Financé par une subvention de la National Science Foundation à MF

L&#39;OMT est une adaptation d&#39;un système d&#39;ancrage magnétique 1 conçu pour incorporer un panache de 2 virtuels simulateur. Les protocoles suivants expliquent comment optimiser les images vidéo acquise (Partie 1) et exécuter deux types de base visuo-olfactive expériences (Partie 2 &amp; 3). Partie 1: Acquisition Vidéo Optimisation de l&#39;image vidéo est cruciale pour la qualité des données acquises. Suivez ces étapes pour des images plus nettes. <ol><li> Placez une mouche fraîchement attaché dans l&#39;arène en utilisant une paire de pinces. </li><li> Position de la caméra embarquée firewire (Fire-i 1394store.com) sous la chambre à vide en acrylique transparent de sorte que la vue de la caméra est directement vers le haut dans la chambre, à travers un tube de verre, à la face ventrale de la mouche attachés. Soyez sûr qu&#39;il n&#39;ya pas de revêtement filtre IR sur l&#39;objectif du système vidéo. </li><li> Pour éclairer la volée, utiliser un réseau circulaire de LED infrarouges (petites pièces Inc) placé juste sous les panneaux LED. Accent sur le corps de chaque LED de la mouche individuellement pour un éclairage uniforme. </li><li> Pour réduire l&#39;éblouissement causé par le système de panneaux et de minimiser les repères visuels observés par la mouche, il est utile d&#39;enduire toutes les surfaces réfléchissantes dans la vue caméra avec la peinture noire à plat. Lumières de la pièce doivent être éteints afin de réduire les reflets et la luminosité des modulations détectable par l&#39;œil de la mouche. </li><li> Inspectez l&#39;image de la caméra. La mouche doit être blanche et brillante sur un fond noir. Si l&#39;image est floue de la lentille peut être nécessaire de se concentrer. Si la mouche est sombre, le tableau de LED peut être floue ou insuffisamment alimentés par un éclairage adéquat. Si le fond contient des objets lumineux, monter un disque de papier noir troupeau juste au-dessus de la volée afin de minimiser la réflectance de fond. </li><li> Nous acquérons la vidéo avec sous-routines personnalisées écrites en Matlab utilisant la boîte à outils Image Acquisition. </li></ol> Partie 2: La mouche de trouver le panache d&#39;odeur Une simple expérience dans l&#39;OMT est l&#39;observation d&#39;un affamé (faim) volent localiser et ensuite activement le suivi du panache d&#39;odeur des aliments attrayants. Manipuler les environs visuelle influence la capacité de la mouche de manière robuste suivre une odeur de nourriture appétitive. Notez que les expériences sont généralement exécutées dans un format de bloc aléatoire afin de minimiser tout biais dans l&#39;ordre expérimental. Tout le matériel externe (multiplexeurs à gaz, à l&#39;aréna de LED, de l&#39;acquisition vidéo) sont contrôlés par des routines logicielles personnalisées écrites dans Matlab (Mathworks). <ol><li> Placez une mouche fraîchement attaché dans l&#39;arène en utilisant une paire de pinces. </li><li> Avant chaque expérience, en utilisant l&#39;affichage visuel, faire tourner la volée pour plusieurs tours 3 pour assurer un mouvement fluide autour de l&#39;axe de lacet 360 ensemble. Si la mouche ne tourne pas en douceur le jeter. Si le problème persiste, la cause probable est aimants mal alignées. Remarque: Si la distribution de l&#39;aréna pour la rubrique plusieurs trajectoires au cours du procès de spin montre des pics significatifs (c&#39;est à dire n&#39;est pas plat sur 360 degrés), il ya probablement un biais en raison de l&#39;orientation des aimants mal alignées. </li><li> Présent à la volée avec les conditions de l&#39;échantillon expérimental suivant dans un ordre aléatoire: i) à contraste élevé motif rayé de vapeur d&#39;eau émanant du port d&#39;odeur; ii) à contraste élevé motif rayé à odeur attrayante vapeur; iii) une seule rayure décalage vertical à 90 degrés de la buse vapeur d&#39;eau, et iv) une seule bande de 90 degrés compensé avec de la vapeur d&#39;odeur. Dans notre expérience, des intervalles de 30 secondes fonctionnent bien pour des expériences où les mouches sont mis au défi de localiser la source de l&#39;odeur de leur propre chef. Nous acquérons la vidéo à 30 Hz pour la durée de chaque condition expérimentale et d&#39;analyser les images hors ligne en utilisant des routines logicielles personnalisées écrites dans Matlab (l&#39;un des plus utiles fonctions intégrées Matlab est regionprops.m qui analyse les propriétés géométriques d&#39;une ellipse. </li><li> Lors de l&#39;utilisation des concentrations d&#39;odeur forte, odeur résiduelle peut être libérée à partir du port d&#39;odeur après