Nous sommes reconnaissants à S. Arber pour les souris mGFP et aux membres du laboratoire de Zervas qui critique lu le document et fourni une assistance technique. A. Brown a été soutenue par une science du cerveau d&#39;été Prix Kaplan Graduate Research. E. Normand a été soutenue par une bourse de la science du cerveau programme Graduate Research. Cette recherche a également été financée par des fonds de recherche de démarrage (MZ).

Préparation du tamoxifène et de Procédure orale Gavage (E8.5) <ul><li> Préparer une solution à 20 mg / ml de tamoxifène par la dissolution du tamoxifène dans l&#39;huile de maïs pré-chauffé. </li><li> Incuber la solution à 37 ° C pendant 2 heures sur un nutator et le vortex par intermittence. </li><li> Protéger le stock de la lumière du tamoxifène, conserver à 4 ° C, et l&#39;utilisation pour un maximum de un mois. </li><li> Pour les expériences de cartographie destin, d&#39;établir un couple reproducteur composé d&#39;une femelle Swiss Webster (type sauvage; achetés auprès de Taconic) et un mâle portant à la fois un gène spécifique CREER allèle T et d&#39;un allèle journaliste. Pour fins de démonstration, nous utilisons Wnt1-CREER T; mâles mGFP (Ellisor 2009). </li><li> Vérifiez Swiss Webster femelles chaque matin pour l&#39;apparition d&#39;un bouchon vaginal. Désigner le matin (0900) de la journée un bouchon vaginal est considéré que 0,5 jours post-coït et calculer la date de l&#39;administration de tamoxifène basé sur ce point de départ. (Pour cette expérience, jour embryonnaire 8.5 a été utilisé). </li><li> Utiliser une seringue de 1 ml avec une aiguille de l&#39;alimentation animale (20G x 1-1/2) pour élaborer 200 pl de la solution stock tamoxifène (4 mg de tamoxifène). </li><li> Fermement limiter le temps de la grossesse Swiss Webster femelles en saisissant la nuque et le dos pour immobiliser la tête et de remettre ainsi la face ventrale vers le haut. </li><li> Tenir la queue entre les doigts libres pour maintenir le corps en ligne droite. </li><li> Placez l&#39;aiguille d&#39;alimentation dans le coin de la bouche et doucement guider l&#39;aiguille le long du toit de la bouche. </li><li> Tournez l&#39;aiguille de sorte qu&#39;elle soit parallèle au corps, tout en inclinant la tête en arrière pour garder le cou droit. </li><li> Guide de l&#39;aiguille en bas de l&#39;œsophage, vers l&#39;estomac. Attention à ne pas pénétrer dans la trachée. Si il ya une résistance sur l&#39;aiguille, engage l&#39;animal réflexe nauséeux, ou si la souris luttes, de retirer immédiatement l&#39;aiguille et essayez à nouveau le gavage. </li><li> Une fois l&#39;aiguille d&#39;alimentation est dans l&#39;estomac, administrer le tamoxifène dans l&#39;estomac et le retour à la femelle de sa cage à la maison jusqu&#39;à la date de la dissection. </li></ul> Craniotomie: <ul><li> Intracardiaque perfuser le sort adulte cartographié la souris avec 4% PFA et enlever la tête avec des ciseaux en coupant à travers la colonne vertébrale juste au-dessus des épaules. </li><li> Exécuter un scalpel le long de la ligne médiane dorsale de la tête (rostrale à caudale) pour couper à travers le cuir chevelu et d&#39;exposer la godille. </li><li> Utiliser le scalpel, gratter toute l&#39;excès de tissu ou de muscle de long du côté et postérieure du crâne. </li><li> Avec des