Les auteurs tiennent à remercier la plate-forme Montpellier Rio Imaging (MRI) où les acquisitions ont été réalisées. Ils remercient Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot, et Virginie Georget pour leur aide dans différentes parties du protocole. Ce travail a été soutenu par la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).

Toutes les procédures d&#39;animaux dans ce protocole sont en stricte conformité avec les lignes directrices de la directive du Conseil communautaire européen du 24 Novembre 1986 (86-609/EEC). Maison des souris du groupe, permettant la nourriture et de l&#39;eau ad libitum. Les maintenir dans un environnement contrôlé (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% d&#39;humidité) avec un 12 heures: 12 heures de lumière: cycle d&#39;obscurité (lumière sur à 7h00). 1 Culture de cellules murines primaires:. Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) <ol><li> Autoclave pinces fines, ainsi que des pinces et des ciseaux de dissection courbes. Conserver dans un contenant stérile. Utilisation stérile D-PBS (Phosphate-Buffered Saline de Dulbecco). Préparer un milieu complet MEF: milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) / F12 supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (FBS), 1 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 1% d&#39;acides aminés non essentiels, et mM de 2-mercaptoéthanol 0,5 et chaud à 37 ° C. </li><li> Euthanasier une souris enceinte (à 13,5 jours post-coïtum (DPC)) Par dislocation cervicale. Retirez les cornes utérines de la souris aseptisé avec 90% EtOH. Sous une hotte stérile et propre, placer les cornes avec les embryons dans 37 ° C préchauffé D-PBS. Ouvrez le cornes, le lieu les embryons dans une boîte de Petri en plastique stérile 100 mm, les nettoyer de la matière du cordon ombilical et les laver chaud D-PBS pour éliminer l&#39;excès de sang. En vertu d&#39;un binoculaire, enlever les branches de l&#39;embryon, les organes internes et la partie supérieure de la tête contenant le cerveau. </li><li> Dans une nouvelle boîte de Pétri, émincer l&#39; embryons en très petits morceaux avec un instrument chirurgical stérile lame ou des ciseaux (au moins pendant 1 min). Dans le cas d&#39;embryons de différents génotypes, veillez à mettre chaque embryon dans des plats individuels de Petri et de garder la queue ou la tête supérieure pour le génotypage. </li><li> Couvrir l&#39;embryon avec 1x trypsine-EDTA (0,25% de trypsine, 1 mM EDTA). Incuber pendant 30 min à 1 heure dans un incubateur à 37 °. Ajouter 10 ml de completMilieu MEF pour arrêter la réaction de la trypsine. Pipette de haut en bas pour éliminer tous les agrégats. Laisser reposer la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml (rempli de milieu complet) pendant 10 min, le surnageant et centrifuger pendant 5 min à 300 x g à température ambiante. Reprendre le culot dans du milieu complet (6 ml d&#39;une embryon). Cellules nucléées viables peuvent être comptées en utilisant trypan bleu (Environ 5 x 10 6 cellules peuvent être attendus d&#39;un embryon). Plaque 3 ml par 60 mm boîte de Petri. </li><li> Changer le support le lendemain et permettre aux cellules de se développer jusqu&#39;à ce que les plats sont confluentes. Beaucoup types de cellules peuvent être vus, mais seules vont survivre sous-culture des fibroblastes. </li><li> Fractionner les cellules et leur permettre de se développer dans des boîtes de 35 mm avec fond en verre (important pour l&#39;expérience laps de temps), jusqu&#39;à 50-70% de confluence pour la transfection. Test de Mycoplasma et des agents pathogènes de la souris. </li></ol> 2. Culture Adaptations dans le cas des neurones <ol><li> La veille de la culture, le manteau 35 mm verre plats de Pétri de fond avec la poly-L-lysine (200 pi de 