1 %. La différence entre les deux groupes était statistiquement significative (P < 0,05).

Introduction

Les techniques d’optimisation du sperme et de préparation des spermatozoïdes jouent un rôle crucial dans l’obtention de fractions cellulaires enrichies en spermatozoïdes structurellement et fonctionnellement supérieurs, ce qui constitue une étape clé de la technologie de procréation assistée humaine¹. L’objectif de l’optimisation du sperme est de : (1) Réduire ou éliminer les prostaglandines, les cellules immunitaires, les anticorps anti-spermatozoïdes, les spermatozoïdes immobiles de mauvaise qualité, les bactéries et les débris dans le plasma séminal ; (2) Réduire ou éliminer la viscosité du sperme ; et (3) Favoriser la capacité des spermatozoïdes et améliorer la capacité de fécondation. Une technique idéale de préparation des spermatozoïdes devrait permettre de récupérer une population de spermatozoïdes hautement fonctionnelle qui préserve l’intégrité de l’ADN et n’induit pas de dysfonctionnement par la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) par les spermatozoïdes et les leucocytes².

La technologie de préparation du sperme la plus utilisée actuellement est la méthode DGC. Les avantages de cette méthode sont son taux de récupération^élevé3 et sa standardisation facile. Dans la pratique, il peut être sélectionné de manière flexible en fonction de la qualité de l’éprouvette pour la méthode de gradient de double densité⁴, la méthode mini-DGC ou la méthode de centrifugation à gradient monocouche⁵. Cette méthode peut être utilisée pour préparer des spermatozoïdes de haute qualité avec une bonne vitalité, exempts de débris cellulaires, de globules blancs contaminés, de cellules non germinales et de cellules germinales dégénérées. Cependant, l’inconvénient de cette méthode est qu’elle nécessite une centrifugation, ce qui peut endommager l’ADN des spermatozoïdes⁶.

La méthode présentée ici a été adaptée de l’étude originale de Baldini et ^al.7, qui s’est concentrée sur la migration horizontale des spermatozoïdes dans des boîtes d’injection. Cette méthode modifiée intègre une voie horizontale en forme de U pour séparer les spermatozoïdes de haute qualité et à forte vitalité. Il évite les dommages à l’ADN causés par la centrifugation et minimise l’influence des spermatozoïdes morts, des débris cellulaires et d’autres impuretés visqueuses lors des procédures d’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI).

L’approche spécifique consiste à utiliser un milieu de fertilisation pour créer une voie UHS dans la parabole opératoire ICSI. Une microgouttelette de milieu de fertilisation de 10 μL est placée au point de départ gauche de la voie UHS pour retenir le sperme. Deux gouttelettes tampons supplémentaires de 10 μL de fertilisant sont positionnées à intervalles réguliers dans la section centrale gauche de la voie UHS, et toutes les gouttelettes sont reliées par un milieu de fertilisation. Après avoir recouvert l’installation d’huile de culture, le plat est incubé pendant la nuit à 37 °C avec 6 % de CO₂ pour l’équilibre. Par la suite, 3 μL de sperme sont ajoutés à la microgouttelette au point de départ sur le côté gauche de la voie UHS. Des spermatozoïdes de haute qualité nagent jusqu’à la piste sur le côté droit de la voie UHS, facilitant leur collecte avec l’aiguille d’injection ICSI. Les spermatozoïdes morts, les débris cellulaires et autres impuretés visqueuses restent principalement à l’emplacement d’origine ou dans les gouttelettes tampons.

La puce microfluidique simule le processus de sélection naturelle dans l’appareil reproducteur féminin, ce qui permet d’isoler de manière optimale les spermatozoïdes de haute qualité du sperme sans centrifugation. Ceci est essentiel pour améliorer la motilité des spermatozoïdes⁸, réduire l’indice de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes⁹ et améliorer les résultats de la grossesse¹⁰. Cependant, la fabrication de tels dispositifs est complexe, coûteuse et difficile à mettre en œuvre à grande échelle.

Le protocole décrit ici offre une alternative nouvelle, simple et réalisable. En exploitant les caractéristiques de motilité des spermatozoïdes, cette méthode permet d’obtenir des résultats comparables à ceux de la technologie microfluidique. Les spermatozoïdes préparés présentent une forte vitalité, de faibles indices de fragmentation de l’ADN et sont bien adaptés à une utilisation dans l’ICSI.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique médicale de l’hôpital national affilié Huai’an de l’Université de médecine de Nanjing (numéro d’approbation : KY-2024-181-01). Le consentement éclairé a été obtenu chez les patients dont les échantillons ont été utilisés dans cette étude. La procédure doit être effectuée par du personnel expérimenté conformément aux bonnes pratiques de laboratoire et aux directives cliniques^11,12. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont fournis dans la table des matériaux.