que l&#39;odeur est éteint. Pour minimiser les effets que cela peut avoir, il est utile de tourner à la volée pendant quelques secondes avec un panorama en rotation pour permettre au système pour débusquer toute odeur résiduelle. </li><li> Il est également bénéfique pour tourner le visuel voler entre les traitements expérimentaux pour (i) tenir les mouches activement engagés dans l&#39;expérimentation et à (ii) empêcher les mouches de rester en un seul endroit. Un exemple d&#39;expérience peut avoir l&#39;ordre suivant: i) vingt secondes centrifugation initiale de diagnostic; ii) cinq seconde vrille intermédiaires; iii) vingt paires deuxième condition n ° 1; iv) cinq seconde vrille intermédiaires; v) vingt paires deuxième condition n ° 2. </li></ol> Partie 3: La mouche en restant dans le panache d&#39;odeur Une deuxième expérience de base dans les OMT est visuellement glisser une mouche dans un panache d&#39;odeur, instantanément changer les conditions visuelles, puis de mesurer sa capacité à rester dans le panache. Là encore, notez que toutes les expériences sont faites dans un bloc aléatoire format pour minimiser les biais dans le but expérimental. <ol><li> Placez une mouche fraîchement attaché dans l&#39;arène en utilisant une paire de pinces. </li><li> Visuellement rotation (spin) des temps volent plusieurs autour de l&#39;arène avant chaque expérience comme un test de diagnostic pour s&#39;assurer que l&#39;animal a la capacité de s&#39;orienter dans toutes les directions (voir partie 2.2). </li><li> Avant chaque condition, tournez sur l&#39;odeur d&#39;expérimentation (de l&#39;eau ou du vinaigre) et visuellement &quot;glisser&quot; à la volée dans le panache en oscillant une petite bande verticale à la position du panache. Cette méthode tire parti du comportement de fixation à bande puissantes observées chez la mouche [4]. </li><li> Maintenant que la mouche est orientée vers le panache, retirez la bande oscillante et présentent les conditions de l&#39;échantillon visuels suivants: i) bandes de contraste élevé panoramique avec la vapeur d&#39;eau (figure 1A), ii) de fond uniforme avec la vapeur d&#39;eau (Fig. 1B); iii) des bandes de contraste élevé panoramique avec une odeur de vapeur (Fig. 1C); fond uniforme iv) avec une odeur de vapeur (Fig. 1D). Acquérir la vidéo comme en 2.3. Un exemple d&#39;expérience peut avoir l&#39;ordre qui coule: i) vingt secondes centrifugation initiale de diagnostic; ii) cinq seconde oscillation piste panache; iii) vingt paires deuxième condition n ° 1; iv) cinq seconde oscillation piste panache; v) vingt paires deuxième condition n ° 2 . </li></ol> Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/old/1110_2009_1_22_1/Fig 1.png" alt="Figure 1" width="600" height="195" /> Figure 1 La partie 1 explique comment optimiser les images vidéo OMT. L&#39;image vidéo doit avoir une vision claire de la mouche allumé sur un fond noir foncé. Excessivement images lumineuses peut être améliorée en réduisant les interférences de fond, en réduisant l&#39;intensité de la LED IR, ou en éteignant l&#39;éclairage de la pièce. Si la mouche est mal éclairés, en ajustant la mise au point des LED IR ou de moduler l&#39;intensité de la LED IR peut résoudre le problème. Parties 2 et 3 décrivent des expériences simples à effectuer pour vérifier le bon fonctionnement d&#39;un OMT. Dans tous les cas, une mouche doit être visuellement «forcée» (via les réponses optomoteur) pour faire tourner plusieurs révolutions dans l&#39;arène afin d&#39;assurer une gamme complète de douceur et de mouvement. Dans la partie 2 d&#39;une mouche est au défi de trouver un panache d&#39;odeur sur ses propres. Pour garder la volée engagés dans l&#39;expérimentation, afin de réduire l&#39;effet de la libération d&#39;odeur résiduelle, et pour empêcher les mouches de maintenir une seule rubrique tout au long de l&#39;expérience, il est utile de faire pivoter l&#39;avion visuellement pendant quelques secondes entre les essais. Une mouche ne doit jamais localiser un panache de vapeur d&#39;eau à un degré significatif, et doit toujours de localiser un panache odeur en la présence de riches panoramiques des indices visuels. Dans la partie 3 est visuellement une mouche traîné directement dans un panache d&#39;odeurs et mis au défi de maintenir sa position à l&#39;intérieur du panache contre une variété de milieux stationnaires visuelle. Si la mouche est traîné dans un panache de vapeur d&#39;eau, il devrait rapidement se détournent. Si la mouche est traîné dans un panache d&#39;odeur et il ya suffisamment d&#39;indices visuels de médiation suivi robuste, la mouche restera dans le panache.