0,1 mg / ml) sous une hotte stérile et propre, et laisser toute la nuit. </li><li> Le lendemain matin, rincer à l&#39;eau pure stérile, deux fois pendant 5 min et une fois pendant 45 minutes à 1 heure. Remplacer par 2 ml de DMEM plus 10% de FBS et conserver dans un incubateur à 37 ° C. </li><li> Disséquer embryons à 18,5 dpc. Sous une hotte stérile et propre, placer les cornes avec les embryons dans le froid HBSS stérile (solution saline équilibrée de Hank) en 100 mm boîte de Petri. Chiots nouveau-nés peuvent également être utilisés à la place des embryons afin de préserver la vie de la mère et de lui permettre de produire plus de descendants, en particulier dans le cas des animaux transgéniques qui peuvent être difficiles à obtenir. Dans les plats individuels de Petri, prendre chaque embryon ou du nouveau-né et couper la tête avec des ciseaux. Maintenir la tête en insérant pince courbe dans les yeux, couper la peau et ouvrir avec précaution le crâne mou à l&#39;arrièrede la tête jusqu&#39;à ce que les yeux, de chaque côté de la tête. Couper les nerfs optiques et le tronc cérébral, retirez le cerveau, et le mettre dans une nouvelle boîte de Pétri contenant HBSS. En vertu d&#39;un stéréoscope, supprimer toutes les méninges à l&#39;aide de deux pinces fines. Séparer les hippocampes, le cortex ou une autre partie du cerveau en fonction de la structure à étudier. </li><li> Immerger la structure cérébrale disséquée dans 4,5 ml de HBSS froid préparé précédemment dans 15 ml de tubes et de garder sur de la glace jusqu&#39;à ce que la digestion avec la trypsine. Ajouter 0,5 ml de 2,5% de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 15 min à 20 min. Rincer le 3x de la trypsine avec du HBSS, étant extrêmement attention à ne pas jeter les parties du cerveau digérés. </li><li> Remettre en suspension dans 500 pi (hippocampes) à 1 ml (cortex) DMEM plus 10% de FBS et pipette de haut en bas plusieurs fois avec 1 ml micropipette munie d&#39;un embout 1 ml, alors équipé d&#39;1 ml, plus de 200 conseils de pi, jusqu&#39;à ce qu&#39;il y est aucun agrégat visible. </li><li> Distribuer 100 à 200 pl de suspension cellulaire à chaque botto de verre de 35 mmm plat contenant du DMEM plus 10% de FBS et laisser les neurones adhèrent à 37 ° C pendant au moins 3 h. Remplacer par un milieu complet préchauffé neurone (milieu Neurobasal additionné de 250 uM de L-glutamine et NS21, préparé comme décrit dans Chen et al. 19) et laissé à 37 ° C pour permettre la croissance neuronale. Transfecter les neurones à 5 à 14 jours in vitro (div) (l&#39;efficacité de la transfection est plus élevé après un couple de connexions synaptiques div mais sont mieux établie 7-10 div). </li></ol> 3. Transfection de EGFP-G3BP1 Construct Transfecter des cellules avec un vecteur contenant l&#39;ADNc de votre protéine d&#39;intérêt (l&#39;un des composants de SG) fusionné à un marqueur fluorescent (GFP, YFP, etc), en utilisant 3 ug de plasmide purifié par boîte de 35 mm. <ol><li> Transfecter les FAE en utilisant une méthode commerciale, en suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux / Réactifs). </li><li> Transfecter les neurones avec une calciumProcédé phosphate adapté de Xia et al 20 Brièvement.: <ol><li> Préparer les solutions: DMEM-lavage: DMEM contenant 25 mM de KCl; solution de transfection: DMEM-lavage contient 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl 2 10 mM, du rouge de phénol); et une solution de choc: HeBS 1x, 1x DMKY, et DMSO 2% (v / v); et gardez-les à 37 ° C. </li><li> Retirez le support de neurones, filtrat, et le maintenir à 37 ° C. Laver avec du DMEM-lavage puis remplacer par du milieu de transfection et maintenir à 37 ° C au cours de la préparation des précipités d&#39;ADN calcium-phosphate plasmide. </li><li> Dans un tube à centrifuger