Nous remercions Harald Hutter et Hélène Decker pour leur lecture attentive de ce manuscrit. Nous remercions également Reg Sidhu de Leica Microsystems pour son expertise technique. Cette recherche a été soutenue par les sciences naturelles et en génie du Canada, le Prix # 327100-06, et l&#39;Université Simon Fraser Faculté des sciences.

Partie 1: La transfection de neurones utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Matériel mis en place: Neurones hippocampiques de rat ou la souris sont cultivées selon les Kaech et Banker, 2006 [4]. La densité cellulaire typique utilisée pour la transfection est de 250.000 plat cells/6-cm. Réactifs nécessaires et les équipements comprennent 50 mM d&#39;acide kynurénique, régulier porte-tube de paillasse, un refroidisseur de paillasse (le meilleur pour garder froids réactif Lipofectamine), Réactif Lipofectamine, MEM, microtubes de, micropipetters, et une pince stérile. Procédure: <ol><li> Pour chaque étiquette de transfection deux tubes de 1,5 ml, l&#39;une pour contenir l&#39;ADN plasmidique, une pour contenir le réactif de transfection. Les incubations suivantes peuvent procéder à la température ambiante. <ol><li> Combinez 1,0 ug d&#39;ADN plasmidique avec 100 uL MEM dans un tube (sans suppléments de toute nature; MEM n&#39;a pas besoin d&#39;être à la température du pH équilibré). </li><li> Combinez 6,0 uL Lipofectamine avec 100 uL MEM dans l&#39;autre tube de 1,5 ml. <ol><li> Aucun ajustement pour les transfections doubles sont nécessaires même si la Lipofectamine: ratio de l&#39;ADN va être réduite de moitié dans de tels cas. Le ratio de Lipofectamine: l&#39;ADN est encore au sein de la suggestion du fabricant. Il est préférable de tester 0,5 à 1,0 pg pour chaque plasmide d&#39;expression optimale. </li><li> Pour préserver la durée de conservation du réactif Lipofectamine, il devrait être retiré du réfrigérateur pour une durée aussi courte que possible et placés dans une glacière paillasse lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé. Durée totale du réfrigérateur doit être maintenu au minimum. </li></ol></li></ol></li><li> Incuber les tubes pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Transférer la solution d&#39;ADN-en-MEM dans le tube de lipides, et mélanger délicatement avec une pipette, puis incuber pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Après 25 minutes, avant de lamelles retournement, ajouter 60 ul de 50 mM d&#39;acide kynurénique pour minimiser les dommages excitoxic le plat de neurones en culture. <ol><li> Lamelles soigneusement retourner pieds-secondaires à l&#39;aide des pinces stériles, et d&#39;organiser de sorte qu&#39;ils ne se chevauchent pas. Soyez prudent de ne pas racler la surface des neurones à revêtement de la lamelle ou la surface glie revêtement du plat. </li></ol></li><li> Prenez environ 0,5 mL de milieu de l&#39;antenne de 6 cm et mélanger délicatement avec de l&#39;ADN dans le tube, le transfert de la solution d&#39;ADN de retour à l&#39;antenne goutte uniformément sur la surface du milieu. </li><li> Ne pas tourbillon, mais doucement glisser plat avant en arrière dans une direction, puis arrêter et recommencer dans le sens perpendiculaire à répartir uniformément les complexes ADN-lipofectamine. Incuber pendant 90 minutes dans l&#39;incubateur de culture tissulaire (37 ° C CO, 5% 2). </li><li> Retourner lamelles pieds à l&#39;envers, et organiser de sorte qu&#39;ils ne se chevauchent pas. Permettre l&#39;expression de procéder pour l&#39;heure désirée, généralement durant la nuit à 48 heures. </li></ol> Partie 2: Imagerie en direct de la GFP-marqués à noyau dense de vésicules dans des cultures de neurones de l&#39;hippocampe Matériel mis en place: <ol><li> L&#39;imagerie de cellules vivantes nécessite un microscope à fluorescence équipé d&#39;une caméra CCD, nous utilisons un Leica DMI 6000B microscope inversé équipé de la variable Leica, lampe fluorescente. Il faut également une chambre d&#39;imagerie avec régulateur de température et un chauffe-objectif. Nous utilisons