Ce travail a été soutenu par le NIH R01 NS042228 au MCH L&#39;Olympus FV1000 confocale a été acquise avec une instrumentation NIH partagé octroi S10RR023717 au ministère UW Zoologie (PI Bill Bement). Erica Andersen, Namrata Asuri, et Matthew Clay ont contribué également à ce document.

1. Assemblée des diapositives et des diapositives d&#39;injection d&#39;imagerie Diapositives d&#39;injection: <ol><li> Préparer élastomère de silicone Sylgard conformément aux instructions du fabricant. </li><li> Utilisez le Sylgard d&#39;obligations à trois microscope en verre standard de diapositives ainsi que par l&#39;empilement d&#39;une diapositive sur le dessus de l&#39;intersection des deux autres diapositives, qui sont disposés côte à côte sur les bords longs. Le chariot supérieur crée un angle droit ou de &quot;mur&quot; entre le haut et glisse en bas. </li><li> Laissez Sylgard mis nuit. Ces lames sont réutilisables. </li></ol> Diapositives d&#39;imagerie: <ol><li> Nous utilisons des rectangles d&#39;acier inoxydable coupées à la même taille d&#39;une lame de microscope en verre standard (75mm x 25mm x 1mm) pour la chambre s&#39;adapte le support de diapositives sur la platine du microscope. Un trou de 1,5 cm est coupé dans le centre du rectangle. </li><li> Apposez une lamelle de 22 mm 2 au rectangle en métal avec Sylgard. Utilisez juste assez pour bien sceller Sylgard la lamelle. Pour l&#39;image sur un microscope inversé, les embryons seront montés sur cette lamelle et imagée à partir du bas. </li><li> Laissez Sylgard mis nuit. Ces lames sont réutilisables et nettoyé avec de l&#39;éthanol à 70% entre les utilisations. </li></ol> 2. Préparation de constructions d&#39;ADN Pour exprimer un transgène dans un tissu de manière spécifique, le gène d&#39;intérêt est cloné derrière un promoteur spécifique des cellules. Nous utilisons un élément cis-régulatrices du gène de poisson zèbre neurogenin1 (-3.1ngn1) 2 ou le gène sox10 (-4.9sox10) 3 pour conduire l&#39;expression dans les neurones sensoriels ou des cellules de la crête neurale, respectivement. Pour visualiser la dynamique cellulaire et la membrane, nous exprimons cytoplasmiques ou membranaires localisées fluorophores. Pour l&#39;image de F-actine de distribution, nous exprimons l&#39;ADN codant pour le domaine d&#39;homologie calponine de l&#39;utrophine fusionnée à mCherry (UtrCH-mCherry). La sonde UtrCH-mCherry biocapteur permet la visualisation de la F-actine, sans interférer avec la dynamique de l&#39;actine 1. Nous générer ces constructions d&#39;ADN en utilisant la passerelle Invitrogen recombinaison stratégie basée sur le clonage et les vecteurs de 4 fournie dans le poisson zèbre Tol2kit 5. <ol><li> Générer vecteur d&#39;expression (s) en utilisant multisite-passerelle de la technologie et des vecteurs de la Tol2kit zebrafish 5. Les plasmides contenant l&#39;épine dorsale du Tol2 pT2KXIGDin. </li><li> Purifier l&#39;ADN plasmidique avec QIAfilter Plasmid Midi Kit de préparation (QIAGEN Inc) et éluer à l&#39;eau stérile. L&#39;ADN n&#39;a pas besoin d&#39;être linéarisé pour l&#39;injection. </li></ol> 3. L&#39;injection de constructions d&#39;ADN <ol><li> Diluer l&#39;ADN à une concentration finale de 10-50 pg / ml d&#39;ADN dans le rouge de phénol à 0,2% (pour la visualisation lors de l&#39;injection) dans l&#39;eau. </li><li> Remplir et calibrer l&#39;aiguille: Retour de remplissage d&#39;une aiguille tiré capillaire avec environ 1 ul solution d&#39;ADN et de l&#39;insérer dans le porte-aiguille de l&#39;appareil d&#39;injection (nous utilisons un Picospritzer). En utilisant une pince fine, casser la pointe de l&#39;aiguille