1. Préparation d’une parabole opératoire ICSI

1. Utilisez un milieu de fertilisation de 20 μL pour créer des pistes en forme de U dans la parabole de fonctionnement ICSI (Figure 1). La longueur de la piste gauche de la piste en forme de U doit être d’environ 30 mm, et la longueur de la piste droite doit également être d’environ 30 mm.
2. Aspirez 10 μL de milieu de fertilisation à l’aide d’une pipette et créez une gouttelette circulaire au point de départ gauche de la piste en forme de U. Reliez-le au point de départ gauche de la piste en forme de U pour ajouter la solution de stock de sperme.
3. Créez deux gouttelettes tampons de milieu de fertilisation de 10 μL à intervalles réguliers sur la partie centrale gauche de la voie UHS. Connectez toutes les gouttelettes avec le milieu de fertilisation.
4. Créez une longue bande de gouttelettes de liquide sur le côté droit de la voie en forme de U à l’aide de 2,5 μL de polyvinylpyrrolidone (PVP). Assurez-vous que la bande PVP est parallèle à la voie de droite de la voie en forme de U.
5. Produisez six microgouttelettes à l’aide du milieu de traitement des ovocytes situé sur le côté droit de la bande PVP, à raison de 20 μL par gouttelette.
6. Ajouter 7 ml d’huile de culture dans le plat, en veillant à ce que l’huile recouvre le point le plus élevé de la gouttelette. Placez-le dans un incubateur à 37 °C, 6 % de CO₂ pendant la nuit pour l’équilibre.

2. Prélèvement d’échantillons de sperme

1. Fournir aux patients des instructions écrites et verbales claires concernant le prélèvement de l’échantillon de sperme. Assurez-vous que le prélèvement de l’échantillon est complet et demandez aux patients de s’abstenir d’éjaculer pendant 3 à 7 jours avant le prélèvement.
2. Recueillez le sperme par masturbation dans un gobelet de prélèvement de sperme spécialisé jetable, stérile et non toxique. Assurez-vous que tout l’éjaculat est prélevé et demandez à la personne de signaler toute perte de toute fraction de l’échantillon.
3. Vérifiez les noms, les documents d’identité valides et les empreintes digitales du conjoint du patient. Inscrivez le nom et le numéro de dossier médical du conjoint du patient sur le corps et le couvercle du gobelet de prélèvement de sperme.
4. Une fois que le patient masculin a recueilli le sperme, remettez l’échantillon en face à face entre le personnel et le patient. Prélevez une petite quantité de l’échantillon de sperme pour l’emballage et le stockage. Assurez-vous que le patient signe dans la zone d’emballage.
5. Numérotez et conservez les échantillons encapsulés pendant 2 ans. Consignez les renseignements sur le patient, le numéro d’identification et les signatures du receveur et des témoins dans le registre de traitement du sperme.
6. Si un membre du personnel du centre de reproduction découvre l’identité suspecte d’un patient, arrêtez de recevoir l’échantillon et vérifiez à nouveau l’identité du patient. Ne recevez pas deux échantillons ou plus en même temps. S’il y a suspicion de confusion dans les échantillons, cessez de les recevoir.

