Tecnica di nuoto orizzontale a forma di U per la preparazione di spermatozoi di alta qualità con basso indice di frammentazione del DNA

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per lo screening di spermatozoi di alta qualità con un basso indice di frammentazione del DNA utilizzando le caratteristiche di motilità degli spermatozoi e la tigmotassi. Il metodo utilizza una corsia di nuoto orizzontale a forma di U, che consente agli spermatozoi di alta qualità di raggiungere il lato opposto attraverso goccioline tampone, escludendo gli spermatozoi morti, i detriti cellulari e le impurità.

Abstract

Lo sperma umano è una miscela complessa che comprende spermatozoi progressivamente mobili, spermatozoi non progressivamente mobili, spermatozoi immobili, detriti cellulari e plasma seminale viscoso. Gli spermatozoi di alta qualità si riferiscono a spermatozoi progressivamente mobili con morfologia normale, che spesso mostrano un indice di frammentazione del DNA (DFI) più basso e un potenziale di fecondazione più elevato. La preparazione di spermatozoi di alta qualità è un passo fondamentale nella tecnologia di riproduzione assistita dall'uomo. Il metodo tradizionale di preparazione degli spermatozoi, la centrifugazione discontinua in gradiente di densità (DGC), richiede molto tempo e lavoro. La centrifugazione ripetuta può danneggiare il DNA degli spermatozoi, influenzando così la successiva fecondazione e lo sviluppo dell'embrione. Questo studio introduce un metodo di nuoto orizzontale a forma di U (UHS) per la preparazione di spermatozoi per iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI), che elimina significativamente gli effetti dannosi della centrifugazione sul DNA degli spermatozoi. Il metodo UHS prevede la creazione di una corsia UHS utilizzando un mezzo di fertilizzazione all'interno di un piatto operatorio ICSI. Una microgocciolina di terreno di fertilizzazione da 10 μl viene posta al punto di partenza sul lato sinistro della corsia UHS per trattenere lo sperma. Due ulteriori goccioline tampone del mezzo di fertilizzazione da 10 μl sono posizionate a intervalli lungo la sezione centrale sinistra della corsia, con tutte le goccioline collegate dal mezzo di fertilizzazione. La capsula viene quindi ricoperta con olio di coltura e incubata per una notte a 37 °C con il 6% di CO₂ per equilibrare. Successivamente, 3 μL di sperma vengono aggiunti alla microgocciolina al punto di partenza. Gli spermatozoi di alta qualità nuotano sul lato destro della corsia UHS, facilitando la loro aspirazione nell'ago per iniezione ICSI. Gli spermatozoi morti, i detriti cellulari e altre impurità viscose rimangono in gran parte nel punto iniziale o nelle goccioline tampone. Abbiamo elaborato simultaneamente 21 campioni di sperma utilizzando tecniche UHS e DGC e confrontato i loro DFI. I risultati hanno dimostrato che il DFI nel gruppo DGC era del 5,5% ± del 3,2%, mentre il DFI nel gruppo UHS era dell'1,7% ± dell'1,1%. La differenza tra i due gruppi era statisticamente significativa (P < 0,05).

Introduzione

Le tecniche di ottimizzazione dello sperma e di preparazione degli spermatozoi svolgono un ruolo cruciale nell'ottenimento di frazioni cellulari arricchite con spermatozoi strutturalmente e funzionalmente superiori, che è un passo fondamentale nella tecnologia di riproduzione assistita dall'uomo¹. Lo scopo dell'ottimizzazione dello sperma è: (1) Ridurre o rimuovere le prostaglandine, le cellule immunoattive, gli anticorpi anti-sperma, gli spermatozoi immobili di bassa qualità, i batteri e i detriti nel plasma seminale; (2) Ridurre o eliminare la viscosità dello sperma; e (3) Promuovere la capacitazione degli spermatozoi e migliorare la capacità di fecondazione. Una tecnica ideale di preparazione degli spermatozoi dovrebbe recuperare una popolazione di spermatozoi altamente funzionale che preservi l'integrità del DNA e non induca disfunzioni attraverso la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) da parte di spermatozoi e leucociti².