de telle sorte que l&#39;ouverture pointe est d&#39;environ 10 mm de diamètre. Mesurer le diamètre de la gouttelette dans l&#39;huile minérale avec un micromètre oculaire. Ajustez le réglage durée de la pression pour obtenir une goutte d&#39;environ 1 volume nl. </li><li> Recueillir une cellule embryons au stade d&#39;embryon dans le milieu de l&#39;E3 (5mm de NaCl, KCl 0.17mm, 0.33mm CaCl 2, MgSO 4 * 0.33mm 7H 2 O, pH 7,0). </li><li> Transfert environ 30-60 embryons à la diapositive d&#39;injection et la position de l&#39;embryon dans le coin à angle droit formé entre le haut et glisse en bas. Enlever la plupart de l&#39;E3 pour que les embryons sont tenues à la diapositive par tension superficielle. </li><li> Utilisez une épingle pliée disséquer pour faire tourner des embryons afin que la cellule est contre le mur de la lame d&#39;injection. </li><li> Utilisez un micromanipulateur pour guider l&#39;aiguille à travers le chorion embryon, à travers le jaune d&#39;œuf et dans la seule cellule de l&#39;embryon. Injecter 0.5 à 1 solution d&#39;ADN nl dans la cellule. </li><li> Transfert des embryons en boîtes de Petri en E3 et incuber à 28,5 ° C. Si nécessaire, le développement peut être ralenti par l&#39;incubation des embryons à plus basse température. </li></ol> 4. Embryons de montage pour l&#39;imagerie <ol><li> Retirez le chorions des embryons avec des pinces fines environ une heure avant embryons atteignent l&#39;âge souhaité pour l&#39;imagerie (environ 14-17 heures après la fécondation pour nos fins). </li><li> Sélectionnez embryons avec des cellules marquées à l&#39;aide d&#39;un microscope de dissection équipés de fluorescence. Nous utilisons un objectif 4X (grossissement 40X) sur un champ de Nikon AZ100 en raison de sa combinaison de longue distance de travail et de grossissement élevé. </li><li> Placer un embryon dans un tube de micro avec environ 50 E3 ul contenant 0,2% de tricaïne anesthésiques (concentration 10X). </li><li> Ajouter 500 ul de 1% d&#39;agarose bas point de fusion de l&#39;E3 avec 10 mM HEPES (maintenue à 42 ° C), diluer la tricaïne à une concentration finale de 0,02%. </li><li> Immédiatement transférer l&#39;embryon dans une goutte d&#39;agarose à l&#39;lamelle de la lame d&#39;imagerie utilisant une pipette en verre grand diamètre. </li><li> Avant l&#39;agarose se durcit, la position de l&#39;embryon ainsi la région avec des cellules marquées est orientée vers le bas contre la lamelle du bas (bas dorsale pour les cellules de la crête neurale et dorsolatéral bas pour les neurones sensoriels spinaux). </li><li> Assemblez la chambre d&#39;imagerie: Manteau d&#39;un côté d&#39;un anneau en plastique (2 cm de diamètre extérieur, 3 mm de haut) avec de la graisse de silicone sous vide et d&#39;apposer à la diapositive imagerie métal. Manteau de l&#39;autre côté de l&#39;anneau avec de la graisse. </li><li> Remplir la chambre avec E3 contenant 10 mM d&#39;HEPES et 0,02% tricaïne. Joint au sommet de chambre par l&#39;apposition d&#39;une lamelle de 22 mm 2 à la surface supérieure de l&#39;anneau graissé. </li></ol> 5. L&#39;imagerie 4D des comportements cellulaires sur l&#39;Olympe FV1000 confocale avec IX81 Microscope Les détails de l&#39;acquisition d&#39;image dépendra des spécificités de votre système de microscope. Nous décrivons ici le processus d&#39;acquisition time-lapse pour l&#39;Olympus FV1000 microscope confocal. Voir le précédent protocole JoVE des time-lapse d&#39;acquisition avec le Zeiss LSM 510 système confocal 6. <ol><li> Placez la chambre d&#39;imagerie dans le support de diapositives sur la platine du microscope et de se concentrer