낮은 DNA 단편화 지수로 고품질 정자를 준비하기 위한 U자형 수평 수영 기술

요약

이 프로토콜은 정자 운동성 특성과 thigmotaxis를 활용하여 DNA 단편화 지수가 낮은 고품질 정자를 스크리닝하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 U자형 수평 수영 레인을 사용하여 고품질 정자가 완충 방울을 통해 반대쪽에 도달할 수 있도록 하고 죽은 정자, 세포 파편 및 불순물은 배제합니다.

초록

인간의 정액은 점진적으로 운동하는 정자, 비점진적으로 운동하는 정자, 불활동성 정자, 세포 파편 및 점성 정액 혈장을 포함하는 복잡한 혼합물입니다. 고품질 정자는 정상적인 형태를 가진 점진적으로 운동하는 정자를 말하며, 종종 DNA 단편화 지수(DFI)가 낮고 수정 가능성이 높습니다. 고품질 정자를 준비하는 것은 인간 보조 생식 기술에서 중요한 단계입니다. 기존의 정자 전처리 방법인 불연속 밀도 구배 원심분리(DGC)는 시간이 많이 걸리고 노동 집약적입니다. 반복적인 원심분리는 정자 DNA를 손상시켜 후속 수정 및 배아 발달에 영향을 미칠 수 있습니다. 본 연구에서는 세포질 내 정자 주입(ICSI) 정자를 준비하기 위한 U자형 수평 수영(UHS) 방법을 소개하여 원심분리가 정자 DNA에 미치는 해로운 영향을 크게 제거합니다. UHS 방법은 ICSI 작동 접시 내에서 비료 배지를 사용하여 UHS 레인을 만드는 것입니다. 10μL 수정 배지 미세방울을 UHS 레인 왼쪽의 시작점에 배치하여 정액을 담습니다. 두 개의 추가 10μL 비료 배지 완충액 방울이 레인의 왼쪽 중간 부분을 따라 간격으로 배치되며, 모든 방울은 수정 배지로 연결됩니다. 그런 다음 접시를 배양 오일로 덮고 37 ° C에서 6 % CO₂ 와 함께 밤새 배양하여 평형을 이룹니다. 그 후, 3 μL의 정액이 시작점의 미세방울에 추가됩니다. 고품질 정자는 UHS 레인의 오른쪽으로 헤엄쳐 ICSI 주사 바늘로의 흡입을 용이하게 합니다. 죽은 정자, 세포 파편 및 기타 점성 불순물은 대부분 초기 지점 또는 완충액 방울에 남아 있습니다. UHS 및 DGC 기술을 모두 사용하여 21개의 정액 샘플을 동시에 처리하고 DFI를 비교했습니다. 그 결과, DGC 그룹의 DFI는 5.5% ± 3.2%인 반면, UHS 그룹의 DFI는 1.7% ± 1.1%였다. 두 그룹 간의 차이는 통계적으로 유의했다(P < 0.05).

서문

정액 최적화 및 정자 준비 기술은 구조적으로나 기능적으로 우수한 정자로 풍부한 세포 분획을 얻는 데 중요한 역할을 하며, 이는 인간 보조 생식 기술의 핵심 단계입니다¹. 정액 최적화의 목적은 다음과 같습니다 : (1) 정액 혈장에서 프로스타글란딘, 면역 활성 세포, 항 정자 항체, 움직이지 않는 저품질 정자, 박테리아 및 파편을 줄이거나 제거합니다. (2) 정액의 점도를 줄이거나 제거합니다. (3) 정자 수용력을 촉진하고 수정 능력을 향상시킵니다. 이상적인 정자 준비 기술은 정자와 백혈구에 의한 활성산소종(ROS) 생산을 통해 DNA 무결성을 보존하고 기능 장애를 유발하지 않는 고기능 정자 집단을 회복해야 합니다².