3. Analyse de l’échantillon de sperme

1. Observez la couleur des échantillons de sperme.
   REMARQUE : Le sperme normal apparaît homogène et blanc grisâtre après liquéfaction. Le sperme avec une très faible concentration de spermatozoïdes peut sembler transparent. Si des globules rouges sont présents, le sperme peut apparaître brun rougeâtre. Si le patient souffre de jaunisse ou prend certaines vitamines, le sperme peut apparaître jaune.
2. Mesurer le volume de sperme à l’aide de la méthode de pesée, précise à 0,1 mL.
3. Placez l’échantillon de sperme à 37 °C pendant 15 à 30 min. Aspirez-le dans une pipette jetable en plastique de gros calibre (environ 1,5 mm de diamètre), permettant au sperme de tomber par gravité. Respectez la longueur de n’importe quel fil.
   REMARQUE : Un éjaculat liquéfié normal forme de petites gouttes discrètes. Si la viscosité est anormale, la goutte formera un fil de plus de 2 cm.
4. Si le sperme ne se liquéfie toujours pas dans les 60 minutes, ajoutez une quantité égale de milieu de fertilisation. Ensuite, inhalez et expirez à plusieurs reprises le mélange à l’aide d’une pipette de transfert en plastique jetable jusqu’à ce qu’il se liquéfie complètement.
5. Mesurez la valeur du pH du sperme à l’aide d’un papier réactif de pH de précision (pH 6,0-10,0).
6. Prélever 10 μL de sperme entièrement liquéfié et l’égoutter dans une chambre de comptage Makler. Évaluez la motilité des spermatozoïdes sous un champ de 200x avec un microscope optique. Observez la présence d’agglutination des spermatozoïdes et des cellules non spermatozoïdes.
7. Évaluez la concentration de spermatozoïdes sous un champ de 200x à l’aide d’un microscope optique.

4. Prélèvement des ovocytes

1. Préparez une boîte pour le prélèvement des ovocytes (OPD) la veille du prélèvement des ovocytes. Ajouter 2,5 mL de milieu de traitement des ovocytes dans une boîte de culture stérile de 35 mm. Ensuite, ajoutez 1,5 ml d’huile et placez le plat dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit pour l’équilibre.
2. Préparez deux plats pour la culture d’ovocytes (TOC) la veille du prélèvement des ovocytes. Ajouter 1 mL de milieu de fertilisation dans l’anneau intérieur d’une boîte de culture stérile à puits central, puis ajouter 1 mL d’huile. Ajouter 4 mL de milieu de fertilisation dans l’anneau extérieur. Placez le plat dans un incubateur à 37 °C, 6 % de CO₂ pour équilibrer pendant la nuit.
3. Allumez tous les appareils de chauffage et les plaques chauffantes et mesurez la température 30 minutes avant le prélèvement des ovocytes.
4. Lavez-vous les mains avec un désinfectant pour les mains et rincez abondamment à l’eau courante. Portez des gants propres, stériles et sans poussière.
5. Préchauffez la boîte de culture stérile sur une plate-forme chauffante à 37 °C.
6. Vérifiez strictement l’identité de la patiente avant le prélèvement des ovocytes.
7. Inhalez le liquide folliculaire dans des tubes à essai stériles par pression négative, puis remettez-le immédiatement aux embryologistes de laboratoire.
8. Versez tout le liquide folliculaire dans des boîtes de culture stériles et recherchez des complexes de cumulus coronaux (OCCC) sous un stéréomicroscope à faible grossissement. Prélever les OCCC à l’aide d’une pipette et les placer dans un OPD pour un stockage temporaire à 37 °C.
9. Notez la quantité, la couleur, le nombre de follicules et le nombre d’OCCC dans le liquide folliculaire.
10. Après le prélèvement des ovocytes, transférez les OCCC dans l’OCD à l’aide d’une pipette Pasteur stérile. Placez-les rapidement dans un incubateur de culture (37 °C, 6 % CO₂, 5 % O₂ et humidité saturée) pendant 2 h.
11. Préparez une boîte à quatre puits, ajoutez 0,5 ml de solution d’hyaluronidase dans le premier puits et 1 ml de milieu de traitement des ovocytes dans chacun des trois puits restants. Incuber à 37 °C pendant 1 h.
12. À l’aide d’une pipette Pasteur, transférez les OCCC de l’étape 4.10 dans une hyaluronidase contenant bien pendant 30 s. Ensuite, transférez les OCCC dans un milieu de traitement des ovocytes contenant bien.
13. À l’aide d’un tube de stripping d’ovocytes de 150 m de diamètre, soufflez et aspirez les OCCC afin d’éliminer les cellules de la granulosa. Ensuite, à l’aide d’une nouvelle pipette Pasteur, transférez les ovocytes dans le milieu de traitement des ovocytes pour le lavage. Transférez-les dans un autre OCD prééquilibré et placez-les dans un incubateur à 37 °C, 6 % de CO₂ .