pinces, à la perforation du crâne à la ligne médiane rostrale simplement vers les bulbes olfactifs et de créer un petit trou pour accueillir le bout des ciseaux fins. </li><li> Insérer les ciseaux fins dans ce trou et faire une incision médio-latéral d&#39;environ la longueur des bulbes olfactifs. Cette coupe sera briser le crâne à l&#39;intersection de l&#39;os nasal et l&#39;os frontal et fournir un accès bon pour les ciseaux. </li><li> Coupez le long des sutures sagittale dans le crâne (dorsale médiane) en s&#39;assurant de garder les astuces ciseaux incliné par le cerveau pour éviter d&#39;endommager les tissus sous-jacents. </li><li> Saisir délicatement le crâne avec une pince et se décoller de l&#39;os long de l&#39;incision médiane pour exposer le cerveau. Le crâne peut s&#39;écailler off en petits morceaux ou rompre dans les grandes sections. Continuez à utiliser la pince pour enlever tous les frontaux, pariétaux, interpariétales et occipitale. </li><li> Crack les os enveloppant le paraflocculi (situé le long des bords latéraux du cerveau au niveau du cervelet) en pinçant les os sphériques de chaque côté. Tirez doucement l&#39;écart de l&#39;os. </li><li> Tournez la tête à l&#39;envers (face dorsale vers le bas) et utilisez la pince pour couper les nerfs crâniens et la libération du cerveau du crâne. </li></ul> Whole Microscopie mont: le cerveau adulte <ul><li> Évaluer cerveau adulte de la GFP marquage en utilisant un champ fluorescentes dissection. </li><li> Transfert du cerveau à une boîte de Pétri contenant du PBS et de photographier en utilisant CadreImage ou tout autre logiciel approprié. </li></ul> Whole Microscopie mont: E12.5 embryons <ul><li> Évaluer embryons monter ensemble pour la GFP marquage en utilisant un champ fluorescentes dissection. </li><li> Transfert ceux qui sont GFP-positives par mount entier à une boîte de Pétri contenant du PBS et de photographier en utilisant CadreImage ou tout autre logiciel approprié. </li><li> Utilisez une pince pour pincer un petit morceau de la queue de chaque embryon, placer chaque morceau dans un tube PCR et le génotype le tissu en utilisant la PCR (Ellisor 2009) pour les deux allèles pour confirmer les résultats observés par analyse monter ensemble. </li></ul> Micro-dissection et la préparation de l&#39;explant mésencéphale ventral de E12.5 embryons <ul><li> Suite à la dissection de la chaîne de l&#39;utérus et identification du destin-mapped embryons par l&#39;ensemble de montage de fluorescence, les embryons transfert glacée PBS stérile dans une boîte de culture cellulaire. </li><li> Avec des ciseaux fins, retirer la partie de tête de l&#39;embryon de coupe transversalement, à la caudale rhombomère 1. </li><li> Ensuite, retirez la partie rostrale de la tête avec une coupe coronale à travers le diencéphale. Cela permettra d&#39;exposer une structure en forme de tube dans lequel le 4ème ventricule via le formulaire de la vésicule mésencéphalique un conduit entre les tissus dorsale et ventrale. </li><li> Insérez soigneusement les conseils de ciseaux dans le 4ème ventricule et snip le long de la ligne médiane dorsale, caudale rostrale, ouvrir complètement le tube, créant un «livre ouvert» de préparation. Le mésencéphale ventral seront désormais exposés médialement, tandis que les deux moitiés dorsale du mésencéphale