de 1,5 ml, ajouter (dans cet ordre) Braun eau (volume final de 50 ul), 5 pi de CaCl2 2,5 M et 3 pg d&#39;ADN de plasmide. Déposez ce mélange sur 50 pi de HeBS 2x déjà introduit dans un tube à fond rond en polypropylène. Mélanger le tube par rotation avec la chute. Laissez la forme de précipité à la température ambiante pendant 30 min. </li><li> Ajouter le precipitate goutte à goutte sur les neurones et laisser à 37 ° C pendant 30 à 50 min. </li><li> Remplacer avec une solution de choc pendant 1 min, puis rincer avec du DMEM-lavage et enfin réintroduire le milieu préconditionné. Gardez les cellules à 37 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Visualisation de G3BP contenant Assemblée et dynamique SG <ol><li> Remplacez le support des cellules qui contient du phénol rouge par milieu dépourvu de rouge phénol. </li><li> Utiliser un microscope confocal équipé de fluorescence pour les acquisitions. Mettre en marche le système de microscope: une lampe au mercure, un ordinateur, et des lasers. Réchauffez la chambre à 37 ° C au moins 20 minutes avant le début des acquisitions. </li><li> L&#39;expression de plus de G3BP induit la formation spontanée d&#39;un type de SG. Les cellules peuvent donc être observées pour l&#39;ensemble des 24 SG droit h après la transfection sans induction du stress. Sinon, le stress peut être amené à induire en outre l&#39;ensemble de SG. Ajouter arsénite de sodium à 0,5 mM et étoilest l&#39;acquisition immédiatement après l&#39;addition du composé (granules seront bien formés à l&#39;intérieur de 1 heure). </li><li> Ajouter de l&#39;huile à l&#39;objectif à immersion (utiliser 40X 63X ou objectifs) et installer la boîte de Pétri sur l&#39;objectif dans le porte-microscope 35 mm adapté, stabilisée sur le support de la scène. Vérifiez que le plat est plat sinon les acquisitions seront modifiés. Allumez la lumière de fluorescence en fonction de la fluorophore pertinentes et visualiser les cellules transfectées. Désactiver fluorescence fois une cellule d&#39;intérêt est dans le domaine afin d&#39;éviter le blanchiment et la cytotoxicité. </li><li> Dans le &quot;acquérir onglet&quot;, sélectionnez les lasers en fonction de la longueur d&#39;onde d&#39;excitation du fluorophore tag (488 nm dans notre protocole qui utilise G3BP EGFP marqués) et sélectionner la longueur d&#39;émission adaptée pour le PMT (tube photomultiplicateur). Régler la puissance du laser (généralement pas plus de 10%) pour réduire au minimum le bruit et la sursaturation de même que la toxicité, et de régler le gain et le décalage de modifier le rapport signal sur bruit.Numérisation rapide (1000 Hz) afin de minimiser la durée d&#39;exposition au laser (moyenne de la ligne 2, la moyenne de l&#39;image 1). Si vous le souhaitez, définissez les paramètres de la pile de Z pour pouvoir reconstruire l&#39;image en 3D (une étape de Z de 1 um est généralement bien avec les cellules). Déterminer l&#39;intervalle de temps entre chaque acquisition: des intervalles plus petits permettent d&#39;obtenir un film plus cohérente, mais cela peut provoquer une toxicité et de photo-blanchiment (un intervalle de 20 secondes a été utilisé dans les expériences décrites). Durée d&#39;acquisition totale peut varier en fonction du type de stress. Beaucoup de SG contenant G3BP sont formés très rapidement sous traitement de l&#39;arsénite et sont bien visibles après 1 heure de traitement: dans ce cas, choisir rapidement les cellules de filmer et de commencer les acquisitions à droite après le stress, d&#39;une durée totale de l&#39;acquisition de 15 - 20 min largement suffisante pour observer l&#39;assemblage de plusieurs Commissions d&#39;études. </li><li> Enregistrer les images et reconstituer les piles et film en utilisant le logiciel ImageJ. </li></ol>