현재 가장 널리 사용되는 정자 제제 기술은 DGC 방법입니다. 이 방법의 장점은 회수율이 높고³ 표준화가 쉽다는 것입니다. 실제 사용에서는 이중 밀도 그래디언트 방법⁴, 미니 DGC 방법 또는 단층 그래디언트 원심분리 방법⁵에 대한 시편의 품질에 따라 유연하게 선택할 수 있습니다. 이 방법은 세포 파편, 오염된 백혈구, 비생식 세포 및 퇴행성 생식 세포가 없는 활력이 좋은 고품질 정자를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 이 방법의 단점은 원심분리가 필요하여 정자 DNA가 손상될 수 있다는 것입니다⁶.

여기에 제시된 방법은 Baldini et ^al.7의 원래 연구에서 채택된 것으로, 주사 접시에서 수평 정자 이동에 초점을 맞췄습니다. 이 수정된 방법은 U자형 수평 레인을 통합하여 강한 생명력을 가진 고품질 정자를 분리합니다. 원심분리로 인한 DNA 손상을 방지하고 세포질 내 정자 주입(ICSI) 절차 중 죽은 정자, 세포 파편 및 기타 점성 불순물의 영향을 최소화합니다.

구체적인 접근 방식에는 수정 배지를 사용하여 ICSI 운영 접시에 UHS 레인을 만드는 것이 포함됩니다. 10μL 수정 배지 미세방울을 UHS 레인의 왼쪽 시작점에 배치하여 정액을 담습니다. 두 개의 추가 10μL 비료 배지 완충액 방울이 UHS 레인의 왼쪽 중간 부분에 간격으로 배치되고 모든 방울은 수정 배지로 연결됩니다. 배양유로 설정을 덮은 후, 접시는 평형을 위해 6 % CO₂ 와 함께 37 ° C에서 밤새 배양됩니다. 그 후, 3μL의 정액을 UHS 레인의 왼쪽에 있는 시작점의 미세방울에 추가합니다. 고품질 정자는 UHS 레인의 오른쪽에 있는 트랙으로 헤엄쳐 가서 ICSI 주사 바늘로 수집을 용이하게 합니다. 죽은 정자, 세포 파편 및 기타 점성 불순물은 주로 원래 위치 또는 완충액 방울에 남아 있습니다.

미세유체 칩은 여성 생식관의 자연 선택 과정을 시뮬레이션하여 원심분리 없이 정액에서 고품질 정자를 최적으로 분리할 수 있습니다. 이는 정자^{운동성을 개선}하고8 정자 DNA 단편^{화 지수를} 줄이며9 임신 결과를 향상시키는 데 매우 중요하다¹⁰. 그러나 이러한 장치의 제조는 복잡하고 비용이 많이 들며 광범위하게 구현하기가 어렵습니다.

본 명세서에 기술된 프로토콜은 새롭고 간단하며 실현 가능한 대안을 제시한다. 정자 운동성 특성을 활용함으로써 이 방법은 미세유체 기술과 유사한 결과를 달성합니다. 준비된 정자는 강한 생명력, 낮은 DNA 단편화 지수를 나타내며 ICSI에 사용하기에 매우 적합합니다.

프로토콜

본 연구는 난징의과대학 산하 화이안 제1인민병원 의료윤리위원회의 승인을 받았다(승인번호: KY-2024-181-01). 이 연구에 사용된 샘플의 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 절차는 우수한 실험실 관행 및 임상 지침^11,12에 따라 숙련된 직원이 수행해야 합니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.