5. Sélection des spermatozoïdes et opération ICSI

1. Ajouter 5 μL de sperme à la microgouttelette du milieu de fertilisation au point de départ gauche de la piste en forme de U dans la boîte de commande ICSI, qui a été préparée de l’étape 1.1 à l’étape 1.6.
2. Placez la parabole de fonctionnement ICSI dans un incubateur à 37 °C, 6 % de CO₂ pendant 30 à 60 min.
3. Ouvrez le microscope inversé, le système d’exploitation du microscope et la platine chauffante pour vous assurer que toutes les commandes opérationnelles sont restaurées à leur plage contrôlable d’origine, ce qui permet un fonctionnement fluide et confortable.
4. Installez l’aiguille ICSI dans le porte-aiguille. Fixez le porte-aiguille sur le micromanipulateur, ajustez l’aiguille de maintien et l’aiguille d’injection dans la lentille de l’objectif 4x, et ajustez séquentiellement leurs angles et positions de sorte que les deux aiguilles soient relatives et parallèles à la platine. Vérifiez l’amplitude de mouvement de l’aiguille opératoire sous la lentille de l’objectif × 20.
5. Ajustez l’angle et la position de l’aiguille de retenue de l’ovocyte et de l’aiguille d’injection sous la lentille de l’objectif 4x, de sorte que les deux têtes d’aiguille soient relatives et parallèles à la platine. Déplacez l’aiguille de fonctionnement vers l’avant, l’arrière, la gauche et la droite. Vérifiez la plage de mouvement de l’aiguille de fonctionnement sous les objectifs 10x et 20x.
6. Soulevez l’aiguille de retenue de l’ovocyte et l’aiguille d’injection pour vous assurer que la hauteur entre la table d’opération et la table chauffante permet de placer facilement le vaisseau opératoire sans toucher l’aiguille opératoire.
7. Après une double vérification, transférez les ovocytes sélectionnés de l’étape 4.12 dans des microgouttelettes moyennes de traitement des ovocytes dans la boîte de fonctionnement ICSI, une par gouttelette.
8. Placez la boîte opératoire contenant l’ovocyte sur la platine chaude de l’opérateur de microscope préparé.
9. Ajustez la distance focale du microscope sous l’objectif 10x pour que les bords des microgouttelettes à l’intérieur de la parabole soient clairs et visibles.
10. Abaissez l’aiguille d’injection dans la bande PVP de la parabole de commande ICSI. Ajustez le microscope pour que l’aiguille d’injection soit clairement visible et inhalez une petite quantité de PVP dans l’aiguille d’injection en même temps.
11. Déplacez l’aiguille d’injection dans la longue bande sur le côté droit de la piste en forme de U et extrayez des spermatozoïdes de haute qualité avec une bonne morphologie et une motilité progressive.
12. Transférez le sperme dans la bandelette PVP du côté droit et placez le sperme au fond de la boîte d’opération.
13. Appuyez doucement sur l’aiguille d’injection au milieu ou dans la partie inférieure de la queue du spermatozoïde, tirez rapidement l’aiguille d’injection vers l’arrière et grattez le spermatozoïde pour l’arrêter.
14. Inspirez le sperme de la queue à la tête dans l’aiguille d’injection.
15. Transférez l’aiguille d’injection dans la gouttelette de milieu de traitement de l’ovocyte contenant l’ovocyte sur le côté droit.
16. Abaissez l’aiguille de retenue de l’ovocyte et déplacez doucement l’ovocyte pour positionner le premier corps polaire à 12 heures, en fixant l’ovocyte.
17. Ajustez l’aiguille microchirurgicale et la membrane ovocytaire sur le même plan horizontal. Poussez le spermatozoïde jusqu’à l’extrémité de l’aiguille d’injection.
18. Passez verticalement à travers la zone pellucide à 3 heures sur l’ovocyte et continuez à injecter l’aiguille jusqu’à ce qu’elle atteigne le centre de l’ovocyte ou croise légèrement la position centrale, avec une légère rétraction de l’aiguille d’injection.
    REMARQUE : Lorsque le reflux rapide se produit dans le cytoplasme et les spermatozoïdes, cela indique que la membrane de l’ovocyte s’est rompue et que l’aspiration a cessé.
19. Injectez lentement les spermatozoïdes dans le cytoplasme de l’ovocyte et sortez de l’aiguille d’injection. La profondeur d’injection des spermatozoïdes dans le cytoplasme doit être d’environ 50 à 75 % du diamètre de l’ovocyte.
20. Après avoir retiré l’aiguille d’injection, ajustez la pression négative de l’aiguille de retenue des ovocytes pour libérer les ovocytes.
21. Répétez les étapes ci-dessus jusqu’à ce que tous les ovocytes matures aient été injectés.
22. Transférez la parabole ICSI de la plaque chauffante du microscope au microscope de dissection.
23. Retirez la boîte de culture de clivage de l’incubateur.
24. Transférez l’ovocyte de spermatozoïde injecté dans une microgouttelette dans une boîte de culture de clivage.
25. Remettez la boîte de culture de clivage dans un incubateur à 37 °C, 6 % CO₂, 5 % O₂ .