La tecnologia di preparazione dello sperma più utilizzata attualmente è il metodo DGC. I vantaggi di questo metodo sono l'alto tasso di recupero³ e la facile standardizzazione. Nell'uso pratico, può essere selezionato in modo flessibile in base alla qualità del campione per il metodo del gradiente a doppia densità⁴, il metodo mini-DGC o il metodo di centrifugazione a gradiente a strato singolo⁵. Questo metodo può essere utilizzato per preparare spermatozoi di alta qualità con una buona vitalità, privi di detriti cellulari, globuli bianchi contaminati, cellule non germinali e cellule germinali degenerate. Tuttavia, lo svantaggio di questo metodo è che richiede la centrifugazione, che può causare danni al DNA spermatico⁶.

Il metodo qui presentato è stato adattato dallo studio originale di Baldini et ^al.7, che si è concentrato sulla migrazione orizzontale degli spermatozoi nelle piastre per iniezione. Questo metodo modificato incorpora una corsia orizzontale a forma di U per separare gli spermatozoi di alta qualità con una forte vitalità. Evita i danni al DNA causati dalla centrifugazione e riduce al minimo l'influenza di spermatozoi morti, detriti cellulari e altre impurità viscose durante le procedure di iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI).

L'approccio specifico prevede l'utilizzo di un mezzo di fertilizzazione per creare una corsia UHS nel piatto operatorio ICSI. Una microgoccia di terreno di fertilizzazione da 10 μl viene posta al punto di partenza sinistro della corsia UHS per trattenere lo sperma. Due ulteriori goccioline tampone del terreno di fertilizzazione da 10 μl sono posizionate a intervalli nella sezione centrale sinistra della corsia UHS e tutte le goccioline sono collegate dal mezzo di fertilizzazione. Dopo aver coperto l'impianto con olio di coltivazione, la capsula viene incubata per una notte a 37 °C con il 6% di CO₂ per l'equilibrio. Successivamente, 3 μL di sperma vengono aggiunti alla microgocciolina nel punto di partenza sul lato sinistro della corsia UHS. Gli spermatozoi di alta qualità nuotano fino alla pista sul lato destro della corsia UHS, facilitando la loro raccolta con l'ago per iniezione ICSI. Gli spermatozoi morti, i detriti cellulari e altre impurità viscose rimangono principalmente nella posizione originale o nelle goccioline tampone.

Il chip microfluidico simula il processo di selezione naturale nel tratto riproduttivo femminile, consentendo l'isolamento ottimale di spermatozoi di alta qualità dallo sperma senza centrifugazione. Questo è fondamentale per migliorare la motilità degli spermatozoi⁸, ridurre l'indice di frammentazione del DNA spermatico⁹ e migliorare gli esiti della gravidanza¹⁰. Tuttavia, la fabbricazione di tali dispositivi è complessa, costosa e impegnativa da implementare su larga scala.

Il protocollo qui descritto offre un'alternativa nuova, semplice e fattibile. Sfruttando le caratteristiche di motilità degli spermatozoi, questo metodo consente di ottenere risultati paragonabili a quelli della tecnologia microfluidica. Gli spermatozoi preparati mostrano una forte vitalità, bassi indici di frammentazione del DNA e sono adatti per l'uso nell'ICSI.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Medico dell'Affiliated Huai'an First People's Hospital dell'Università di Medicina di Nanchino (Numero di approvazione: KY-2024-181-01). Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti i cui campioni sono stati utilizzati in questo studio. La procedura deve essere condotta da personale esperto in conformità con le buone pratiche di laboratorio e le linee guida cliniche^11,12. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono riportati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione di un piatto operatorio ICSI