1. ICSI 운영 접시의 준비

1. 20μL 비료 배지를 사용하여 ICSI 작동 접시에 U자형 트랙을 생성합니다(그림 1). U자형 트랙의 왼쪽 트랙 길이는 약 30mm, 오른쪽 트랙의 길이도 약 30mm여야 합니다.
2. 피펫으로 10μL 비료 배지를 빨아들이고 U자형 트랙의 왼쪽 시작점에 원형 액적을 만듭니다. U자형 트랙의 왼쪽 시작점에 연결하여 정액 스톡 용액을 추가합니다.
3. UHS 레인의 왼쪽 중간 섹션에 간격으로 두 개의 10μL 비료 배지 완충액을 생성합니다. 모든 액적을 수정 매체와 연결하십시오.
4. 2.5μL 폴리비닐 피롤리돈(PVP)을 사용하여 U자형 레인의 오른쪽에 긴 액체 방울 스트립을 만듭니다. PVP 스트립이 U자형 차선의 오른쪽 차선과 평행한지 확인합니다.
5. PVP 스트립의 오른쪽에 있는 난모 세포 처리 매체를 사용하여 액적당 20μL로 6개의 마이크로액적을 만듭니다.
6. 접시에 7mL 배양 오일을 추가하여 오일이 액적의 가장 높은 지점을 덮도록 합니다. 균형을 위해 37 ° C, 6 % CO₂ 인큐베이터에 밤새 놓습니다.

2. 정액 샘플 채취

1. 환자에게 정액 샘플 채취에 관한 명확한 서면 및 구두 지침을 제공합니다. 검체 채취가 완료되었는지 확인하고 환자에게 채취 전 3-7일 동안 사정을 삼가도록 지시합니다.
2. 자위를 통해 정액을 일회용, 멸균 및 무독성 특수 정자 수집 컵에 모으십시오. 전체 사정이 수집되었는지 확인하고 개인에게 샘플의 일부라도 손실되었는지 보고하도록 지시합니다.
3. 환자 배우자의 이름, 유효한 신분증 및 지문을 확인합니다. 정자 채취 컵의 본체와 뚜껑에 환자 배우자의 이름과 의료 기록 번호를 표시합니다.
4. 남성 환자가 정액을 채취한 후 직원과 환자가 직접 대면하여 검체를 건네줍니다. 포장 및 보관을 위해 소량의 정액 샘플을 채취하십시오. 포장 영역에서 환자 표시를 확인하십시오.
5. 캡슐화된 표본에 번호를 매기고 2년 동안 보관합니다. 환자 정보, 식별 번호, 수혜자와 증인의 서명을 정액 처리 일지에 기록합니다.
6. 생식센터 직원이 의심스러운 환자의 신원을 발견하면 검체 수령을 중단하고 환자의 신원을 다시 확인하십시오. 두 개 이상의 검체를 동시에 받지 마십시오. 표본에 혼동이 의심되는 경우 수령을 중단하십시오.

3. 정액 표본 분석

1. 정액 표본의 색깔을 관찰합니다.
   참고: 정상 정액은 액화 후 균일하고 회백색으로 나타납니다. 정자 농도가 매우 낮은 정액은 투명하게 보일 수 있습니다. 적혈구가 있는 경우 정액이 적갈색으로 나타날 수 있습니다. 환자가 황달에 걸리거나 특정 비타민을 복용하면 정액이 노랗게 보일 수 있습니다.
2. 계량 방법을 사용하여 0.1mL까지 정확하게 정액의 양을 측정합니다.
3. 정액 샘플을 37°C에서 15-30분 동안 놓습니다. 넓은 구경(직경 약 1.5mm)의 플라스틱 일회용 피펫에 정액을 흡입하여 정액이 중력에 의해 떨어지도록 합니다. 실의 길이를 관찰하십시오.
   참고: 정상적인 액화 사정은 작고 불연속적인 방울을 형성합니다. 점도가 비정상적이면 방울로 인해 2cm보다 긴 나사산이 형성됩니다.
4. 정액이 여전히 60분 이내에 액화되지 않으면 동일한 양의 수정 배지를 추가하십시오. 그런 다음 완전히 액화될 때까지 일회용 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 혼합물을 반복적으로 흡입하고 내쉬십시오.
5. 정밀 pH 시험지(pH 6.0-10.0)를 사용하여 정액의 pH 값을 측정합니다.
6. 완전히 액화된 정액 10μL를 Makler 계수실에 떨어뜨립니다. 광학 현미경으로 200x 필드에서 정자 운동성을 평가합니다. 정자 응집과 비정자 세포의 존재를 관찰합니다.
7. 광학 현미경으로 200x 필드에서 정자 농도를 평가합니다.

