Nous sommes reconnaissants aux Drs Aravinthan Samuel et Marc Gershow qui ont aidé à développer la version initiale de l’appareil comportemental et Matthew Batie qui a modifié l’appareil comportemental. Cette recherche a été soutenue par la subvention fiduciaire de l’Hôpital pour enfants de Cincinnati, JST/PRESTO, March of Dimes et NIH R01 GM107582 à F.N.H.

1. Préparation des mouches
<ol><li>Expériences light dark (LD)
	<ol>
<li>Élever les mouches dans des incubateurs (25 °C/40-60 % d’humidité relative (HR)) sous des cycles légers de 12 h/foncé de 12 h (LD). L’intensité lumineuse des incubateurs est d’environ 500 à 1 000 lux.</li>
		<li>Deux incubateurs sont nécessaires pour compléter les tests de comportement sur une période de 24 heures. Les deux incubateurs doivent avoir une lumière programmable avec des fonctions ON OFF. Ils devraient également avoir des portes solides qui ne sont pas perméables à la lumière(c’est-à-dire pas de verre ou de plexiglas). Remarque : Un incubateur doit être désigné comme un incubateur « de jour » et réglé sur un cycle LD de 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité. Le deuxième incubateur doit être désigné comme un incubateur « de nuit » et réglé à l’inverse du premier avec 12 heures d’obscurité suivie de 12 heures de lumière. L’incubateur de nuit doit être placé dans la pièce accessible dans l’obscurité, de manière à ce que les mouches connaissant des conditions nocturnes soient facilement accessibles pour les expériences.</li>
		<li>Placez les flacons de mouche dans des incubateurs de jour ou de nuit. Recueillir les mouches nouvellement écloses dans un flacon frais, 20-30 par analyse et conserver dans le même incubateur pendant 2-3 jours.</li>
		<li>Après 2-3 jours, utilisez des mouches pour le test comportemental de préférence de température.<ol>
<li>Pour les expériences de jour (Zeitgeber time (ZT) 0-12), collectez les mouches de l’incubateur de jour.</li>
			<li>Juste avant les expériences comportementales, sortez les flacons de mouche collectés de l’incubateur de jour.</li>
			<li>Pour les expériences de nuit (ZT 13-24), collectez les mouches de l’incubateur de nuit.</li>
			<li>Juste avant les expériences comportementales, sortez les flacons de mouche collectés de l’incubateur de nuit, enveloppez-les de papier d’aluminium et placez-les dans une boîte dans la pièce sombre sous une lampe rouge. Remarque: Étant donné que le test comportemental de préférence de température est effectué dans l’obscurité pour les expériences de nuit, l’exposition à la lumière aux mouches doit être évitée jusqu’à la fin des expériences comportementales. Remarque : Les mouches ne doivent pas être exposées au dioxyde de carbone le jour où les expériences doivent avoir lieu.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Expériences d’obscurité constante (DD)
	<ol>
<li>
Jour JD
		<ol>
<li>Un incubateur supplémentaire est nécessaire pour les expériences de jour DD, que nous appelons un incubateur de « transition » pour le reste du manuscrit. L’incubateur de transition doit être placé dans la pièce accessible dans l’obscurité, de manière à ce que les mouches connaissant des conditions de DD soient facilement accessibles pour les expériences. Un exemple d’horaire d’éclairage pour un incubateur de transition aurait la lumière allumée de 13 h à 19 h et la lumière éteinte de 19 h à 13 h(Figure 1).</li>
			<li>Recueillir les mouches qui ont été soulevées dans l’incubateur de jour. Placez les flacons volants dans l’incubateur de transition entre 13 h et 19 h, lorsque la lumière est allumée. De cette façon, les mouches sont correctement exposées à la lumière jusqu’à 19 heures, heure à laquelle la lumière s’éteint.</li>
			<li>Le lendemain, avant 13 heures, dans des conditions sombres, sortez les flacons volants de l’incubateur de transition, enveloppez-les de papier d’aluminium et placez-les dans une boîte. Gardez la boîte dans n’importe quel incubateur pendant un jour de plus.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Nuit DD
		<ol>
<li>Recueillir les mouches qui ont été soulevées dans l’incubateur de nuit dans l’obscurité sous une lampe rouge. Ou collectez en outre les mouches lorsque la lumière de l’incubateur de nuit est allumée.</li>
			<li>Enveloppez les flacons collectés avec du papier d’aluminium dans l’obscurité chaque fois que les lumières sont éteintes et placez les flacons dans une boîte. Conservez la boîte dans n’importe quel incubateur pendant deux jours supplémentaires(Figure 1B). Remarque: Étant donné que le test comportemental de préférence de température est effectué dans l’obscurité pour les expériences de nuit, l’exposition à la lumière aux mouches doit être évitée jusqu’à la fin des expériences comportementales.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Expériences à lumière constante (LL)
	<ol>
<li>
Journée LL
		<ol>
<li>Un incubateur supplémentaire est nécessaire pour les expériences de jour LL. Cet incubateur maintient l’état LL (25 °C, 800 lux), avec la lumière allumée en continu.</li>
			<li>Recueillir les mouches qui ont été soulevées dans l’incubateur de jour. Placez les flacons de mouche dans l’incubateur LL à tout moment au cours de leur « journée ».</li>
		</ol>
</li>
		<li>
LL Nuit
		<ol>