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	<li>Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+granules:+The+good,+the+bad+and+the+ugly.">RNA granules: The good, the bad and the ugly.</a> Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules:+sites+of+mRNA+triage+that+regulate+mRNA+stability+and+translatability.">Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability.</a> Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules:+the+Tao+of+RNA+triage.">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Tourri&#232;re, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP+assembles+stress+granules.">The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).</li><li>Parker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ras-GTPase-activating+protein+SH3-domain-binding+protein.">A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).</li><li>Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+G3BP1+as+a+RasGAP+binding+protein:+sensitization+of+tumor+cells+to+chemotherapy+by+the+RasGAP+317-326+sequence+does+not+involve+G3BP1.">Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1.</a> PLOS ONE. 6 (12), (2011).</li><li>Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+G3BPs:+tissue+specific+expression,+chromosomal+localisation+and+rasGAP(120)+binding+studies.">Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).</li><li>Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#945;+Binds+G3BP2+and+Regulates+Stress+Granule+Formation+Following+Cellular+Stress.">PKC&#945; Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress.</a> PLOS ONE. 7 (4), (2012).</li><li>Tourri&#232;re, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RasGAP-associated+endoribonuclease+G3Bp:+selective+RNA+degradation+and+phosphorylation-dependent+localization.">RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).</li><li>Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+helicase+VIII:+a+DNA+and+RNA+helicase+corresponding+to+the+G3BP+protein,+an+element+of+the+ras+transduction+pathway.">Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway.</a> Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).</li><li>Solomon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+structural+features+of+caprin-1+mediate+its+interaction+with+G3BP-1+and+its+induction+of+phosphorylation+of+eukaryotic+translation+initiation+factor+2alpha,+entry+to+cytoplasmic+stress+granules,+and+selective+interaction+with+a+subset+of+mRNAs.">Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).</li><li>Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras-GAP+SH3+domain+binding+protein+(G3BP)+is+a+modulator+of+USP10,+a+novel+human+ubiquitin+specific+protease.">Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease.</a> Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).</li><li>Zekri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+fetal+growth+and+neonatal+survival+by+the+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP.">Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).</li><li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+G3BP1,+the+stress+granules+assembly+factor,+results+in+abnormal+synaptic+plasticity+and+calcium+homeostasis+in+neurons.">Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons.</a> Journal of neurochemistry. , (2013).</li><li>Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression.">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li><li>Colombrita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+is+recruited+to+stress+granules+in+conditions+of+oxidative+insult.">TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult.</a> Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).</li><li>Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Staufen+1+is+recruited+to+stress+granules+and+impairs+their+assembly.">Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly.</a> Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).</li><li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NS21:+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures.">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).</li><li>Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Influx+via+the+NMDA+Receptor+Induces+Immediate+Early+Gene+Transcription+by+a+MAP+Kinase/ERK-Dependent+Mechanism.">Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Current protocols in neuroscience. 3, (2001).</li><li>Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+G3BP-induced+granules+trigger+eIF2&#945;+phosphorylation.">Large G3BP-induced granules trigger eIF2&#945; phosphorylation.</a> Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Les étapes les plus critiques dans le protocole concernent la transfection et plus particulièrement les acquisitions de laps de temps, qui doivent être surveillés attentivement afin d&#39;abaisser en bas de la cytotoxicité. Culture de cellules primaires n&#39;est pas une partie difficile, tant que les conditions stériles sont maintenus et la prudence sont prises afin d&#39;éviter des dommages lors de la dissection et de dissociation cellulaire étapes. MEF peut être conservé congel?...