<ol>
	<li>Bender, J. A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+stimulation+of+saccades+in+magnetically+tethered+Drosophila.">Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila.</a> J Exp Biol. 209, 3170-3182 (2006).</li><li>Duistermars, B. J., Frye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossmodal+visual+input+for+odor+tracking+during+fly+flight.">Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight.</a> Curr Biol. 18, 270-275 (2008).</li><li>Reiser, M. B., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+display+system+for+insect+behavioral+neuroscience.">A modular display system for insect behavioral neuroscience.</a> J Neurosci Methods. 167, 127-139 (2008).</li><li>G&#246;tz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Course-control,+metabolism+and+wing+interference+during+ultralong+tethered+flight+in+Drosophila+melanogaster.">Course-control, metabolism and wing interference during ultralong tethered flight in Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 128, 35-46 (1987).</li></ol>

L&#39;acquisition d&#39;image pour ce système utilise une caméra FireWire coûteux bord et un logiciel écrit en Matlab. Des images claires sont indispensables pour obtenir des informations précises traces de données. Les stratégies décrites ci-dessus sont utiles pour le nettoyage des images dans ce système. Autres procédures de suivi vidéo pour ce système ont été décrits 1. Par ailleurs, ce système pourrait facilement être modifié pour inclure le suivi vidéo en temps réel. Les protocoles ex...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Firewire camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1394store.com</td>
<td>Fire-I board camera BW</td>
<td>4.3mm lens no IR coating</td>
</tr>
<tr>
<td>IR LEDs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Black spray paint</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rustoleum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Flat black</td>
</tr>
<tr>
<td>Black flock paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Edmund Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Panel system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caltech</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3</td>
</tr>
<tr>
<td>Matlab 2006a</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Image acquisition toolbox</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visually mediated odor tracking during flight in drosophila

Les insectes volants utilisent des repères visuels pour stabiliser leur tête dans un flux de vent. Beaucoup d&#39;animaux suivre également les odeurs transportées par le vent. En tant que tel, la stabilisation visuelle de vent suivi directement dans le suivi des aides d&#39;odeur. Mais ne signaux olfactifs influencer directement le comportement de suivi visuel indépendamment de signaux vent? En outre, les progrès récents dans la génétique moléculaire et olfactives neurophysiologie ont motivé de nouvelles analyses comportementales quantitatives pour évaluer l&#39;influence du comportement (par exemple) génétiquement inactivation spécifique d&#39;activation des circuits olfactifs. Nous avons modifié un système d&#39;ancrage magnétiques initialement conçu pour des expériences de la vision en équipant l&#39;arène avec panache laminaire étroites odeur de flux. Ici nous nous concentrons sur des expériences qui peuvent être effectués après une mouche est attaché et est capable de naviguer dans l&#39;arène magnétique. Nous montrons comment acquérir des images vidéo optimisé pour la mesure de l&#39;angle du corps, comment juger de suivi odeurs stable, et nous montrent deux expériences pour étudier l&#39;influence des repères visuels sur le suivi des odeurs.

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Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Nous décrivons ici comment optimiser l&#39;image vidéo acquise pour une olfactives magnétique attache (OMT) des appareils. Nous décrivons également deux protocoles échantillon expérimental pour l&#39;étude de visio-olfactive de fusion.

Visuellement Suivi Odeur Mediated Pendant le vol chez la drosophile

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.8K vues.  University of California, Los Angeles. Nous décrivons ici comment optimiser l'image vidéo acquise pour une olfactives magnétique attache (OMT) des appareils. Nous décrivons également deux protocoles échantillon expérimental pour l'étude de visio-olfactive de fusion.

Vidéo: Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Haute résolution de mesure du comportement Odor-Driven dans les larves de drosophile

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Recherche

Biologie

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

Un système d&#39;attache magnétique d&#39;enquêter sur les visuels et olfactifs Flight Control Mediated chez la drosophile

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Suivi vidéo haute résolution de la locomotion chez les adultes Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Channelrhodopsin2 stimulation médiée potentiels synaptiques au Drosophile Jonctions neuromusculaires

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo</emÉrythropoïèse> des cellules souches hématopoïétiques humaines

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Suivi cellule à l&#39;aide protéines photoconvertible cours de développement poisson zèbre

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Une méthode améliorée pour la mesure précise et rapide des performances de vol en<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...