<li>Recueillir les mouches qui ont été soulevées dans l’incubateur de nuit. Transférez les flacons volants de l’incubateur de nuit à l’incubateur LL pendant le temps où la lumière dans l’incubateur de nuit est allumée. Remarque: Par exemple, la lumière s’éteint à 7 heures du matin dans l’incubateur de nuit. Transférez les flacons volants de l’incubateur de nuit à l’incubateur LL avant 7 heures du matin et conservez les flacons dans l’incubateur LL pendant 4 jours supplémentaires. Remarque: Au jour 4 dans des conditions LL, l’oscillation de l’activité locomoteur est supprimée15,16, tandis que le TPR est encore soutenu 3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. L’appareil pour le test comportemental de préférence de température
<ol><li>Placez un couvercle en plexiglas (29 cm x 19,2 cm)(figure 4)sur une plaque d’aluminium.</li>
	<li>Surveillez la température de l’air entre la plaque et le couvercle. Six sondes de température sont fixées à différentes positions à l’intérieur du couvercle à l’intérieur de l’une des voies(Figure 2). Remarque : Assurez-vous que les sondes ne touchent ni la plaque d’aluminium ni le couvercle en plexiglas. La température de l’air doit être réglée sur un gradient de 18 à 32 °C.</li>
	<li>Placer l’appareil dans une pièce environnementale maintenue à une température de 25 °C/65 à 75 % HR. Cette pièce doit être scellée de toute lumière extérieure. Une pièce environnementale est normalement équipée de ventilateurs pour maintenir une certaine température et humidité. Remarque : L’air du ventilateur perturbe probablement un gradient de température stable sur l’appareil. Pour éviter cela, nous utilisons une feuille transparente qui couvre la zone entourant l’appareil.</li>
	<li>Préparez un thermomètre et un hygromètre pour vérifier la température et l’humidité dans la pièce environnementale. Remarque: La lumière influence la préférence de température de la drosophile3. La même intensité lumineuse doit être fournie uniformément sur l’appareil. L’intensité de nos lumières de salle environnementale est d’environ 800 lux. Remarque: Lorsque les expériences comportementales sont terminées, placez un tube connecté à partir du réservoir de CO2 ou alimentez-le près du trou du haut de l’appareil afin d’anesthésier et de se débarrasser des mouches.</li>
</ol>3. Préparation de l’appareil en vue de son utilisation
<ol><li>Allumer l’appareil pendant au moins 30 min afin d’établir correctement le gradient de température à la surface de la plaque(figure 3).</li>
	<li>Enduit le couvercle de l’appareil de comportement d’un hydrofuge pour empêcher les mouches d’escalader les murs ou le plafond du couvercle. Essuyez l’excès d’hydrofuge et laissez le couvercle pendant 25-30 min pour sécher.</li>
	<li>Retirez toute condensation sur la plaque d’aluminium. Placez le couvercle en plexiglas sur la plaque d’aluminium et fixez-le à l’avec six pinces en C (Figure 2). Remarque: Il est très important que le couvercle soit bien scellé, si nécessaire, du ruban adhésif double stick peut être utilisé.</li>
	<li>Laissez le couvercle pendant au moins 15 min. Le gradient de température de l’air entre la plaque d’aluminium et le couvercle est créé à partir de 18-32 °C.</li>
</ol>4. Test de comportement de préférence de température
<ol><li>Chargez les mouches dans l’espace entre la plaque d’aluminium et le couvercle en plexiglas de l’appareil à travers de petits trous au centre de chaque voie du couvercle(figures 2 et 4). Couvrez les trous avec des glissements de couverture pour empêcher les mouches de s’échapper.</li>
	<li>Pour les conditions sombres, éteignez toutes les lumières de la pièce environnementale. Une lampe rouge peut être utilisée lorsque les mouches sont placées dans l’appareil. Assurez-vous que les mouches ne sont pas exposées à des lumières à l’exception d’une lampe rouge jusqu’à ce que les expériences comportementales soient terminées.</li>
	<li>Pour chaque essai, utilisez 20 à 25 mouches adultes, qui ne doivent pas être réutilisées dans les essais ultérieurs. Le test comportemental est effectué pendant 30 min. Prenez quelques photos avec ou sans flash. Veillez à ne pas faire beaucoup de bruit ou de mouvements brusques pendant les expériences.</li>
	<li>Enregistrer la température des six sondes de l’appareil. Prenez note de la température ambiante ainsi que de l’humidité.</li>
	<li>Anesthésiez les mouches de l’appareil avec du dioxyde de carbone gazeux, desserrez les pinces, retirez le couvercle en plexiglas et retirez les mouches de la plaque. Après chaque expérience, les mouches sont jetées. Essuyez toute condensation ou humidité de la plaque. Remplacez le couvercle sur la plaque et serrez-le avec les pinces en vue de la prochaine expérience.</li>
	<li>Afin d’avoir une représentation de la préférence de température tout au long de la journée, la période de 24 heures est divisée en huit fuseaux horaires, quatre pendant la journée et quatre la nuit. Par exemple, nous utilisons ces ZT ou CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 et 22-24. Remarque: Puisque les variations de phénotype causées par des effets de masquage sont attendues juste après que la lumière est allumée (ZT0) ou ÉTEINTe (ZT12), nous n’examinons pas le comportement de préférence de température pendant ces périodes (ZT ou CT 0-1, 11.5-13 et 23.5-24). Au moins cinq essais doivent être effectués dans chaque fuseau horaire pour que les résultats soient statistiquement solides.</li>
</ol>5. Analyse des données
<ol><li>Calculez le gradient de température comme suit : Déterminez où les sondes de température sont placées en fonction des deux règles placées sur les côtés supérieur et inférieur du couvercle en plexiglas le long des bords(Figure 2A).</li>