va résider latéralement. </li><li> Retirez tout reste non neurales des tissus sous le mésencéphale ventral pour que le tissu de pondre plus platement. Si besoin est, faire des entailles dans les aspects rostrale et caudale de telle sorte que la dorsale «ailes» de l&#39;explant se poser à plat aussi. L&#39;explant doit maintenant ressembler à un papillon &quot;, dans lequel le mésencéphale dorsal représente les ailes, et une rhombomère la queue. </li><li> Pour isoler davantage le mésencéphale ventral pour l&#39;analyse de FACS ou expériences de culture cellulaire, enlevez la partie latérale (partie dorsale) du tissu. </li></ul> Les résultats représentatifs: Dans cette expérience GIFM, Wnt1 cellules exprimant de manière permanente et sont marqués heritably cours de l&#39;embryogenèse en administrant le tamoxifène à E8.5 à Wnt1-CreERT; embryons mGFP. Par la suite, ces cellules marquées sont visualisées par un mount de fluorescence entière et immunohistochimie section pour déterminer comment Wnt1 cellules dérivées de contribuer à travers le développement des structures neurales. Whole montage de fluorescence repose sur la composante liée à la membrane du GFP le journaliste mGFP et fournit donc des informations cellulaires ainsi que d&#39;une vue globale des Wnt1 dérivées des projections de neurones. Par exemple, avec l&#39;administration de tamoxifène à E8.5, Wnt1-CreERTmGFP embryons à E12.5 fluorescence de la GFP présentent principalement dans le mésencéphale, le rhombencéphale postérieur et la moelle épinière (figure 1A). A fort grossissement, fines projections neuronales sont vus innervant le mésencéphale, paroi du corps, du corps, et la région craniofaciale. A ce stade de développement, l&#39;embryon est translucide et l&#39;étiquetage GFP internes est facilement discernée. Cependant, comme le cerveau se développe, la densité des tissus matures obscurcit fluorescence de la GFP émanant de structures cérébrales internes. Par conséquent, avec l&#39;administration de tamoxifène à E8.5, seul un étiquetage GFP mineur est observé dans les colliculi supérieur de l&#39;adulte par l&#39;ensemble de montage de fluorescence (figure 1C, en médaillon). En outre, certaines projections axonales sont vu courre le long de la surface ventrale du cerveau postérieur (non représentée). En revanche, lorsque le tamoxifène est administré à E9.5, l&#39;étiquetage GFP substantielle survient tout au long du colliculi entière inférieure (figure 1B, en médaillon). Cette augmentation de la fluorescence de monter ensemble peut indiquer que Wnt1 cellules exprimant à E9.5 contribuer plus significativement à des régions superficielles du mésencéphale dorsal ou de prolonger de plusieurs processus au sein de cette région que Wnt1 cellules exprimant des E8.5. Quoiqu&#39;il en soit, cette différence dans l&#39;ensemble de montage de fluorescence reflète la nature dynamique de l&#39;expression Wnt1 pendant le développement et démontre comment GIFM peut être utilisé pour suivre les populations de cellules distinctes de l&#39;embryon dans l&#39;adulte. Avec des sections immunohistochimie destin, cartographiées à partir des tissus Wnt1-CreERT; animaux mGFP sont analysés au niveau cellulaire. Des anticorps contre la GFP et β-galactosidase (β-gal) sont utilisés en conjonction avec une variété de biomarqueurs