4. 난모세포 채취

1. 난모세포 채취 전날 난모세포(OPD)를 채취하기 위한 접시를 준비합니다. 2.5mL의 난모세포 처리 배지를 35mm 멸균 배양 접시에 추가합니다. 그런 다음 기름 1.5mL를 넣고 접시를 37°C 인큐베이터에 밤새 넣어 평형을 이룹니다.
2. 난모세포 채취 전날 난모세포 배양(OCD)을 위한 두 가지 요리를 준비합니다. 멸균 중앙 우물 배양 접시의 내부 링에 1mL의 수정 배지를 추가한 다음 1mL의 오일을 추가합니다. 외부 고리에 4mL의 수정 배지를 추가합니다. 접시를 37 ° C, 6 % CO₂ 인큐베이터에 넣어 밤새 평형을 이룹니다.
3. 모든 히터와 가열판을 켜고 난모세포 채취 30분 전에 온도를 측정합니다.
4. 손 소독제로 손을 씻고 흐르는 물로 철저히 헹굽니다. 깨끗하고 멸균되며 먼지가 없는 장갑을 착용하십시오.
5. 멸균 배양 접시를 37°C 가열 플랫폼에서 예열합니다.
6. 난모세포를 채취하기 전에 환자의 신원을 엄격하게 확인합니다.
7. 음압을 통해 여포액을 멸균 시험관에 흡입한 다음 즉시 실험실 배아학자에게 넘깁니다.
8. 모든 여포액을 멸균 배양 접시에 붓고 저배율 실체현미경으로 난모세포 코로나 적운 복합체(OCCC)를 검색합니다. 피펫을 사용하여 OCCC를 집어 들고 37°C에서 임시 보관하기 위해 OPD에 넣습니다.
9. 난포액에 있는 난포의 양, 색, 난포 수 및 OCCC의 수를 기록합니다.
10. 난모세포 채취 후 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 OCCC를 OCD로 옮깁니다. 배양 인큐베이터(37°C, 6% CO₂, 5% O₂ 및 포화 습도)에 2시간 동안 빠르게 놓습니다.
11. 4웰 접시를 준비하고, 첫 번째 웰에 히알루로니다아제 용액 0.5mL를 추가하고, 나머지 3웰 각각에 난모세포 처리 배지 1mL를 첨가합니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
12. 파스퇴르 피펫을 사용하여 4.10단계의 OCCC를 잘 함유된 히알루로니다아제로 30초 동안 옮깁니다. 그런 다음 OCCC를 잘 함유된 난모세포 처리 매체로 옮깁니다.
13. 150μm 직경의 난모세포 박리관을 사용하여 OCCC를 불어 흡입하여 과립층 세포를 제거합니다. 그런 다음 새 파스퇴르 피펫을 사용하여 난모세포를 난모세포 처리 매체로 옮겨 세척합니다. 다른 사전 평형 OCD로 옮기고 37°C, 6% CO₂ 인큐베이터에 넣습니다.