la Warner Instruments RC-21BR modifié pour une lamelle de 18 mm en plus d&#39;un chauffe-plateforme (cat. # PH2) et régulateur de température (cat. # TC324B). La chambre ne contient pas de ports ouverts, une modification qui peut être inclus lors de la commande de la chambre. Un chauffe objectif est hautement recommandé pour aider à maintenir la température de la lamelle et minimiser les changements d&#39;orientation, en raison des fluctuations de température. Les images sont acquises avec un Hamamatsu Orca-ER utilisant Metamorph (Molecular Devices) logiciels, y compris le &#39;streaming&#39; mode d&#39;acquisition de drop-in. Notez-Nous n&#39;utilisons pas une chambre climatique qui enferme le microscope entier. Cet ajout est coûteux et pas nécessaire pour l&#39;imagerie à court terme décrites ici. </li><li> Autres équipements et réactifs comprennent fraîchement milieu préparé imagerie en temps réel (1X Hanks avec Ca 2 + et Mg 2 +, glucose 0,6%, et HEPES 10 mM), d&#39;autres lamelles de verre de 18 mm, une pince stérile, non stérile forceps, Kimwipes, graisse à vide , et une seringue (sans aiguille ou avec modifiés wide-bore aiguille) avec lequel d&#39;appliquer de la graisse. </li></ol> Procédure: <ol><li> Préparer une solution fraîche moyennes imagerie en temps réel (1X Hanks avec Ca 2 + et Mg 2 +, glucose 0,6%, et HEPES 10 mM). Nous préparent habituellement 50ml à un moment et conserver à 4 o C lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé. Il est préférable de préparer suffisamment pour pas plus d&#39;une semaine à la fois. Environ 5-10 ml sont utilisés par plat de neurones. </li><li> Démarrer microscope, caméra, lampe fluorescente, et un logiciel d&#39;acquisition d&#39;image. Également tourner sur la puissance de la plate-forme de la chambre et les chauffe-objectif. </li><li> Préparer l&#39;imaginezg de chambre. <ol><li> La chambre de Warner comporte un insert en Teflon pour le montage des lamelles. Pour la facilité de manipulation, l&#39;étiquette d&#39;un côté de l&#39;insert &quot;top&quot; avec un marqueur permanent. </li><li> Appliquer un anneau de graisse sur la rainure entourant le trou dans le côté de la chambre étiquetés &quot;top&quot;. Évitez d&#39;utiliser des excès comme il entrer dans la chambre et de réduire la zone observable. </li><li> En utilisant des pinces, fixez un endroit propre, inutilisée de 18 cm lamelle à l&#39;&quot;top&quot; côté de la chambre, appliquez une légère pression sur la lamelle à ses bords afin de créer un joint étanche à l&#39;intérieur de la rainure en retrait de la chambre. </li><li> Tourner la chambre au-dessus et appliquer une bague similaire de la graisse dans la rainure sur la face (en bas) côté de la chambre. </li><li> Placez la chambre de prêt-bas vers le haut sur le couvercle d&#39;un tube de 50 ml, qui est un titulaire de chambre idéale. </li><li> Ajouter 750 ul de milieu de l&#39;imagerie à la chambre. C&#39;est une quantité excessive, mais la graisse doit empêcher que le milieu de se répandre et de l&#39;excédent permettra d&#39;éviter les bulles d&#39;être pris au piège lorsque la lamelle de cellules-couverts est appliquée. </li><li> Maintenir la chambre préparée dans le incubateur de culture tissulaire jusqu&#39;à ce que nécessaire. Incubations prolongées, ~ 1 heure doit être évitée comme moyen d&#39;imagerie va s&#39;évaporer et le changement dans la composition. </li></ol></li><li> Effectuer l&#39;assemblage final et la chambre imagerie des cellules vivantes. <ol><li> Déplacer la chambre préparée et un plat de lamelles transfectées par l&#39;incubateur de la hotte de culture de tissus. </li><li> L&#39;ensemble de chambre final devrait être effectué rapidement pour assurer les cellules restent immergés dans le milieu et à 37 ° C en continu. </li><li> En utilisant une pince stérile, retirez soigneusement une lamelle de l&#39;antenne transfectées, toucher le bord de la lamelle à un Kimwipe pour entraîner un milieu de croissance. </li><li> Placer la lamelle neurone à l&#39;envers sur la chambre préparée. Tactile