La procédure suivante fournit les étapes détaillées nécessaires pour recueillir in vivo et ex vivo des images NIRF de petits animaux:

1. Configuration expérimentale

1. Connectez une source de lumière de fibre optique au système d'imagerie de fluorescence à l'aide d'un guide de lumière à fibres optiques.
2. Sélectionnez le filtre d'excitation approprié pour l'expérience. Le filtre d'excitation détermine la longueur d'onde de la lumière à livrer à l'échantillon et doit être choisi pour correspondre au spectre d'excitation du fluorophore introduit dans l'échantillon.
3. Sélectionnez le filtre d'émission approprié. Le filtre d'émission bloque les composants spectrals indésirables, qui peuvent être attribués à l'autofluorescence, et devrait être choisi pour correspondre au spectre d'émission du fluorophore.

2. Préparation de l'échantillon

1. In Vivo
   1. Anesthésiez l'animal dans une chambre à induction à l'aide d'isoflurane à une concentration de 3-4% sur le cadran du débitmètre.
   2. Transférer l'animal sur un cône nasal fixé au stade d'imagerie et maintenir l'isoflurane à une concentration de 1 à 2 %. Une source de chaleur n'est pas nécessaire parce que les animaux ne sont généralement représentés que pendant une courte période de temps (à 5 min), et leur température corporelle ne diminue pas considérablement.
   3. Fixer les pattes de l'animal pour minimiser les artefacts de mouvement. Retirer les cheveux de la région d'intérêt en appliquant une crème dépilatoire.
   4. Appliquer la crème dépilatoire sur la plus petite surface nécessaire. Après 30 s, essuyez-le avec un tampon de gaze. Essuyez la zone une deuxième fois avec un tampon de gaze humidifié e-éthylique pour enlever complètement la crème dépilatoire.
   5. Appliquer un onduleur ophtalmique sur les yeux pour éviter le séchage des cornées.
   6. Injecter la sonde moléculaire fluorescente activatable dans l'animal. Pour cette application spécifique, des sondes activatoires MMP2 ont été injectées par voie intraveineuse dans la veine de la queue. À ce stade, la souris peut être image. Procéder à l'"Acquistion d'image" de ce protocole pour continuer. Surveillez l'animal pour la respiration régulière tout au long de la procédure brève.
2. Ex Vivo
   1. Après l'injection de la sonde fluorescente, euthanasiez l'animal d'une manière humaine selon les Lignes directrices 2013 de l'AVMA pour l'euthaniasie des animaux. Le surdosage de dioxyde de carbone (CO₂) est une pratique courante pour euthanasier les petits animaux.
   2. Extraire chirurgicalement le tissu ou l'organe d'intérêt et enlever soigneusement l'excès de tissu adipeux avec des forceps.
   3. Rincer le tissu dans le phosphate tamponné salin pour enlever le sang résiduel et placer l'échantillon directement sur le stade d'imagerie.

3. Acquisition d'images

1. Ouvrez le logiciel d'imagerie moléculaire et activez à la fois la source de lumière à fibres optiques et le système d'imagerie par fluorescence.
2. Ouvrez la fenêtre d'acquisition et spécifiez le type d'exposition approprié à l'étude. Les expositions disponibles comprennent : L'exposition standard pour capturer une seule image, l'exposition time Lapse pour capturer une série d'images sur un intervalle de temps fixe, et l'exposition progressive pour capturer une séquence continue d'expositions à différents moments d'exposition.
3. Sélectionnez UV-Transillumination comme source d'éclairage.
4. En utilisant l'image prévisualisée comme référence, ajuster la mise au point de l'objectif, le champ de vision, et le f-stop / ouverture dans la chambre du système de capture pour optimiser la qualité de l'image échantillonnée. Ajuster le temps d'exposition et la position de l'échantillon.
5. Fermez la fenêtre de prévisualisation et assurez-vous que tous les paramètres de la fenêtre d'acquisition correspondent aux paramètres de la caméra et du filtre.
6. Cliquez sur 'Expose' pour acquérir et enregistrer l'image.
7. Le logiciel d'imagerie moléculaire standard fournit généralement une variété d'outils d'analyse, de mesure et de correction d'image pour quantifier les signaux de fluorescence pour l'analyse d'image.
8. À la fin de la séance d'imagerie, retirez l'échantillon/animal, éteignez le système et nettoyez l'étape d'imagerie pour minimiser les dommages au système.