sur l&#39;embryon en utilisant un objectif 10x ou 20x en lumière transmise. </li><li> Basculer vers un objectif 60x (NA de 1,2 ou plus) et se concentrer sur la cellule étiquetés avec épifluorescence. Nous utilisons soit une immersion dans l&#39;huile (UPLSAPO 60xO NA 1,35) ou de l&#39;eau par immersion (UPLSAPO 60xW NA 1,20) lentille. </li><li> Dans le logiciel de FV (Ver 1.7c), cliquez sur répétez XY pour commencer le balayage laser. </li><li> Réglez les paramètres d&#39;acquisition et de contrôle d&#39;acquisition d&#39;image (sortie de laser, la vitesse de balayage, HV, le gain, et les niveaux de décalage) pour optimiser le signal tout en gardant la puissance du laser à un minimum (25% ou moins) pour éviter d&#39;endommager les tissus et réduire photoblanchiment. </li><li> Afin d&#39;acquérir une série Z, définir les limites supérieure et inférieure de la Z-stack, avec la taille du pas. Assurez-vous que l&#39;icône de profondeur est engagée afin que l&#39;icône de balayage XY XY et Z a mis en évidence. Démarrer l&#39;acquisition en cliquant sur l&#39;icône de balayage XYZ. </li><li> Afin d&#39;acquérir une série time-lapse, définissez l&#39;intervalle de temps et le nombre de points dans le temps sous la rubrique TimeScan dans l&#39;acquisition des paramètres de la fenêtre. Cliquez sur l&#39;icône temps dans la fenêtre de contrôle Image Acquisition de telle sorte que l&#39;icône de balayage XY a XY (Z) et T en surbrillance. Démarrer l&#39;acquisition en cliquant sur le XY (Z) l&#39;icône T Sweep. </li><li> Alternativement, le TimeController peut être utilisé pour mettre en place un time-lapse. Cette programmation est utile pour générer des ensembles de données volumineux, comme elle ne dépasse pas l&#39;allocation de mémoire. Sous Périphérique, ouvrez la fenêtre TimeController. Créer une tâche d&#39;imagerie. La fenêtre des paramètres d&#39;image s&#39;ouvre. Cliquez sur le bouton Etat FV à jour les paramètres d&#39;acquisition. Assurez-vous Enregistrer et Supprimer sont vérifiés sous la rubrique Terminer. Définir le nom du fichier de sortie et cliquez sur OK pour enregistrer les paramètres et fermer la fenêtre. Utilisez la fonction de boucle pour définir l&#39;intervalle de temps souhaité et le nombre de points dans le temps. Cliquez Ready et Start pour commencer l&#39;acquisition. La pause et le Z-fonctions de changement peut être utilisé pour recentrer tout d&#39;imagerie. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Les chiffres et les films représentent des exemples de neurones sensoriels et les cellules de la crête neurale étiquetés avec une membrane cible fluorophores ou la sonde biocapteur actine. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1 images confocal (z-projections) de Tg (ngn1: GFP-CAAX). Embryon transgénique injectées avec 25 pg ngn1: mCherry-CAAX ADN. Les étiquettes mCherry-CAAX un neurone rouge (A) dans un fond avec tous les neurones sensoriels ROHON Barbe-étiquetés verts (B). C) image fusionnée des canaux vert et rouge. Barre d&#39;échelle = 50 microns. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2 confocale z-projections des neurones dans les embryons injectés avec ~ 20 pg ngn1:.. MCherry-UtrCH ADN A) ROHON Barbe-neurone sensoriel dans 16,5 embryons HPF. F-actine du signal est forte dans les cônes de croissance (flèches) et en saillies le long des axones nouvellement formé. B) Neuron dans 20 embryons HPF montrant une forte F-actine du signal dans les cônes de croissance de l&#39;axone périphériques branchés (pointes de flèches) et signal plus faible dans le centre plus mature axones (flèches). Barre d&#39;échelle = 50 microns.