	<li>Le gradient de température entre les sondes de température est estimé linéaire. En fonction de l’emplacement des sondes de température, ainsi que de leurs températures enregistrées correspondantes, tracez des lignes représentant chaque degré de température dans la position appropriée sur les images. Comptez le nombre de mouches situées dans chaque intervalle de degrés. Exclure les mouches sur les murs ou le plafond de la couverture.</li>
	<li>Calculez le pourcentage de mouches dans chaque plage de température de chaque voie. Une température moyenne préférée est calculée en additionnant les produits du pourcentage de mouches et de la température de chaque intervalle, comme indiqué ci-dessous: % de mouches x 18,5 °C + % de mouches x 19,5 °C + % de mouches x 20,5 °C ....+ % de mouches x 31,5 °C + % de mouches x 32,5 °C.</li>
	<li>Calculer la température moyenne préférée dans chaque fuseau horaire : le comportement de préférence de température est effectué >5 fois au cours de chaque fuseau horaire (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 et 22-24). Pour calculer la température moyenne préférée dans chaque fuseau horaire, la température moyenne préférée de chaque essai est calculée ensemble. Les barres d’erreur s.e.m. sont égales à l’erreur entre les essais.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thermophysiological+cascade+leading+to+sleep+initiation+in+relation+to+phase+of+entrainment.">The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment.</a> Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).</li><li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+sleep-wake+cycle+reconsidered+from+a+thermoregulatory+point+of+view.">The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view.</a> Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).</li><li>Kaneko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+Rhythm+of+Temperature+Preference+and+Its+Neural+Control+in+Drosophila.">Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila.</a> Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).</li><li>Allada, R., Chung, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+organization+of+behavior+and+physiology+in+Drosophila.">Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila.</a> Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).</li><li>Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Running+hot+and+cold:+behavioral+strategies,+neural+circuits,+and+the+molecular+machinery+for+thermotaxis+in+C.+elegans+and+Drosophila..">Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis in C. elegans and Drosophila..</a> Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).</li><li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li><li>Hong, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+signalling+in+mushroom+bodies+modulates+temperature+preference+behaviour+in+Drosophila.">cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila.</a> Nature. 454, 771-775 (2008).</li><li>Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Thermal+preference+in+Drosophila.">Review: Thermal preference in Drosophila.</a> J. Therm. Biol. 34, 109-119 (2009).</li><li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and.">Opposite thermosensor in fruitfly and.</a> Nature. 423, 822-823 (2003).</li><li>Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coding+of+temperature+in+the+Drosophila+brain.">The coding of temperature in the Drosophila brain.</a> Cell. 144, 614-624 (2011).</li><li>Stevenson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+importance+of+behavioral+and+physiological+adjustments+controlling+body+temperature+in+terrestrial+ectotherms.">The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms.</a> Am. Nat. 126 (3), (1985).</li><li>Refinetti, R., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+rhythm+of+body+temperature.">The circadian rhythm of body temperature.</a> Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).</li><li>Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Later+endogenous+circadian+temperature+nadir+relative+to+an+earlier+wake+time+in+older+people.">Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people.</a> Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).</li><li>Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic+integrator+for+circadian+rhythms.">The hypothalamic integrator for circadian rhythms.</a> Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).</li><li>Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+behaviour+associated+with+altered+homeostasis+and+photosensitivity+of+Drosophila+clock+mutants.">Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants.</a> J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).</li><li>Qiu, J., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=per+mRNA+cycling+is+locked+to+lights-off+under+photoperiodic+conditions+that+support+circadian+feedback+loop+function.">per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function.</a> Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).</li><li>Crocker, A., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+sleep.">Genetic analysis of sleep.</a> Genes Dev. 24, 1220-1235 (1220).</li><li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state.">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li><li>Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlates+of+sleep+and+waking+in+Drosophila+melanogaster.">Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 1834-1837 (2000).</li><li>Parisky, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDF+cells+are+a+GABA-responsive+wake-promoting+component+of+the+Drosophila+sleep+circuit.">PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit.</a> Neuron. 60, 672-682 (2008).</li></ol>