d&#39;un côté de la lamelle à la graisse d&#39;abord et appliquer une pression sur les bords d&#39;apporter la lamelle à plat, sans bulles de piégeage. Moyennes imagerie excès se renverse comme prévu. </li><li> Essuyez moyennes imagerie excès, mais attention à ne pas glisser les lamelles hors de position. </li><li> Déplacer la chambre pour le chauffe-plateforme de pré-chauffée et fixez la chambre en place. </li><li> Transfert de la chambre à la scène. </li><li> Afin de réduire photoblanchiment et photoxicity, ajuster la lampe à la quantité minimum d&#39;intensité nécessaire de trouver des cellules transfectées. </li><li> Trouvez une cellule d&#39;intérêt avec un objectif d&#39;huile faible grossissement (40X). Il est bénéfique de s&#39;en tenir à un modèle de recherche prévues pour assurer une couverture maximale et lamelle pour éviter des acquisitions d&#39;images redondantes, par exemple, en haut à gauche de la lamelle, la numérisation de haut en bas de travail à la droite. </li><li> Basculer vers un objectif de grossissement élevé du pétrole (60-100x) une fois un champ désiré a été localisé. </li><li> Utilisez «acquisition stream&quot; ou une fonction comparable de votre logiciel d&#39;imagerie pour enregistrer une vidéo de la dynamique des protéines marqués à la fluorescence. </li><li> Prenez une image de phase et d&#39;autres images d&#39;accompagnement (par exemple la GFP soluble) pour une analyse ultérieure et la présentation. </li><li> Enregistrer toutes les images avant d&#39;explorer la lamelle plus loin et l&#39;enregistrement de la vidéo suivante. </li><li> Généralement 3-5 vidéos d&#39;un lamelle est considérée comme réussie. La phototoxicité et la santé des cellules générale devrait être gardé à l&#39;esprit que le transport est réduite dans les cellules endommagées. La santé cellulaire peut être suivie par observation au microscope de phase. Typiquement enregistrements sont effectués pour environ 30 minutes par lamelle. </li></ol></li></ol> Partie 3: Résultats du représentant: En direct les observations d&#39;imagerie cellulaire sont généralement constitués de vidéos (aussi connu comme &quot;piles&quot; d&#39;images) qui montrent le mouvement des organites fluorescence marqués dans le champ de vision (figure 1A). Accompagnant chaque vidéo sont souvent le soutien des images qui illustrent l&#39;orientation du champ de vision à l&#39;égard des corps de la cellule, le niveau d&#39;expression des protéines et / ou la santé de la cellule. Vidéos de transport peuvent être soumis à une analyse quantitative par transformation d&#39;kymographs (figure 1B). Kymographs sont des images qui illustrent le mouvement des particules en juxtaposant scans en ligne, où chaque point est représenté par une colonne de la kymographe. La figure 2 montre comment deux particules se déplaçant en sens inverse sont représentés dans un kymographe. Une analyse plus poussée des kymographs peut fournir des informations sur le flux de particules, la vitesse, longueur d&#39;exécution, les inversions et des particules immobiles. <img src="/files/ftp_upload/1144/fig1.jpg" alt="" /> Figure 1. Représentant direct Observations d&#39;imagerie cellulaire. (A) les cadres sélectionnés à partir d&#39;un vidéo de mCherry-taggés Plasminogen activator (TPA) de transport. Les particules individuelles dans le mouvement antérograde (flèches vertes) et rétrograde (flèches rouges) les directions sont indiquées. (B) Kymographs illustrant TPA-mCherry mouvement dans leaxone. Les lignes horizontales dans les kymographs représenter des objets stationnaires, tandis que les lignes diagonales représentent les organites s&#39;éloigner de (pente positive) ou vers (pente négative) du corps cellulaire. Les longues flèches vertes et rouges indiquent les pistes correspondant aux particules en (A). Les changements dans le transport en raison de la dépolymérisation des microtubules réactif, nocodazole, est également illustrée avec une kymographe. Notez la réduction des organites en mouvement par l&#39;absence de lignes diagonales.