granules de stress (SG) sont des foyers cytoplasmique non-membraneux formé comme une réponse protectrice cellulaire à un stress environnemental, tels que température élevée, le stress oxydatif, hypoxie, choc osmotique, irradiation UV, la privation de glucose, ou une infection virale. Ils peuvent être induits chimiquement par traitement avec des composés comme l&#39;arsénite de sodium, ce qui provoque un stress oxydatif. SG s&#39;accumulent au point mort traduction arrêté messager ribonucléoprotéique (mRNP) Complexes 2, la séquestration des ARNm de la machinerie traductionnelle, et leur assemblage peut être déclenchée par la phosphorylation de eIF2α (facteur d&#39;initiation eucaryote 2 α). SG sont des structures dynamiques qui échangent des composants avec les polysomes et autres granulés comme les P-organismes. Ils constituent un «centre de triage» où ARNm sont triés et traités soit pour la traduction, réamorçage, la dégradation ou l&#39;emballage dans stables mRNP non polysomique 3. L&#39;ensemble de la SGS est rapide but est un processus progressif avec de nombreux petits agrégats initiaux qui confluent en granules plus grands. L&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs chimiques qui perturbent ou stabilisent les microtubules montre que le réseau de microtubules est nécessaire pour la dynamique de la SG y compris les processus ensemble, coalescence et de démontage. L&#39;assemblage dynamique de SG est également favorisée par l&#39;agrégation des protéines liant l&#39;ARN spécifiques (ARN-BP) comme la norme TIA-1 (T-cellule interne antigène-1) et TIAR (protéine liée TIA-1), qui sont capables de dimériser et promouvoir polysome démontage et l&#39;acheminement des ARNm dans SG 4. G3BP (domaine RasGAP SH3 de la protéine de liaison) est telle un ARN-BP qui localise à SG lorsque les cellules sont stressés à l&#39;arsénite ou une température élevée, et la surexpression de G3BP dephosphoryle peuvent induire SG ensemble 5. G3BP est un ARN-BP évolutivement conservées qui a été initialement caractérisée par son interaction avec une protéine d&#39;activation de Ras-GTPase (p RasGAP120 6); mais cette interaction a été récemment revisitée 7. La famille G3BP comprend deux membres chez les mammifères, G3BP1 (dénommé G3BP) et G3BP2 8. Les deux protéines colocalisent SGS, lorsque les cellules sont exposées à un stress 9. G3BPs comprennent un domaine de NTF2 N-terminal a suggéré d&#39;influer sur leur localisation et oligomérisation, suivie riche en proline (PxxP) motifs, puis des motifs C-terminaux associés à la liaison de l&#39;ARN: la canonique ARN motif de reconnaissance (RRM) avec RNP1 et RNP2 motifs conservés , suivie d&#39;un riche (RGG) boîte arginine-glycine. Chose intéressante, l&#39;analyse des différentes parties de la protéine par la construction de différents domaines fusionné à la EGFP a montré que le domaine NTF2-like et le domaine de liaison à l&#39;ARN étaient les plus efficacement recruté pour SG, ce qui suggère l&#39;importance des propriétés de dimérisation et de liaison d&#39;ARN dans l&#39;ensemble de la SGS. Modèles divers ont mis en évidence différentes fonctions des protéines G3BP in vitro 10-13.Perturbation de G3BP chez la souris ont montré l&#39;importance de cette protéine dans la croissance et la survie de développement 14, ainsi que d&#39;un rôle important pour G3BP dans le système nerveux central (SNC), caractérisé par une ataxie et des défauts dans la mémoire de travail spatiale 15. Carence G3BP conduit à altération neuronale et la plasticité calcium homéostasie, établissant un lien direct entre la formation de SG et les maladies neurodégénératives 15. Il est donc important d&#39;être en mesure d&#39;étudier la dynamique de la SG dans des cellules primaires comme les neurones. Ce protocole fournit un moyen simple d&#39;observer l&#39;ensemble de SG contenant G3BP1 dans les cellules primaires sous traitement de l&#39;arsénite. Il peut être utilisé pour étudier l&#39;assemblage SG dans des conditions différentes, par exemple différentes sortes de contraintes. Il peut également être adapté à d&#39;autres granules ou d&#39;autres constituants de la SGS. En effet, ce protocole met l&#39;accent sur ​​G3BP1, mais il ya d&#39;autres marqueurs de granules de stress comme la norme TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (Fragile X Mental Retardation protéine Syndrome) 16, (protéine de liaison à l&#39;ADN de réponse transactive 43) TDP-43 17 ou 18 Staufen. En particulier, les protéines comme la norme TIA-1 / R sont, comme G3BP, nucléation des protéines de liaison d&#39;ARN qui peuvent induire ensemble SG lorsqu&#39;il est surexprimé, même si les différentes SG formés peuvent différer en fonction, la régulation et les transcriptions associés. Transfection de la version fluorophore marqué de l&#39;un de ces composants clés de nucléation ou de SG peut être effectuée à l&#39;image notamment de montage et dynamique SG.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:153px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:312px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21331</td>
			<td>Pre-warm at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Trypsin</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glass bottom B-35</td>
			<td style="width:153px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">627860/627861</td>
			<td>Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">DMEM</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966</td>
			<td>Pre-warm at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">HeBS</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21103</td>
			<td>Pre-warm at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:153px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">DU-110-A</td>
			<td>Very thin, tips 0,1 mm (useful to remove meninges)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:153px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">P-110-BUF</td>
			<td>Very thin, tips 0,1 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Small scissors</td>
			<td style="width:153px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">CM-85-BS</td>
			<td>Can be useful to remove hippocampi</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyplus transfection JetPEI reagent&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Ozyme</td>
			<td style="width:119px;">101-10</td>
			<td>MEFs transfection, follow the forward protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:153px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of g3bp stress granules dynamics in live primary cells