Il n’y a rien à divulguer.

Ici, nous illustrant les détails de l’appareil comportemental de préférence de température et l’analyse du comportement TPR. La drosophile montre les dispositifs saillants, robustes, et reproductibles de TPR horloge-commandé. Cependant, nos données suggèrent qu’au moins deux facteurs, lumière ambiante et âge, perturbent de manière significative les phénotypes comportementaux de TPR.
Nous observons que la lumière affecte de manière significative la préférence de te...

La température est un indice environnemental omniprésent. Les animaux présentent une variété de comportements afin d’éviter les températures nocives et d’en rechercher des confortables. La drosophile présente un comportement de préférence de température robuste6,7. Lorsque les mouches sont libérées dans un gradient de température de 18-32 °C, les mouches évitent les températures chaudes et froides et choisissent finalement une température préférée de 25 °C le matin3. Les capteurs de température chaude sont un ensemble de neurones thermosensoriaux, neurones AC, qui expriment le canal de potentiel de récepteur transitoire de la drosophile (TPR), TRPA16,9. Les capteurs de température froide sont situés dans les 3èmes segments antennaux, car l’ablation des 3èmes segments antennaux provoque l’absence d’évitement de température froide6. Récemment, la protéine TRPP Brivido (Brv) a été identifiée10. Puisque Brv est exprimé dans les 3èmes segments antennaux et négocie la détection du froid, Brv est une molécule de détection à froid possible, qui est critique pour le comportement de préférence de température. En somme, les mouches utilisent ces deux capteurs de température pour éviter les températures chaudes et froides et trouver une température préférée.
Alors que les mammifères génèrent de la chaleur pour réguler leur température corporelle, les ectothermes adaptent généralement leur température corporelle à la température ambiante11. Certains ectothermes sont connus pour présenter un comportement quotidien de TPR qui est considéré comme une stratégie pour les ectothermes pour réguler leur BTR12. Pour déterminer si les mouches ont exhibé TPR, nous avons répété l’analyse comportementale de préférence de température à divers points pendant une durée de 24 heures. Nous avons constaté que la drosophile présente un TPR quotidien, qui est faible le matin et élevé le soir et suit un modèle similaire à celui du BTR chez l’homme13.
Chez la drosophile, il y a ~ 150 neurones d’horloge dans le cerveau. Les neurones de l’horloge qui régulent l’activité locomotrice sont appelés oscillateurs M et E. Cependant, fait intéressant, les oscillateurs M et E ne régulent pas TPR, au lieu de cela, nous avons montré que les neurones d’horloge DN2 dans le cerveau régulent TPR mais pas l’activité locomoteur. Ces données indiquent que TPR est réglé indépendamment de l’activité locomotrice. Notamment, le BTR des mammifères est également régulé indépendamment de l’activité locomoteur. Les études d’ablation chez le rat montrent que le BTR est contrôlé par des neurones SCN spécifiques qui ciblent un sous-ensemble différent de neurones de la zone subparventriculaire que ceux qui contrôlent l’activité locomotrice14. Par conséquent, nos données considèrent la possibilité que le BTR des mammifères et le TPR de la mouche soient conservés de manière évolutionnelle3, car le TTR de la mouche et le BTR des mammifères présentent des rythmes de température dépendant de l’horloge circadienne, qui sont régulés indépendamment de l’activité locomoteur.
Ici, nous décrivons les détails de la façon d’analyser le test comportemental TPR chez la drosophile. Cette méthode permet d’enquêter non seulement sur le mécanisme moléculaire et les circuits neuronaux de TPR, mais aussi sur la façon dont le cerveau intègre différents indices environnementaux et horloges biologiques internes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="578">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:172px;">Bright Lab Jr. Safelight</td>
			<td style="width:109px;">Amazon</td>
			<td style="width:153px;">#B00013J8UY</td>
			<td style="width:144px;">Red light for dark rooms</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:172px;">Rain X</td>