5. 정자 선택 및 ICSI 작동

1. 1.1단계에서 1.6단계까지 준비된 ICSI 운영 접시의 U자형 트랙의 왼쪽 시작점에 있는 수정 배지 미세방울에 5μL의 정액을 추가합니다.
2. ICSI 작동 접시를 37-60분 동안 6°C, 6% CO₂ 의 인큐베이터에 넣습니다.
3. 도립 현미경, 현미경 운영 체제 및 스테이지 가열 스테이지를 열어 모든 작동 제어가 원래 제어 가능한 범위로 복원되어 부드럽고 편안한 작동이 가능한지 확인합니다.
4. ICSI 바늘을 바늘 홀더에 설치합니다. 마이크로 매니퓰레이터에 바늘 홀더를 고정하고, 4x 대물 렌즈에서 고정 바늘과 주사 바늘을 조정하고, 두 바늘이 스테이지에 상대적이고 평행하도록 각도와 위치를 순차적으로 조정합니다. × 20 대물렌즈 아래에서 수술 바늘의 이동 범위를 확인하십시오.
5. 4x 대물렌즈 아래에서 난모세포 고정 바늘과 주사 바늘의 각도와 위치를 조정하여 두 개의 바늘 머리가 스테이지에 상대적이고 평행하도록 합니다. 작동 바늘을 앞, 뒤, 왼쪽, 오른쪽으로 움직입니다. 10x 및 20x 대물렌즈 아래에서 작동 바늘의 이동 범위를 확인하십시오.
6. 난모세포 고정 바늘과 주사 바늘을 들어 올려 수술대와 가열 테이블 사이의 높이가 수술 바늘을 건드리지 않고 수술 용기를 쉽게 배치할 수 있도록 합니다.
7. 이중 확인 후, 4.12단계에서 선택한 난모세포를 ICSI 작동 접시의 난모세포 처리 매체 미세방울로 액적당 하나씩 전달합니다.
8. 난모세포가 들어 있는 수술 접시를 준비된 현미경 작업자의 뜨거운 스테이지에 놓습니다.
9. 10x 대물 렌즈 아래에서 현미경의 초점 거리를 조정하여 작동 접시 내부의 미세 방울 가장자리를 선명하고 잘 보이게 합니다.
10. ICSI 작동 접시의 PVP 스트립에 주사 바늘을 내립니다. 주사 바늘이 명확하게 보이도록 현미경을 조정하고 동시에 주사 바늘에 소량의 PVP를 흡입합니다.
11. U자형 트랙의 오른쪽에 있는 긴 스트립에 주사 바늘을 움직여 형태가 좋고 진행성 운동성이 좋은 고품질 정자를 추출합니다.
12. 정자를 오른쪽의 PVP 스트립으로 옮기고 정자를 수술 접시 바닥에 놓습니다.
13. 정자 꼬리의 중간 또는 아래쪽 부분에 있는 주사 바늘을 부드럽게 누르고, 주사 바늘을 빠르게 뒤로 당기고, 정자를 긁어 멈추게 합니다.
14. 꼬리에서 머리까지 정자를 주사 바늘로 흡입합니다.
15. 주사 바늘을 오른쪽에 있는 난모세포를 포함하는 난모세포 처리 배지 액적에 옮깁니다.
16. 난모세포 보유 바늘을 내리고 난모세포를 부드럽게 움직여 첫 번째 극체를 12시 방향에 위치시켜 난모세포를 고정합니다.
17. 미세수술 바늘과 난모세포막을 동일한 수평면으로 조정합니다. 주입 바늘 끝에 정자를 밀어 넣습니다.
18. 난모세포의 3시 방향에 있는 투명대를 수직으로 통과하고 주사 바늘을 약간 후퇴시키면서 난모세포의 중심에 도달하거나 중앙 위치를 약간 교차할 때까지 바늘을 계속 주입합니다.
    참고: 세포질과 정자에서 급격한 역류가 발생하면 난모세포막이 파괴되어 흡인이 멈췄음을 나타냅니다.
19. 난모세포의 세포질에 정자를 천천히 주입하고 주사 바늘을 빠져 나옵니다. 세포질로 정자를 주입하는 깊이는 난모세포 직경의 약 50%-75%여야 합니다.
20. 주사 바늘을 빼낸 후 난모세포를 잡고 있는 바늘의 음압을 조정하여 난모세포를 방출합니다.
21. 모든 성숙한 난모세포가 주입될 때까지 위의 단계를 반복합니다.
22. ICSI 접시를 현미경 핫 플레이트에서 해부 현미경으로 옮깁니다.
23. 인큐베이터에서 분열 배양 접시를 제거합니다.
24. 주입된 정자 난모세포를 분열 배양 접시의 미세방울로 옮깁니다.
25. 절단 배양 접시를 37 °C, 6% CO₂, 5% O₂ 인큐베이터에 다시 놓습니다.