1. Utilizzare un mezzo di fertilizzazione da 20 μl per creare tracce a forma di U nel piatto operatorio ICSI (Figura 1). La lunghezza del binario sinistro del binario a forma di U dovrebbe essere di circa 30 mm e anche la lunghezza del binario destro dovrebbe essere di circa 30 mm.
2. Aspirare 10 μl di terreno di fertilizzazione con una pipetta e creare una gocciolina circolare nel punto iniziale sinistro del binario a forma di U. Collegalo con il punto di partenza sinistro della pista a forma di U per aggiungere la soluzione stock di sperma.
3. Creare due goccioline tampone di terreno di fertilizzazione da 10 μl a intervalli sulla sezione centrale sinistra della corsia UHS. Collegare tutte le goccioline con il mezzo di fertilizzazione.
4. Creare una lunga striscia di gocciolina di liquido sul lato destro della corsia a forma di U utilizzando 2,5 μL di polivinilpirrolidone (PVP). Assicurarsi che la striscia PVP sia parallela alla corsia destra della corsia a forma di U.
5. Produrre sei microgoccioline utilizzando il terreno di processazione degli ovociti sul lato destro della striscia PVP, con 20 μl per gocciolina.
6. Aggiungere 7 ml di olio di coltura al piatto, assicurandosi che l'olio copra il punto più alto della gocciolina. Metterlo in un incubatore a 37 °C, 6% CO₂ per una notte per bilanciarlo.

2. Raccolta del campione di sperma

1. Fornire ai pazienti istruzioni scritte e verbali chiare in merito alla raccolta del campione di sperma. Assicurarsi che la raccolta del campione sia completa e istruire i pazienti ad astenersi dall'eiaculazione per 3-7 giorni prima della raccolta.
2. Raccogli lo sperma tramite masturbazione in una tazza di raccolta dello sperma specializzata usa e getta, sterile e non tossica. Assicurarsi che l'intero eiaculato sia raccolto e istruire l'individuo a segnalare qualsiasi perdita di qualsiasi frazione del campione.
3. Verificare i nomi, i documenti di identificazione validi e le impronte digitali del coniuge del paziente. Segnare il nome e il numero di cartella clinica del coniuge del paziente sul corpo e sul coperchio della tazza di raccolta dello sperma.
4. Dopo che il paziente di sesso maschile ha raccolto lo sperma, consegnare il campione faccia a faccia tra il personale e il paziente. Prelevare una piccola quantità del campione di sperma per il confezionamento e la conservazione. Assicurarsi che il paziente firmi nell'area di imballaggio.
5. Numerare e conservare i campioni incapsulati per 2 anni. Registrare le informazioni sul paziente, il numero di identificazione e le firme del ricevente e dei testimoni nel registro del trattamento dello sperma.
6. Se un membro del personale del centro riproduttivo scopre l'identità di un paziente sospetto, interrompere la ricezione del campione e verificare nuovamente l'identità del paziente. Non ricevere due o più esemplari contemporaneamente. Se c'è il sospetto di confusione negli esemplari, smetti di riceverli.

3. Analisi del campione di sperma

1. Osserva il colore dei campioni di sperma.
   NOTA: Il seme normale appare omogeneo e bianco-grigiastro dopo la liquefazione. Lo sperma con una concentrazione di spermatozoi molto bassa può apparire trasparente. Se sono presenti globuli rossi, lo sperma può apparire bruno-rossastro. Se il paziente ha l'ittero o assume determinate vitamine, lo sperma può apparire giallo.
2. Misurare il volume di sperma utilizzando il metodo di pesatura, con una precisione di 0,1 ml.
3. Posizionare il campione di sperma a 37 °C per 15-30 minuti. Aspirarlo in una pipetta monouso di plastica a foro largo (circa 1,5 mm di diametro), lasciando cadere lo sperma per gravità. Osservare la lunghezza di qualsiasi filo.
   NOTA: Un normale eiaculato liquefatto forma piccole gocce discrete. Se la viscosità è anormale, la goccia formerà un filo più lungo di 2 cm.
4. Se lo sperma continua a non liquefarsi entro 60 minuti, aggiungere una quantità uguale di terreno di fertilizzazione. Quindi, inspirare ed espirare ripetutamente la miscela utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica usa e getta fino a quando non si liquefa completamente.
5. Misurare il valore del pH dello sperma utilizzando carta per test di pH di precisione (pH 6,0-10,0).
6. Prelevare 10 μl di seme completamente liquefatto e versarlo su una camera di conteggio Makler. Valutare la motilità degli spermatozoi in un campo 200x con un microscopio ottico. Osservare la presenza di agglutinazione degli spermatozoi e di cellule non spermatiche.
7. Valutare la concentrazione di spermatozoi in un campo 200x con un microscopio ottico.