spécifiques de tissus afin de déterminer la contribution à échelle fine de la lignée cellulaire Wnt1 aux structures neurales et de types cellulaires. Avec l&#39;administration de tamoxifène à E8.5 et l&#39;analyse des tissus à E12.5, soit le double des cellules positives (GFP + et β-gal +) sont observés à travers le mésencéphale et rhombencéphale avec les projections se répandre à travers le mésencéphale ventral (figure 1B). Dans le cerveau adulte, le Wnt1 lignée marquée à E8.5 donne lieu à de nombreuses structures du mésencéphale, y compris les colliculi supérieur et inférieur ainsi que dans le voisinage de populations de cellules dopaminergiques de l&#39;aire tegmentale ventrale et la substantia nigra (figure 1D) (voir Zervas aussi 2004). En revanche, le Wnt1 lignée marquée à E9.5 donne lieu à colliculi inférieur, ainsi que pour les neurones dans le voisinage de populations de cellules dopaminergiques (figure 1F). <img src="/files/ftp_upload/1687/1687fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1 Résultats Représentant pour Wnt1-sort de cartographie.: Des exemples de l&#39;ensemble de montage et les résultats de l&#39;immunocytochimie Wnt1-CreERT; embryons mGFP et adulte sort de cerveaux mappé (marqué) à E8.5 (AD)et E9.5 (EF). A. Wnt-1 CREER; embryons mGFP à E12.5 fluorescence de la GFP présentent principalement dans le mésencéphale (Mb), rhombencéphale postérieur (Hb) et la moelle épinière (Sp). Cellules B. marquée visualisées et analysées au niveau cellulaire par immunohistochimie comme indiqué sur cette 1-um d&#39;épaisseur section optique (objectif 40x, z-series d&#39;acquisition). Marquage de l&#39;anticorps nucléaires β-galactosidase (nβ-gal) (rouge) et l&#39;étiquetage des anticorps GFP (vert) indique le destin des cellules mappées montré dans le mésencéphale ventral. Ici, les cellules recombinées sont doubles positifs (nβ-gal + / GFP +) en raison de la nature de la journaliste mGFP conditionnelle. C. Whole montage de microscopie de fluorescence révèle fluorescence de la GFP faibles dans le supérieur colliculi (SC) de l&#39;adulte (en médaillon). Évaluer la lignée Wnt1 marqué à E8.5 sur des sections adultes avec un faible grossissement (5x) microscopie révèle que la lignée Wnt1 donne lieu à des structures du mésencéphale dont le supérieur (CS) et inférieur (IC) colliculi (C). D. Une 40x, 1 mm de section optiques prises à partir du mésencéphale ventral dans le voisinage des neurones dopaminergiques avec des cellules + nβ-gal et une GFP + riche axonale plexus. E. Marquage au résultat E9.5 dans l&#39;étiquetage GFP substantielle qui est facilement observable dans le colliculus inférieur du mésencéphale par l&#39;ensemble de montage de fluorescence (en médaillon). La lignée Wnt1 marqué à E9.5 sur des sections pour adultes (β-gal +, rouge) est concentrée dans le colliculus inférieur (dorso-postérieure du mésencéphale) comme vu à faible grossissement (5x) microscopie (E). F. Un 40x, 1 mm de section optiques prises à partir du mésencéphale ventral dans le voisinage des neurones dopaminergiques avec des cellules + nβ-gal et une GFP + riche axonale plexus. Wnt1 neurones dérivés marqués à E8.5 E9.5 rapport sont progressivement restreint de contribuer à la dorsale du mésencéphale, tandis que la lignée Wnt1 persiste en contribuant à mésencéphale ventral.