<ol>
	<li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport.">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li><li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon.">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li><li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides.">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

Imagerie des cellules vivantes est une technique difficile, mais puissant pour l&#39;observation directe des transports en organite neurones en culture. Des difficultés peuvent survenir en amont de la procédure avec la santé des neurones pauvres à cause de complications de la culture. Par conséquent, la santé des cellules (pour des exemples voir réf. 4) devrait être évaluée avant et après la transfection par l&#39;observation des lamelles alors que dans un milieu de croissance à l&#39;aide d&#39;un microscop...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?ID=1144">Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons</a>. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:

David M. Kwinter, Michael A. Silverman

instead of:

David Kwinter, Michael Silverman.

A correction to author names has been made for article Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>Transfection reagent</td>
</tr>
<tr>
<td>10X Hanks with Ca2+ and Mg2+</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>14185-052</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>15630-130</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons

L&#39;observation et la caractérisation dynamique des processus cellulaires peuvent donner des informations importantes sur l&#39;activité cellulaire qui ne peut pas être acquise à partir d&#39;images statiques. Vital sondes fluorescentes, en particulier la protéine fluorescente verte (GFP) ont révolutionné la biologie cellulaire provenant de la capacité d&#39;étiquette spécifique compartiments intracellulaires et des structures cellulaires. Par exemple, l&#39;imagerie en temps réel de la GFP (et ses variantes spectrale) chimères ont permis une analyse dynamique du cytosquelette, le transport des organites, et la dynamique des membranes dans une multitude d&#39;organismes et de types cellulaires [1-3]. Bien que l&#39;imagerie vivons est devenue prédominante, cette approche pose encore de nombreux défis techniques, en particulier dans les neurones primaires en culture. Une des difficultés est l&#39;expression de la GFP dans les protéines étiquetées neurones post-mitotiques, l&#39;autre est la capacité à capturer des images fluorescentes tout en minimisant la phototoxicité, photoblanchiment, et maintenir la santé cellulaire en général. Ici nous fournissons un protocole qui décrit une méthode de transfection à base de lipides qui donne un taux de transfection est relativement faible (~ 0,5%), est cependant idéal pour l&#39;imagerie des neurones complètement polarisée. Un taux faible de transfection est essentielle pour que les axones et des dendrites seule peut être caractérisée comme à leur orientation vers le corps cellulaire pour confirmer la directionnalité du transport, c&#39;est à dire, antérograde c. rétrograde. Notre approche à l&#39;imagerie neurones exprimant la GFP s&#39;appuie sur une norme large champ microscope à fluorescence équipé d&#39;une caméra CCD, un logiciel de capture d&#39;image, et une chambre chauffée imagerie. Nous avons imagé une grande variété d&#39;organites ou structures, par exemple, à noyau dense de vésicules, les mitochondries des cônes de croissance, et l&#39;actine sans optiques ou exigences particulières d&#39;excitation autre qu&#39;une source de lumière fluorescente. De plus, le spectre est distincte, les protéines marquées par fluorescence, par exemple, la GFP et DsRed-protéines étiquetées, peuvent être visualisées simultanément près de caractériser la co-transport ou autres coordonnées événements cellulaires. L&#39;approche d&#39;imagerie décrit ici est flexible pour une variété d&#39;applications d&#39;imagerie et peut être adopté par un laboratoire pour un coût relativement peu fourni un microscope est disponible.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Imagerie des cellules vivantes est d&#39;une utilité particulière lorsque l&#39;on étudie la dynamique du trafic des organelles. Nous décrivons ici un protocole d&#39;imagerie en temps réel du noyau dense vésicules dans des neurones cultivés en utilisant la microscopie à fluorescence à champ large. Ce protocole est flexible et peut être adaptée aux organites autre image tels que les mitochondries, les endosomes, et les peroxysomes.

Imagerie en temps réel du noyau dense de vésicules cultures primaires neurones de l&#39;hippocampe

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

live-imaging-dense-core-vesicles-primary-cultured-hippocampal

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K vues.  Simon Fraser University. Imagerie des cellules vivantes est d'une utilité particulière lorsque l'on étudie la dynamique du trafic des organelles. Nous décrivons ici un protocole d'imagerie en temps réel du noyau dense vésicules dans des neurones cultivés en utilisant la microscopie à fluorescence à champ large. Ce protocole est flexible et peut être adaptée aux organites autre image tels que les mitochondries, les endosomes, et les peroxysomes.

Vidéo: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun transfection de neurones de l&#39;hippocampe

Recherche

Biologie

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and memory. Primary hippocampal cell culturing allows neuroscientists to examine the activity and properties of neurons at the individual cell and single synapse level. In this video, we will demonstrate how to isolate and grow primary hippocampal cells from newborn rats. The hippocampus may be isolated from each newborn animal in as short as 2 to 3 minutes, and the cultures can be maintained for up to two weeks. We will also briefly demonstrate how to use these hippocampal neurons for ratiometric calcium imaging. While this protocol describes the process for the hippocampus, with little to no modification, it can be applied to other regions of the brain.

The dissection and growth of cells from an individual brain area facilitates investigation of cellular and physiological parameters. We describe a method for primary cell culturing that produces neuron-enriched cultures in a serum-free environment.

Culture primaire de neurones de l&#39;hippocampe de rats nouveau-nés P0

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Adénovirus suppression génétique des molécules de signalisation dans les cultures de fibroblastes de souris embryonnaires primaires

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D imagerie de l&#39;agrégation des protéines dans les cellules vivantes

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Organite Transport en culture d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Cellules: S2 Cell Line et neurones primaires.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualisation de G3BP stress Granules dynamique dans les cellules primaires en direct

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

Imagerie de cellules vivantes primaires de rats néonatals cardiomyocytes Suite à adénovirus et Lentivirales transduction confocale à disque rotatif Microscopie

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...