4. Raccolta degli ovociti

1. Preparare un piatto per il prelievo degli ovociti (OPD) il giorno prima del prelievo degli ovociti. Aggiungere 2,5 mL di terreno di coltura per ovociti a una piastra di coltura sterile da 35 mm. Quindi, aggiungere 1,5 ml di olio e mettere la capsula in un'incubatrice a 37 °C per una notte per l'equilibrio.
2. Preparare due piatti per la coltura degli ovociti (DOC) il giorno prima del prelievo degli ovociti. Aggiungere 1 mL di terreno di fertilizzazione all'anello interno di una capsula di coltura sterile a pozzetti centrali, quindi aggiungere 1 mL di olio. Aggiungere 4 ml di terreno di fertilizzazione all'anello esterno. Mettere la capsula in un'incubatrice a 37 °C, 6% di CO₂ per equilibrare per una notte.
3. Accendi tutti i riscaldatori e le piastre riscaldanti e misura la temperatura 30 minuti prima del prelievo degli ovociti.
4. Lavarsi le mani con un disinfettante per le mani e risciacquare abbondantemente con acqua corrente. Indossare guanti puliti, sterili e privi di polvere.
5. Preriscaldare la piastra di coltura sterile su una piattaforma riscaldante a 37 °C.
6. Verificare rigorosamente l'identità della paziente prima del prelievo degli ovociti.
7. Inalare il liquido follicolare in provette sterili a pressione negativa, quindi consegnarlo immediatamente agli embriologi di laboratorio.
8. Versare tutto il liquido follicolare in piastre di coltura sterili e cercare i complessi cumululi corona degli ovociti (OCCC) sotto uno stereomicroscopio a basso ingrandimento. Prelevare gli OCCC utilizzando una pipetta e metterli in un OPD per la conservazione temporanea a 37 °C.
9. Registrare la quantità, il colore, il numero di follicoli e il numero di OCCC nel liquido follicolare.
10. Dopo il prelievo degli ovociti, trasferire gli OCCC nel DOC utilizzando una pipetta sterile Pasteur. Metterli rapidamente in un incubatore di coltura (37 °C, 6% CO₂, 5% O₂ e umidità satura) per 2 ore.
11. Preparare un piatto a quattro pozzetti, aggiungere 0,5 ml di soluzione di ialuronidasi al primo pozzetto e 1 ml di terreno di trattamento degli ovociti a ciascuno dei tre pozzetti rimanenti. Incubare a 37 °C per 1 ora.
12. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire gli OCCC dal passaggio 4.10 in una ialuronidasi ben contenuta per 30 s. Quindi, trasferire gli OCCC in un terreno di lavorazione degli ovociti ben contenuto.
13. Utilizzare una provetta di strippaggio degli ovociti di 150 μm di diametro per soffiare e aspirare gli OCCC per rimuovere le cellule della granulosa. Quindi, utilizzare una nuova pipetta Pasteur per trasferire gli ovociti nel terreno di lavorazione degli ovociti per il lavaggio. Trasferirli in un altro OCD preequilibrato e metterli in un incubatore a 37 °C, 6% CO₂ .