SG peut être visualisé dans les cellules par immunocoloration de composants protéiques spécifiques ou polyA + ARNm. SG sont très dynamique et l&#39;étude de leur assemblage et le destin est important de comprendre la réponse cellulaire au stress. Le déficit en facteurs clés de SG comme G3BP (RasGAP domaine SH3 de Binding Protein) conduit à des anomalies du développement chez les souris et les altérations du système nerveux central. Pour étudier la dynamique de SG dans les cellules d&#39;un organisme, une des cellules primaires de culture de boîtes et de suivre la localisation d&#39;un composant marqué transfectées de SG. Nous décrivons expérience time-lapse pour observer SG contenant G3BP1 en fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Cette technique peut également être utilisée pour étudier GV contenant de G3BP dans les neurones vivants, ce qui est crucial car il a été montré récemment que ces SG sont formées à l&#39;apparition de maladies neurodégénératives comme la maladie d&#39;Alzheimer. Cette approche peut être adaptée à tout autre composant du corps cellulaire et des protéines de granules, et réaliséeavec des animaux transgéniques, ce qui permet l&#39;étude en temps réel de la dynamique des granules, par exemple en l&#39;absence d&#39;un facteur spécifique de ces granules.

Stress formation de granule est important dans la réponse des cellules à un stress, ce qui permet une adaptation de traduction cellulaire avec point mort, jusqu&#39;à ce que l&#39;effort a disparu, associée à la prévention de l&#39;apoptose. Ce dosage permet d&#39;étudier les SG dans les cellules primaires, en suivant la localisation de composants clés de protéines SGS (Figure 1). G3BP, un facteur clé de l&#39;ensemble SG, est présent plutôt diffuse dans le cytoplasme des MEF en culture ou d...

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Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

granules de stress (SG) sont des granules d&#39;ARN cytoplasmiques contenant des particules bloquées ribonucléoprotéiques (RNP), et important dans la réponse cellulaire à différents stress. Dynamique de SG peuvent être suivies dans les cellules vivantes en visualisant la localisation d&#39;un composant marqué de SG dans des cellules primaires transfectées après le stress.

Visualisation de G3BP stress Granules dynamique dans les cellules primaires en direct

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

visualization-of-g3bp-stress-granules-dynamics-in-live-primary-cells

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K vues.  Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, CNRS UMR 5535.  granules de stress (SG) sont des granules d'ARN cytoplasmiques contenant des particules bloquées ribonucléoprotéiques (RNP), et important dans la réponse cellulaire à différents stress. Dynamique de SG peuvent être suivies dans les cellules vivantes en visualisant la localisation d'un composant marqué de SG dans des cellules primaires transfectées après le stress. 

Vidéo: Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Une technique rapide pour la visualisation de Live cellules de levure immobilisées

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Recherche

Biologie

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

Imagerie en temps réel du noyau dense de vésicules cultures primaires neurones de l&#39;hippocampe

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules de foie de rat

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D imagerie de l&#39;agrégation des protéines dans les cellules vivantes

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualisation de réticulum endoplasmique sous-domaines dans les cellules cultivées

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to stress conditions, are implicated in various aspects of cell metabolism and survival. SGs modulate cellular signaling pathways, post-transcriptional gene expression, and stress response programs. The formation of these mRNA-containing granules is directly connected to cellular translation. SG assembly is triggered by inhibited translation initiation, and SG disassembly is promoted by translation activation or by inhibited translation elongation. This relationship is further highlighted by SG composition. Core SG components are stalled translation pre-initiation complexes, mRNA, and selected RNA-binding Proteins (RBPs). The purpose of SG assembly is to conserve cellular energy by sequestering translationally stalled housekeeping mRNAs, allowing for the enhanced translation of stress-responsive proteins. In addition to the core constituents, such as stalled translation preinitiation complexes, SGs contain a plethora of other proteins and signaling molecules. Defects in SG formation can impair cellular adaptation to stress and can thus promote cell death. SGs and similar RNA-containing granules have been linked to a number of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer, leading to the recent interest in classifying and defining RNA granule subtypes. This protocol describes assays to characterize and quantify mammalian SGs.

Stress Granules (SGs) are nonmembranous cytoplasmic structures that form in cells exposed to a variety of stresses. SGs contain mRNAs, RNA-binding proteins, small ribosomal subunits, translation-related factors, and various cell signaling proteins. This protocol describes a workflow that uses several experimental approaches to detect, characterize, and quantify bona fide SGs.

Méthodes pour classer les foyers cytoplasmiques sous forme de granulés de stress mammalien

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Application de la microscopie vitesse haut débit Super-résolution en direct cil primaire

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

Exploitant imagerie direct aux noyaux de piste au cours de la différenciation des myoblastes et Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...