6. DGC 방법을 이용한 정자 준비

1. 1.5mL의 45% 밀도 구배 원심분리 용액을 15mL 멸균 원추형 바닥 시험관에 추가합니다.
2. 1.5mL의 90% 밀도 구배 원심분리 용액을 45% 밀도 구배 원심분리 용액의 바닥에 천천히 첨가하여 두 액체 사이의 계면을 유지합니다.
3. 액화 정액을 구배 원심분리 용액에 부드럽게 첨가하고 300 x g 에서 15분 동안(실온에서) 원심분리합니다.
4. 상층액을 제거하고 약 0.5mL의 남은 정자 침전물을 3mL의 수정 배지에 첨가합니다. 불어 잘 섞는다.
5. 실온에서 200 x g 으로 5분 동안 원심분리기.
6. 상층액을 피펫팅하고 약 0.2mL의 침전물을 남깁니다.
7. 적절한 양의 수정 배지를 추가하여 퇴적물을 재현탁시키고 정자 농도와 활력을 계산하고 기록합니다. 나중에 사용할 수 있도록 37°C, 6% CO2 인큐베이터에 넣습니다.

7. 정자 핵 DNA 무결성 검출 (Sperm Chromatin Dispersion Method, SCD)

1. 실험을 수행하기 전에 실내 온도를 20-28 °C로 조정하십시오. 시약 키트를 제거하고 실온에서 30-60분 동안 평형을 이룹니다.
2. 변성 용액 준비 : 농축 변성 용액 0.8mL를 증류수 100mL에 첨가하십시오.
3. 70% 에탄올 용액 준비: 증류수 26.65mL와 무수 에탄올 70.35mL를 취하여 70% 에탄올 용액을 준비합니다.
4. 90% 에탄올 용액 준비: 증류수 9.55mL와 무수 에탄올 90.45mL를 취하여 90% 에탄올 용액을 준비합니다.
5. 저융점 아가로스 튜브(저융점 아가로스 용액 25μL 포함)를 90-100°C 수조에 아가로스 젤이 완전히 녹을 때까지 1-2분 동안 놓습니다. 그런 다음 온도가 일정해질 때까지 37°C 수조에 튜브를 5분 동안 놓습니다.
6. 최적화 치료 전에 3-10 μL의 정액을 복용하고 최적화 치료 후 정자를 현탁시킵니다. 다른 저융점 아가로스 튜브에 첨가한 다음 완전히 섞습니다.
7. 정자가 포함된 저융점 아가로스 현탁액 30μL를 전처리된 유리 슬라이드에 수평 위치로 떨어뜨립니다.
8. 커버 유리(22mm x 11mm 크기)를 슬라이드로 부드럽게 덮고 가능한 한 기포가 생기지 않도록 합니다.
9. 전처리된 유리 슬라이드를 2-8°C의 냉장고에 4분 동안 놓고 전체 과정에서 슬라이드를 수평 위치에 유지합니다. 냉장고에서 유리 슬라이드를 제거하고 부드럽게 밀어 덮개 유리를 제거하세요.
10. 전처리된 유리 슬라이드를 변성 용액에 7분 동안 빠르게 담그십시오.
11. 전처리된 유리 슬라이드를 제거하고 증류수에 5초 동안 담가둡니다.
12. 전처리된 유리 슬라이드를 제거하고 똑바로 세웁니다. 여과지를 사용하여 슬라이드 표면의 물방울을 흡수하고 시편 영역을 만지지 마십시오.
13. 전처리된 유리 슬라이드를 용해 버퍼에 담그고 20분 동안 정확하게 반응합니다.
14. 전처리된 단편을 세척액에 3분 동안 담궈 용해액을 씻어냅니다.
15. 전처리된 유리 슬라이드를 제거하고 70% 에탄올 용액에 2분 동안 담급니다.
16. 전처리된 유리 슬라이드를 제거하고 90% 에탄올 용액에 2분 동안 담그십시오.
17. 전처리된 유리 슬라이드를 제거하고 무수 에탄올 용액에 2분 동안 담급니다.
18. 사전 처리된 유리 슬라이드를 제거하고 자연 건조시킵니다.
19. 갈색의 빈 병에 Wright 염색 용액 A와 용액 B를 1:1 비율로 준비합니다.
20. 전처리된 유리 슬라이드를 수평으로 놓고 혼합 염료 용액을 슬라이드에 추가하여 염료 용액이 전체 슬라이드(약 0.5-1mL의 염료 용액)를 덮도록 합니다.
21. 5분 동안 염색한 후 스테인드 글라스 슬라이드를 증류수로 10-15회 부드럽게 헹구어 과도한 염색제를 제거합니다.
22. 유리잔을 자연 건조시키고 광학 현미경으로 400×로 관찰합니다. 200개 이상의 정자를 세고 작은 후광 고리, 후광 고리가 없는 비정상 정자 및 변성을 확인합니다.