5. Selezione degli spermatozoi e operazione ICSI

1. Aggiungere 5 μl di sperma alla microgocciolina del terreno di fertilizzazione al punto iniziale sinistro del binario a forma di U nel piatto operatorio ICSI, che è stato preparato dalla fase 1.1 alla fase 1.6.
2. Posizionare il piatto operatorio ICSI in un'incubatrice a 37 °C, 6% CO₂ per 30-60 min.
3. Aprire il microscopio invertito, il sistema operativo del microscopio e il tavolino di riscaldamento per assicurarsi che tutti i controlli operativi vengano ripristinati al loro intervallo di controllo originale, consentendo un funzionamento fluido e confortevole.
4. Installare l'ago ICSI nel supporto dell'ago. Fissare il supporto dell'ago sul micromanipolatore, regolare l'ago di tenuta e l'ago di iniezione nella lente dell'obiettivo 4x e regolare in sequenza i loro angoli e posizioni in modo che i due aghi siano relativi e paralleli al tavolino. Controllare il raggio di movimento dell'ago operatore sotto la lente dell'obiettivo × 20.
5. Regolare l'angolo e la posizione dell'ago di tenuta dell'ovocita e dell'ago per iniezione sotto la lente dell'obiettivo 4x, in modo che le due teste dell'ago siano relative e parallele al tavolino. Spostare l'ago operativo in avanti, indietro, a sinistra e a destra. Controllare il raggio di movimento dell'ago operatore sotto gli obiettivi 10x e 20x.
6. Sollevare l'ago di tenuta degli ovociti e l'ago per iniezione per assicurarsi che l'altezza tra il tavolo operatorio e il tavolo riscaldante consenta un facile posizionamento del vaso operatorio senza toccare l'ago operatorio.
7. Dopo un doppio controllo, trasferire gli ovociti selezionati dal passaggio 4.12 nelle microgoccioline del terreno di processamento degli ovociti nel piatto operatorio ICSI, uno per gocciolina.
8. Posizionare il piatto operatorio contenente l'ovocita sul tavolino caldo dell'operatore del microscopio preparato.
9. Regolare la lunghezza focale del microscopio sotto la lente dell'obiettivo 10x per rendere chiari e visibili i bordi delle microgoccioline all'interno del piatto operatorio.
10. Abbassare l'ago di iniezione nella striscia PVP del piatto operatorio ICSI. Regolare il microscopio per rendere chiaramente visibile l'ago per iniezione e inalare contemporaneamente una piccola quantità di PVP nell'ago per iniezione.
11. Spostare l'ago per iniezione nella lunga striscia sul lato destro del binario a forma di U ed estrarre spermatozoi di alta qualità con una buona morfologia e motilità progressiva.
12. Trasferire lo sperma nella striscia PVP sul lato destro e posizionare lo sperma sul fondo del piatto operatorio.
13. Premere delicatamente l'ago per iniezione nella sezione centrale o inferiore della coda dello sperma, tirare indietro rapidamente l'ago per iniezione e grattare lo sperma per farlo fermare.
14. Inspirare lo spermatozoo dalla coda alla testa nell'ago per iniezione.
15. Trasferire l'ago per iniezione nella gocciolina del terreno di processamento degli ovociti contenente l'ovocita sul lato destro.
16. Abbassare l'ago di tenuta dell'ovocita e muovere delicatamente l'ovocita per posizionare il primo globulo polare a ore 12, fissando l'ovocita.
17. Regolare l'ago microchirurgico e la membrana dell'ovocita sullo stesso piano orizzontale. Spingere lo sperma verso la punta dell'ago per iniezione.
18. Passare verticalmente attraverso la zona pellucida a ore 3 sull'ovocita e continuare a iniettare l'ago fino a raggiungere il centro dell'ovocita o attraversare leggermente la posizione centrale, con una leggera retrazione dell'ago per iniezione.
    NOTA: Quando si verifica un rapido reflusso nel citoplasma e negli spermatozoi, indica che la membrana dell'ovocita si è rotta e l'aspirazione si è fermata.
19. Iniettare lentamente lo spermatozoo nel citoplasma dell'ovocita ed uscire dall'ago per iniezione. La profondità dell'iniezione di spermatozoi nel citoplasma dovrebbe essere di circa il 50%-75% del diametro dell'ovocita.
20. Dopo aver estratto l'ago per iniezione, regolare la pressione negativa dell'ago di tenuta degli ovociti per rilasciare gli ovociti.
21. Ripetere i passaggi precedenti fino a quando tutti gli ovociti maturi sono stati iniettati.
22. Trasferire la capsula ICSI dalla piastra riscaldante del microscopio al microscopio da dissezione.
23. Rimuovere la piastra di coltura della scissione dall'incubatrice.
24. Trasferire l'ovocita spermatico iniettato in una microgocciolina in una piastra di coltura per scissione.
25. Riposizionare la piastra di coltura per scissione in un incubatore a 37 °C, 6% CO₂, 5% O₂ .