<ol>
	<li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo.">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li><li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li><li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination:+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones.">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li></ol>

La concentration optimale de l&#39;ADN injecté varie selon la taille et la force du promoteur de construire et doit être déterminée empiriquement. L&#39;injection d&#39;ADN trop peut conduire à des embryons malsaine avec la mort cellulaire étendue, tandis que trop peu se traduira par une très faible proportion des embryons injectés exprimant le transgène. Le niveau d&#39;expression d&#39;ADN est corrélée avec la force du signal fluorophore, qui varie de cellule à cellule. Alors que le tri des embryons en ép...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5040-250G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen Inc.</td>
<td>12243</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15517-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker Instrumentation, General Valve Division</td>
<td>051-0302-900</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos

Le poisson zèbre est un modèle idéal pour les comportements d&#39;imagerie cellulaire pendant le développement in vivo. Embryons de poisson zèbre sont fécondés à l&#39;extérieur et donc facilement accessible à toutes les étapes de développement. En outre, leur clarté optique permet d&#39;imagerie à haute résolution de la cellule et de la dynamique moléculaire dans le milieu naturel de l&#39;embryon intact. Nous utilisons une approche d&#39;imagerie en direct à analyser les comportements lors de la migration des cellules de crête neurale de cellules et de l&#39;excroissance et l&#39;orientation des axones neuronaux. Imagerie Live est particulièrement utile pour comprendre les mécanismes qui régulent les processus motilité cellulaire. Pour visualiser les détails de la motilité cellulaire, comme l&#39;activité de propulsion et de dynamique moléculaire, il est avantageux de marquer des cellules individuelles. Dans le poisson zèbre, l&#39;injection d&#39;ADN plasmidique donne une mosaïque d&#39;expression transitoire et offre des avantages distincts par rapport aux autres méthodes de marquage des cellules. Par exemple, des lignées transgéniques qualifient souvent les populations de cellules entières et peuvent donc occulter la visualisation des saillies fines (ou des changements dans la distribution moléculaire) dans une seule cellule. En outre, l&#39;injection de l&#39;ADN au stade d&#39;une cellule est moins invasive et plus précise que les injections de teinture à des stades ultérieurs. Nous décrivons ici une méthode pour l&#39;étiquetage individuel des neurones en développement ou les cellules de la crête neurale et l&#39;imagerie par leur comportement in vivo. Nous injectons ADN plasmidique dans une cellule embryons au stade, qui se traduit par l&#39;expression du transgène mosaïque. Les vecteurs contiennent des cellules de promoteurs spécifiques de cette expression d&#39;entraînement d&#39;un gène d&#39;intérêt dans un sous-ensemble de neurones sensoriels ou des cellules de la crête neurale. Nous fournissons des exemples de cellules marquées à la GFP membrane cible ou avec une sonde biocapteur qui permet la visualisation de la F-actine dans les cellules vivantes 1. Erica Andersen, Namrata Asuri, et Matthew Clay ont contribué également à ce travail.

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Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Ce protocole décrit l&#39;imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

live-imaging-cell-motility-actin-cytoskeleton-individual-neurons

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K vues.  University of Wisconsin-Madison. Ce protocole décrit l'imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Vidéo: Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Souris épidermique Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Recherche

Biologie

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Imagerie de cellules vivantes de la F-actine fluorescente Dynamics via chatoiement de microscopie (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

La transplantation de blastomères exprimant la GFP pour l&#39;imagerie en direct sur le développement de la rétine et du cerveau dans les embryons de poissons zèbres chimériques

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Imagerie des cellules vivantes et de l&#39;analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial cells regulate permeability of the endothelium, and many studies have indicated the important contribution of the actin cytoskeleton to determining junctional integrity1-5. A cortical actin belt is thought to be important for the maintenance of stable junctions1, 2, 4, 5. In contrast, actin stress fibers are thought to generate centripetal tension within endothelial cells that weakens junctions2-5. Much of this theory has been based on studies in which endothelial cells are treated with inflammatory mediators known to increase endothelial permeability, and then fixing the cells and labeling F-actin for microscopic observation. However, these studies provide a very limited understanding of the role of the actin cytoskeleton because images of fixed cells provide only snapshots in time with no information about the dynamics of actin structures5. 
Live-cell imaging allows incorporation of the dynamic nature of the actin cytoskeleton into the studies of the mechanisms determining endothelial barrier integrity. A major advantage of this method is that the impact of various inflammatory stimuli on actin structures in endothelial cells can be assessed in the same set of living cells before and after treatment, removing potential bias that may occur when observing fixed specimens. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are transfected with a GFP-&beta;-actin plasmid and grown to confluence on glass coverslips. Time-lapse images of GFP-actin in confluent HUVEC are captured before and after the addition of inflammatory mediators that elicit time-dependent changes in endothelial barrier integrity. These studies enable visual observation of the fluid sequence of changes in the actin cytoskeleton that contribute to endothelial barrier disruption and restoration. 
Our results consistently show local, actin-rich lamellipodia formation and turnover in endothelial cells. The formation and movement of actin stress fibers can also be observed. An analysis of the frequency of formation and turnover of the local lamellipodia, before and after treatment with inflammatory stimuli can be documented by kymograph analyses. These studies provide important information on the dynamic nature of the actin cytoskeleton in endothelial cells that can used to discover previously unidentified molecular mechanisms important for the maintenance of endothelial barrier integrity.

Microscopic imaging of live endothelial cells expressing GFP-actin allows characterization of dynamic changes in cytoskeletal structures. Unlike techniques that use fixed specimens, this method provides a detailed assessment of temporal changes in the actin cytoskeleton in the same cells before, during, and after various physical, pharmacological, or inflammatory stimuli.

Étude du cytosquelette d&#39;actine dans les cellules endothéliales en direct exprimant la GFP-actine

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D imagerie de l&#39;agrégation des protéines dans les cellules vivantes

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...