6. Préparation des spermatozoïdes à l’aide de la méthode DGC

1. Ajouter 1,5 mL de solution de centrifugation à gradient de densité de 45 % dans un tube à essai stérile à fond conique de 15 mL.
2. Ajouter lentement 1,5 mL de solution de centrifugation à gradient de densité à 90 % au fond de la solution de centrifugation à gradient de densité à 45 %, en maintenant l’interface entre les deux liquides.
3. Ajouter délicatement la semence liquéfiée dans la solution de centrifugation à gradient et centrifuger à 300 x g pendant 15 min (à température ambiante).
4. Retirer le surnageant et ajouter environ 0,5 mL du sédiment spermatique restant à 3 mL de milieu de fécondation. Soufflez et mélangez bien.
5. Centrifuger à température ambiante à 200 x g pendant 5 min.
6. Pipeter le surnageant et laisser environ 0,2 mL de sédiment.
7. Ajoutez une quantité appropriée de milieu de fertilisation pour remettre les sédiments en suspension, comptez la concentration et la vitalité des spermatozoïdes et enregistrez-les. Placer dans un incubateur à 37 °C, 6 % de CO2 pour une utilisation ultérieure.

7. Détection de l’intégrité de l’ADN nucléaire des spermatozoïdes (méthode de dispersion de la chromatine des spermatozoïdes, SCD)

1. Ajustez la température intérieure à 20-28 °C avant de réaliser l’expérience. Retirez le kit de réactifs et laissez-le s’équilibrer à température ambiante pendant 30 à 60 minutes.
2. Préparez la solution dénaturante : Prenez 0,8 mL de solution dénaturante concentrée et ajoutez-la à 100 mL d’eau distillée.
3. Préparez la solution d’éthanol à 70 % : Prenez 26,65 ml d’eau distillée et 70,35 ml d’éthanol anhydre pour préparer la solution d’éthanol à 70 %.
4. Préparez la solution d’éthanol à 90 % : Prenez 9,55 ml d’eau distillée et 90,45 ml d’éthanol anhydre pour préparer la solution d’éthanol à 90 %.
5. Placez le tube d’agarose à bas point de fusion (contenant 25 μL de solution d’agarose à bas point de fusion) dans un bain-marie à 90-100 °C pendant 1 à 2 minutes jusqu’à ce que le gel d’agarose soit complètement fondu. Ensuite, placez le tube dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 min jusqu’à ce que la température soit constante.
6. Prendre 3 à 10 μL de sperme avant le traitement d’optimisation et une suspension de spermatozoïdes après le traitement d’optimisation. Ajoutez-les dans différents tubes d’agarose à bas point de fusion, puis mélangez soigneusement.
7. Prenez 30 μL de la suspension d’agarose à bas point de fusion contenant des spermatozoïdes et déposez-la sur une lame de verre prétraitée en position horizontale.
8. Couvrez doucement le verre de protection (22 mm x 11 mm) avec la diapositive, en évitant autant que possible la formation de bulles.
9. Placez la lame de verre prétraitée dans un réfrigérateur à une température de 2 à 8 °C pendant 4 min, en maintenant la lame en position horizontale tout au long du processus. Retirez la lame de verre du réfrigérateur et faites-la glisser doucement pour retirer la vitre de protection.
10. Immergez rapidement la lame de verre prétraitée dans la solution dénaturante pendant 7 min.
11. Retirez la lame de verre prétraitée et faites-la tremper dans de l’eau distillée pendant 5 s.
12. Retirez la lame de verre prétraitée et mettez-la debout à la verticale. Utilisez du papier filtre pour absorber les gouttelettes d’eau à la surface de la lame et évitez de toucher la zone de l’échantillon.
13. Plongez la lame de verre prétraitée dans le tampon de lyse et réagissez avec précision pendant 20 min.
14. Plongez les fragments prétraités dans la solution de lavage pendant 3 min pour éliminer la solution de lyse.
15. Retirez la lame de verre prétraitée et plongez-la dans une solution d’éthanol à 70 % pendant 2 min.
16. Retirez la lame de verre prétraitée et plongez-la dans une solution d’éthanol à 90 % pendant 2 min.
17. Retirez la lame de verre prétraitée et plongez-la dans une solution d’éthanol anhydre pendant 2 min.
18. Retirez la lame de verre prétraitée et laissez-la sécher naturellement à l’air.
19. Préparez la solution de coloration Wright A et la solution B dans un flacon vide brun dans un rapport de 1:1.
20. Placez la lame de verre prétraitée horizontalement et ajoutez la solution de colorant mixte sur la lame, en vous assurant que la solution de colorant recouvre toute la lame (environ 0,5 à 1 mL de solution de colorant).
21. Après avoir coloré pendant 5 min, rincez doucement la lame de vitrail avec de l’eau distillée 10 à 15 fois pour éliminer l’excès de colorant.
22. Laissez sécher naturellement la lame de verre et observez-la au microscope optique à 400×. Comptez plus de 200 spermatozoïdes et déterminez le pourcentage de spermatozoïdes anormaux avec de petits anneaux de halo, sans anneaux de halo et une dégénérescence.