6. Preparazione dello sperma con il metodo DGC

1. Aggiungere 1,5 mL di soluzione di centrifugazione in gradiente di densità al 45% a una provetta sterile a fondo conico da 15 mL.
2. Aggiungere lentamente 1,5 mL di soluzione di centrifugazione in gradiente di densità al 90% sul fondo della soluzione di centrifugazione in gradiente di densità al 45%, mantenendo l'interfaccia tra i due liquidi.
3. Aggiungere delicatamente lo sperma liquefatto alla soluzione di centrifugazione in gradiente e centrifugare a 300 x g per 15 minuti (a temperatura ambiente).
4. Rimuovere il surnatante e aggiungere circa 0,5 mL del sedimento spermatico rimanente a 3 mL di terreno di fertilizzazione. Soffiare e mescolare bene.
5. Centrifugare a temperatura ambiente a 200 x g per 5 min.
6. Pipettare il surnatante e lasciare circa 0,2 mL di sedimento.
7. Aggiungere una quantità appropriata di terreno di fertilizzazione per risospendere il sedimento, contare la concentrazione e la vitalità degli spermatozoi e registrare. Mettere in un incubatore a 37°C con CO2 al 6% per un uso successivo.

7. Rilevamento dell'integrità del DNA nucleare degli spermatozoi (metodo di dispersione della cromatina spermatica, SCD)

1. Regolare la temperatura interna a 20-28 °C prima di condurre l'esperimento. Estrarre il kit di reagenti e lasciarlo equilibrare a temperatura ambiente per 30-60 min.
2. Preparare la soluzione denaturante: Prendere 0,8 mL di soluzione denaturante concentrata e aggiungerla a 100 mL di acqua distillata.
3. Preparare la soluzione di etanolo al 70%: Prelevare 26,65 ml di acqua distillata e 70,35 ml di etanolo anidro per preparare la soluzione di etanolo al 70%.
4. Preparare la soluzione di etanolo al 90%: Prendere 9,55 ml di acqua distillata e 90,45 ml di etanolo anidro per preparare la soluzione di etanolo al 90%.
5. Immergere la provetta di agarosio a basso punto di fusione (contenente 25 μL di soluzione di agarosio a basso punto di fusione) in un bagnomaria a 90-100 °C per 1-2 minuti fino a quando il gel di agarosio non si è completamente sciolto. Quindi, mettere il tubo in un bagnomaria a 37 °C per 5 minuti fino a quando la temperatura non è costante.
6. Prelevare 3-10 μL di sperma prima del trattamento di ottimizzazione e la sospensione di spermatozoi dopo il trattamento di ottimizzazione. Aggiungerli a diversi tubi di agarosio a basso punto di fusione, quindi mescolare accuratamente.
7. Prelevare 30 μl della sospensione di agarosio a basso punto di fusione contenente spermatozoi e lasciarla cadere su un vetrino pretrattato in posizione orizzontale.
8. Coprire delicatamente il vetro di copertura (22 mm x 11 mm) con il vetrino, evitando il più possibile la formazione di bolle.
9. Porre il vetrino pretrattato in frigorifero a 2-8 °C per 4 minuti, mantenendo il vetrino in posizione orizzontale durante l'intero processo. Rimuovere il vetrino dal frigorifero e farlo scorrere delicatamente per rimuovere il vetro di copertura.
10. Immergere rapidamente il vetrino pretrattato nella soluzione denaturante per 7 minuti.
11. Rimuovere il vetrino pretrattato e immergerlo in acqua distillata per 5 s.
12. Rimuovere il vetrino pretrattato e farlo stare in posizione verticale. Utilizzare carta da filtro per assorbire eventuali goccioline d'acqua sulla superficie del vetrino ed evitare di toccare l'area del campione.
13. Immergere il vetrino pretrattato nel tampone di lisi e reagire con precisione per 20 minuti.
14. Immergere i frammenti pretrattati nella soluzione di lavaggio per 3 minuti per lavare via la soluzione di lisi.
15. Rimuovere il vetrino pretrattato e immergerlo in una soluzione di etanolo al 70% per 2 minuti.
16. Rimuovere il vetrino pretrattato e immergerlo in una soluzione di etanolo al 90% per 2 minuti.
17. Rimuovere il vetrino pretrattato e immergerlo in una soluzione di etanolo anidro per 2 minuti.
18. Rimuovere il vetrino pretrattato e lasciarlo asciugare all'aria in modo naturale.
19. Preparare la soluzione di colorazione di Wright A e la soluzione B in un flacone vuoto marrone in rapporto 1:1.
20. Posizionare il vetrino pretrattato orizzontalmente e aggiungere la soluzione colorante miscelata sul vetrino, assicurandosi che la soluzione colorante copra l'intero vetrino (circa 0,5-1 mL di soluzione colorante).
21. Dopo aver colorato per 5 minuti, sciacquare delicatamente il vetrino colorato con acqua distillata 10-15 volte per rimuovere l'eccesso di agente colorante.
22. Lasciare asciugare il bicchiere in modo naturale e osservarlo al microscopio ottico a 400×. Conta più di 200 spermatozoi e determina la percentuale di spermatozoi anormali con piccoli anelli aloni, senza anelli aureola e degenerazione.