8. 통계 분석

1. 상용 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
2. Friedman 테스트를 사용하여 원래 정액, DGC 및 UHS 간의 DFI(%)를 비교합니다.
   참고: 두 방법의 쌍별 비교를 위해 Wilcoxon 부호 순위 테스트를 사용합니다. p-값 ≤ 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.

결과

UHS 및 DGC 방법을 사용하여 21개 샘플의 처리를 최적화하고 두 방법 간의 정자 DNA 단편화 지수를 비교했습니다. ICSI 접시에서 UHS 트랙을 사용하는 방법은 정자에 손상을 줄 수 있는 DGC를 대체할 수 있습니다. 진행성 운동성이 좋은 고품질 정자는 U자형 트랙의 가장자리를 따라 부드럽게 헤엄치므로(그림 2) ICSI 바늘이 개별적으로 쉽게 잡을 수 있습니다...

토론

이 기사에서 설명한 UHS 방법을 사용하여 고품질 정자를 분리하는 핵심 단계는 완충액이 있는 UHS 레인을 설정하는 것입니다. UHS 레인과 완충액은 모두 세척 및 수신된 정액을 사용하여 생성됩니다. UHS 레인은 고품질 정자가 자유롭게 수영하고 트랙 가장자리를 따라 축적되도록 안내하여 수집하기 쉽습니다. 완충액 방울은 정액의 점도를 낮추어 죽은 정자, 세포 파편 및 기...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
7% Polyvinyl pyrrolidone Solution	Vitrolife Sweden AB	10111	ICSI
Aspirator	LABOTECT	-	Aspirator
Biological clean workbench	Suzhou Antai	-	Biological clean workbench
Blastocyst culture medium	Vitrolife Sweden AB	10132	Blastocyst culture medium
Cleavage culture medium	Vitrolife Sweden AB	10128	Cleavage culture medium
CO2 incubator	Thermo Scientific	-	CO2 incubator
Culture oil	Vitrolife Sweden AB	10029	OVOIL
Disposable plastic transfer pipette	BD Falcon	357575	disposable plastic transfer pipette
Fertilization medium	Vitrolife Sweden AB	10136	G-IVF PLUS
ICSI operating dish	BD Falcon	351006	Petri dish
Instant hyaluronidase	Vitrolife Sweden AB	10017	Instant hyaluronidase
Inverted microscope	NIKON	-	Inverted microscope
IVF Workstation	Denmark K-SYSTEM	-	IVF Workstation
Makler counting chamber	Sefi Medical Instruments		Makler counting chamber
Micro operating system	NIKON	-	Micro operating system
Oocyte processing medium	Vitrolife Sweden AB	10130	G-MOPS PLUS
Optical microscope	OLYMPUS	-	Optical microscope
Phase contrast microscope	NIKON	-	Phase contrast microscope
Sperm Counting Board	Markler	-	Sperm Counting Board
Sperm gradient separation solution	Vitrolife Sweden AB	10138	SpermGrad
Sperm nucleus DNA integrity Kit	Shenzhen HuaKang	-	Sperm Nucleus DNA Integrity Kit (SCD)
Stereoscopic microscope	NIKON	-	Stereoscopic microscope
Tabletop centrifuge	HETTICH	-	Tabletop centrifuge
Thermostatic test tube rack	GRANT	-	Thermostatic test tube rack
Tri-gas incubator	ASTEC	-	Tri-gas incubator