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	<li>Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+conditional+reporter+alleles+in+the+developing+embryo+and+embryonic+nervous+system.">Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system.</a> Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).</li><li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1.">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li></ol>

Tous les auteurs ont contribué également à ce travail et sont classés par ordre alphabétique. La contribution de chaque individu est apparente par sa participation dans l&#39;article la vidéo.

Le système GIFM que nous avons démontré peut être utilisé pour répondre à un large éventail de questions dans une variété de processus cellulaires. Par exemple, des souris conçues avec des pilotes Cre différentes peuvent être utilisées pour cibler n&#39;importe quel type cellulaire, tissulaire ou de la lignée génétique de l&#39;intérêt. En outre, parce que le tamoxifène peut être administré à n&#39;importe quel point dans le temps embryonnaire ou postnatale, la recombinaison peut être ciblée sur...

a practical approach to genetic inducible fate mapping: a visual guide to mark and track cells in vivo

Le destin des cartes sont générées par le marquage et le suivi des cellules in vivo pour déterminer comment les progéniteurs de contribuer à des structures spécifiques et des types de cellules dans le développement et tissus adultes. Une avance de ce concept est G enetic j&#39;ai mangé nducible F M apping (GIFM), reliant l&#39;expression des gènes, le destin des cellules, et les comportements des cellules in vivo, pour créer des cartes basées sur le destin lignée génétique. GIFM exploite X-créer des lignes où X est un gène ou un ensemble d&#39;éléments de régulation génique qui confère une expression spatiale d&#39;une protéine bactériophage modifié, la recombinase Cre (CREER T). CREER T contient une version modifiée du e r strogen domaine eceptor liaison du ligand qui rend CREER T séquestré dans le cytoplasme en l&#39;absence du tamoxifène. La liaison du tamoxifène communiqués T CREER, qui translocation vers le noyau et la recombinaison de médiateur entre des séquences d&#39;ADN flanqué de sites loxP. En GIFM, la recombinaison se produit généralement entre un loxP flanquée Arrêtez cassettes précédant un gène rapporteur comme la GFP. Les souris sont élevés pour contenir une région ou d&#39;une cellule spécifique du type CREER et un allèle journaliste conditionnelle. Les souris non traitées seront pas marquer parce que la cassette Arrêt à la journaliste empêche la transcription supplémentaires du gène rapporteur. Nous administrons le tamoxifène par gavage oral à chronométré enceintes femelles, ce qui permet un contrôle temporel de CREER T libération et la translocation vers le noyau ultérieures retirer la cassette d&#39;arrêt de la journaliste. Après recombinaison, l&#39;allèle journaliste est constitutivement et heritably exprimé. Cette série d&#39;événements tels que les marques les cellules de leur histoire génétique est indélébile enregistrées. Le journaliste recombinés sert ainsi un traceur de haute fidélité lignée génétique qui, une fois sur, est découplée de l&#39;expression des gènes initialement utilisé pour le lecteur T CREER. Nous appliquons GIFM de souris pour étudier le développement normal et déterminer la contribution des lignées génétiques à des types de cellules adultes et des tissus. Nous utilisons également GIFM à suivre sur les cellules mutantes origines génétiques pour mieux comprendre les phénotypes complexes qui imitent traits saillants de troubles génétiques humains. Cet article vidéo guide les chercheurs grâce à des méthodes expérimentales pour appliquer avec succès GIFM. Nous démontrons la méthode utilisant notre bien caractérisés Wnt1-CREER T; souris mGFP en administrant le tamoxifène à jour embryonnaire (E) 8.5 par gavage suivie par dissection à E12.5 et l&#39;analyse par stéréomicroscopie épifluorescence. Nous démontrons également comment les micro-domaines disséquer le destin tracé pour la préparation ou l&#39;analyse FACS explant et disséquer les adultes destin tracé cerveaux pour monter toute l&#39;imagerie fluorescente. Collectivement, ces procédures permettent aux chercheurs d&#39;aborder des questions essentielles en biologie du développement et des modèles de maladie.

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A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Cartographie génétique inductible Fate (GIFM) les marques et les cellules des pistes avec un contrôle spatial et temporel bien<em&gt; In vivo</em&gt; Et élucide comment les cellules d&#39;une lignée génétique spécifique contribuer au développement et les tissus adultes. Démontré ici sont les techniques requises pour le sort des embryons de souris E12.5 carte pour l&#39;analyse et à épifluorescence explant.

Une approche pratique de la cartographie inductible destin génétique: un guide visuel à Mark et Track Cellules In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

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Biology

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

16.7K vues.  Brown University. Cartographie génétique inductible Fate (GIFM) les marques et les cellules des pistes avec un contrôle spatial et temporel bien In vivo Et élucide comment les cellules d'une lignée génétique spécifique contribuer au développement et les tissus adultes. Démontré ici sont les techniques requises pour le sort des embryons de souris E12.5 carte pour l'analyse et à épifluorescence explant.

Vidéo: A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Recherche

Biologie

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

Un système d&#39;attache magnétique d&#39;enquêter sur les visuels et olfactifs Flight Control Mediated chez la drosophile

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Une approche de génétique inverse pour tester redondance fonctionnelle pendant l&#39;embryogenèse

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Cartographie sort des cellules souches embryonnaires humaines par la formation de tératome

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Simple cartographie du destin cellulaire chez le poisson zèbre

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Les explants blastomères à l&#39;essai pour l&#39;engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

Un guide pratique pour Phylogenetics pour non-experts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validation d&#39;un modèle de souris de perturber CLIC complexes de façon spécifique à la cellule

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

La cartographie du génome à l&#39;échelle du médicament-ADN interactions dans les cellules avec COSMIC (réticulation de petites molécules pour isoler la chromatine)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...