8. Analisi statistica

1. Eseguire analisi statistiche utilizzando software disponibili in commercio.
2. Confronta il DFI (%) tra sperma originale, DGC e UHS utilizzando il test di Friedman.
   NOTA: per confronti a coppie di due metodi, utilizzare il test di rango con segno di Wilcoxon. Considera un valore p ≤ 0,05 come statisticamente significativo.

Risultati

I metodi UHS e DGC sono stati utilizzati per ottimizzare il trattamento di 21 campioni e confrontare l'indice di frammentazione del DNA spermatico tra i due metodi. Il metodo che utilizza la traccia UHS nella capsula ICSI può sostituire la DGC, che può causare danni agli spermatozoi. Gli spermatozoi di alta qualità con una buona motilità progressiva nuotano dolcemente lungo il bordo della pista a forma di U (Figura 2), facilitando la presa individuale da...

Discussione

Il passo chiave per separare gli spermatozoi di alta qualità utilizzando il metodo UHS descritto in questo articolo è la creazione di una corsia UHS con goccioline tampone. Sia la corsia UHS che le goccioline tampone vengono create utilizzando sperma lavato e ricevuto. La corsia UHS guida lo sperma di alta qualità a nuotare liberamente e ad accumularsi lungo il bordo della pista, facilitando la raccolta. Le goccioline tampone riducono la viscosità dello sperma, filtrando gli spermato...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
7% Polyvinyl pyrrolidone Solution	Vitrolife Sweden AB	10111	ICSI
Aspirator	LABOTECT	-	Aspirator
Biological clean workbench	Suzhou Antai	-	Biological clean workbench
Blastocyst culture medium	Vitrolife Sweden AB	10132	Blastocyst culture medium
Cleavage culture medium	Vitrolife Sweden AB	10128	Cleavage culture medium
CO2 incubator	Thermo Scientific	-	CO2 incubator
Culture oil	Vitrolife Sweden AB	10029	OVOIL
Disposable plastic transfer pipette	BD Falcon	357575	disposable plastic transfer pipette
Fertilization medium	Vitrolife Sweden AB	10136	G-IVF PLUS
ICSI operating dish	BD Falcon	351006	Petri dish
Instant hyaluronidase	Vitrolife Sweden AB	10017	Instant hyaluronidase
Inverted microscope	NIKON	-	Inverted microscope
IVF Workstation	Denmark K-SYSTEM	-	IVF Workstation
Makler counting chamber	Sefi Medical Instruments		Makler counting chamber
Micro operating system	NIKON	-	Micro operating system
Oocyte processing medium	Vitrolife Sweden AB	10130	G-MOPS PLUS
Optical microscope	OLYMPUS	-	Optical microscope
Phase contrast microscope	NIKON	-	Phase contrast microscope
Sperm Counting Board	Markler	-	Sperm Counting Board
Sperm gradient separation solution	Vitrolife Sweden AB	10138	SpermGrad
Sperm nucleus DNA integrity Kit	Shenzhen HuaKang	-	Sperm Nucleus DNA Integrity Kit (SCD)
Stereoscopic microscope	NIKON	-	Stereoscopic microscope
Tabletop centrifuge	HETTICH	-	Tabletop centrifuge
Thermostatic test tube rack	GRANT	-	Thermostatic test tube rack
Tri-gas incubator	ASTEC	-	Tri-gas incubator