			<td style="width:109px;">SOPUS products</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">Water repellent: Apply the plexiglass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:172px;">C-Clamp</td>
			<td style="width:109px;">Home Depot</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:172px;">Temperature/hygrometer</td>
			<td style="width:109px;">Fisher</td>
			<td style="width:153px;">15-077-963</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:172px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:172px;">Peltier devices</td>
			<td style="width:109px;">TE Technology, Inc.</td>
			<td style="width:153px;">HP-127-1.4-1.15-71P</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:172px;">Thermometer</td>
			<td style="width:109px;">Fluke</td>
			<td style="width:153px;">Fluke 52II</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:172px;">Bench top controller</td>
			<td style="width:109px;">Oven Industries</td>
			<td style="width:153px;">5R6-570-15R and 5R6-570-24R</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:172px;">Temperature sensor probe</td>
			<td style="width:109px;">Oven Industries</td>
			<td style="width:153px;">TR67-32</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:172px;">Generic 480 Watt ATX power supply</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">computer cooling system</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:172px;">MCR220-QP-RES Dual 120 mm Radiator with reservoir&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Swiftech</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">computer cooling system</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:172px;">MCP350 In-Line 12V DC pump</td>
			<td style="width:109px;">Swiftech</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">computer cooling system</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:172px;">MCW50 graphics Card liquid cooler</td>
			<td style="width:109px;">Swiftech</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">computer cooling system</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:172px;">Scythe Kaze-Jyuni SY1225SL12SH fan</td>
			<td style="width:109px;">Crazy PC</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">computer cooling system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and analysis of temperature preference behavior and its circadian rhythm in drosophila

L’horloge circadienne régule de nombreux aspects de la vie, y compris le sommeil, l’activité locomoteur et les rythmes de température corporelle (BTR)1,2. Nous avons récemment identifié une nouvelle sortie circadienne de drosophile, appelée le rythme de préférence de température (TPR), dans lequel la température préférée chez les mouches augmente pendant la journée et tombe pendant la nuit 3. Étonnamment, la TPR et l’activité locomotrice sont contrôlées par des neurones circadiens distincts3. L’activité locomotrice de la drosophile est une production comportementale circadienne bien connue et a fourni de fortes contributions à la découverte de nombreux gènes et mécanismes de l’horloge circadienne des mammifères conservés4. Par conséquent, la compréhension de TPR mènera à l’identification des mécanismes circadiens moléculaires et cellulaires jusqu’ici inconnus. Ici, nous décrivons comment effectuer et analyser le test TPR. Cette technique permet non seulement de disséquer les mécanismes moléculaires et neuronaux de la TPR, mais fournit également de nouvelles informations sur les mécanismes fondamentaux des fonctions cérébrales qui intègrent différents signaux environnementaux et régulent les comportements des animaux. En outre, nos données récemment publiées suggèrent que la mouche TPR partage des caractéristiques avec le mammifère BTR3. Les drosophiles sont des ectothermes, dans lesquels la température corporelle est généralement régulée par le comportement. Par conséquent, TPR est une stratégie utilisée pour générer une température corporelle rythmique chez ces mouches5-8. Nous croyons qu’une exploration plus approfondie de la Drosophile TPR facilitera la caractérisation des mécanismes sous-jacents au contrôle de la température corporelle chez les animaux.