8. Analyse statistique

1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide de logiciels disponibles dans le commerce.
2. Comparez le DFI ( %) entre le sperme d’origine, le DGC et l’UHS à l’aide du test de Friedman.
   REMARQUE : Pour des comparaisons par paires de deux méthodes, utilisez le test de Wilcoxon à rang signé. Considérons qu’une valeur p ≤ 0,05 est statistiquement significative.

Résultats

Les méthodes UHS et DGC ont été utilisées pour optimiser le traitement de 21 échantillons et comparer l’indice de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes entre les deux méthodes. La méthode utilisant la piste UHS dans la boîte ICSI peut remplacer la DGC, ce qui peut causer des dommages aux spermatozoïdes. Les spermatozoïdes de haute qualité avec une bonne motilité progressive nagent en douceur le long du bord de la piste en forme de U (Figure 2

Discussion

L’étape clé pour séparer des spermatozoïdes de haute qualité à l’aide de la méthode UHS décrite dans cet article est la mise en place d’une voie UHS avec des gouttelettes tampons. La voie UHS et les gouttelettes tampons sont créées à partir de sperme lavé et reçu. La voie UHS guide les spermatozoïdes de haute qualité pour nager librement et s’accumuler le long du bord de la piste, ce qui facilite leur collecte. Les gouttelettes tampons réduisent la viscosité du s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
7% Polyvinyl pyrrolidone Solution	Vitrolife Sweden AB	10111	ICSI
Aspirator	LABOTECT	-	Aspirator
Biological clean workbench	Suzhou Antai	-	Biological clean workbench
Blastocyst culture medium	Vitrolife Sweden AB	10132	Blastocyst culture medium
Cleavage culture medium	Vitrolife Sweden AB	10128	Cleavage culture medium
CO2 incubator	Thermo Scientific	-	CO2 incubator
Culture oil	Vitrolife Sweden AB	10029	OVOIL
Disposable plastic transfer pipette	BD Falcon	357575	disposable plastic transfer pipette
Fertilization medium	Vitrolife Sweden AB	10136	G-IVF PLUS
ICSI operating dish	BD Falcon	351006	Petri dish
Instant hyaluronidase	Vitrolife Sweden AB	10017	Instant hyaluronidase
Inverted microscope	NIKON	-	Inverted microscope
IVF Workstation	Denmark K-SYSTEM	-	IVF Workstation
Makler counting chamber	Sefi Medical Instruments		Makler counting chamber
Micro operating system	NIKON	-	Micro operating system
Oocyte processing medium	Vitrolife Sweden AB	10130	G-MOPS PLUS
Optical microscope	OLYMPUS	-	Optical microscope
Phase contrast microscope	NIKON	-	Phase contrast microscope
Sperm Counting Board	Markler	-	Sperm Counting Board
Sperm gradient separation solution	Vitrolife Sweden AB	10138	SpermGrad
Sperm nucleus DNA integrity Kit	Shenzhen HuaKang	-	Sperm Nucleus DNA Integrity Kit (SCD)
Stereoscopic microscope	NIKON	-	Stereoscopic microscope
Tabletop centrifuge	HETTICH	-	Tabletop centrifuge
Thermostatic test tube rack	GRANT	-	Thermostatic test tube rack
Tri-gas incubator	ASTEC	-	Tri-gas incubator