Un exemple du rythme de préférence de température est illustré à la figure 5. Si la procédure de comportement est effectuée avec succès, les mouches doivent présenter un TPR dans lequel elles préfèrent une température basse le matin et une température plus élevée le soir. L’augmentation de ~1-1,5 °C pendant la journée dans la préférence de température doit être observée au cours de la journée, quel que soit le fond génétique, puisque nous avons montré que w1118<...

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Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Nous avons récemment identifié une nouvelle drosophile circadienne, le rythme de préférence de température (TPR), dans lequel la température préférée chez les mouches augmente pendant la journée et tombe pendant la nuit. TPR est régulé indépendamment d’une autre sortie circadienne, l’activité locomoteur. Nous décrivons ici la conception et l’analyse de TPR chez la drosophile.

Conception et analyse du comportement de préférence de température et de son rythme circadien chez la drosophile

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

design-analysis-temperature-preference-behavior-its-circadian-rhythm

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Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Unit 1

Alternative Signaling Routes in Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

8.0K vues.  Cincinnati Childrens Hospital Medical Center. Nous avons récemment identifié une nouvelle drosophile circadienne, le rythme de préférence de température (TPR), dans lequel la température préférée chez les mouches augmente pendant la journée et tombe pendant la nuit. TPR est régulé indépendamment d’une autre sortie circadienne, l’activité locomoteur. Nous décrivons ici la conception et l’analyse de TPR chez la drosophile.

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High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Haute résolution de mesure du comportement Odor-Driven dans les larves de drosophile

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

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Biologie

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

Objectif transplantation chez le poisson zèbre et son application dans l&#39;analyse de mutants Eye

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Etudier Checkpoint mitotique en illustrant le comportement dynamique des protéines Kinetochore et Motion chromosomique chez Vivre<em&gt; Drosophila</em&gt; Les embryons syncytial

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

Extraction et analyse de cortisol de l&#39;homme et de singe cheveux

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Cytologique Analyse de la spermatogenèse: Préparatifs en direct et fixes de<em&gt; Drosophila</em&gt; Testicules

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Analyse rapide des phénotypes circadiens dans Arabidopsis protoplastes transfectées avec un Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. To improve the mating efficiency of B. Xylophilus and to increase the chances of mating observation, virgin adults were cultured and used for the investigation. Eggs were obtained by keeping the nematodes in water and allowing the females to lay eggs for 10 min. The second-stage juveniles (J2) were synchronized by incubating the eggs for 24 h at 25 &#176;C in the dark, and the early J4 were obtained by culturing the J2 with grey mold, Botrytis cinerea, for another 52 h. At this time point, most J4 nematodes could be clearly distinguished as being male or female using their genital morphology. The male and female J4 were collected and cultured separately in two different Petri dishes for 24 h to get virgin adult nematodes. A virgin male and a virgin female were paired in a drop of water in the well of a concave slide. The mating behavior was filmed with a video recorder under a stereomicroscope. The whole period of the mating process was 82.8 &#177;3.91 min (mean &#177;SE) and could be divided into 4 different phases: searching, contacting, copulating, and lingering. The mean minutes of duration were 21.8 &#177; 2.0, 28.0 &#177; 1.9, 25.8 &#177; 0.7 and 7.2 &#177; 0.5, respectively. Eleven sub-behaviors were described: cruising, approaching, encountering, touching, hooping, locating, attaching, ejaculating, separating, quiescence, and roaming. Interestingly, obvious intra-sexual competition was observed when one female was grouped with 3 males or one male with 3 females. This protocol is useful and valuable, not only in investigating the mating behavior of B. xylophilus, but also in acting as a reference for ethological studies of other nematodes.

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

Observation et Quantification de Mating Comportement dans le nématode,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

Analyse des comportements de croissance Arabidopsis thaliana dans différentes qualités de lumière

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this rhythm and to understand the resulting outputs, entrainment of model organisms to defined circadian time-points is required. Here we detail a procedure to entrain many Drosophila to a defined circadian rhythm. Furthermore, we detail post-entrainment steps to prepare samples for immunofluorescence, nucleic acid, or protein extraction-based analysis.

Here, we detail how to synchronize Drosophila to a circadian day. This is the first, and most important step necessary for studying biological rhythms and chronobiology.

Formation circadienne de Drosophila Melanogaster

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Disséquer, fixer et visualiser la nymphe de la drosophile Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...