Nous sommes très reconnaissants à Anders Bovin qui a fourni la musique de notre film et à Michael Stocks Elliot volontaire pour être la voix haut-parleur. Un soutien a été fourni par Carl Trygger Fondation, le programme de recherche stratégique agricole génomique fonctionnelle (AgriFunGen) à l&#39;Université suédoise des sciences agricoles, le Conseil suédois de la recherche (VR), et le Conseil suédois de la recherche pour l&#39;environnement, les sciences agricoles et l&#39;aménagement du territoire (FORMAS ).

<ol>
	<li>Carr, S. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+homeotic+gene+expression+defines+developmental+arrest+stages+in+Brassica+oleracea+L.+vars.+botrytis+and+italica.">Floral homeotic gene expression defines developmental arrest stages in Brassica oleracea L. vars. botrytis and italica.</a> Planta. 201 (2), 179-188 (1997).</li><li>Coen, E. S., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+war+of+the+whorls:+genetic+interactions+controlling+flower+development.">The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development.</a> Nature. 353 (6339), 31-37 (1991).</li><li>Jackson, D., Gurr, S. J., McPherson, M. J., Bowles, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+in+plants.">In situ hybridization in plants.</a> Molecular Plant Patology: a practical approach. , (1991).</li><li>Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D., Leitch, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: a practical guide. , (1994).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li><li>Azevedo, H., Lino-Neto, T., Tavares, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+high-quality+RNA+isolation+from+needles+of+adult+maritime+pine+trees.">An improved method for high-quality RNA isolation from needles of adult maritime pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. , 333-338 (2003).</li><li>Sundstrom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+genes+active+in+developing+pollen+cones+of+Norway+spruce+(Picea+abies)+are+homologous+to+the+B-class+floral+homeotic+genes+in+angiosperms.">MADS-box genes active in developing pollen cones of Norway spruce (Picea abies) are homologous to the B-class floral homeotic genes in angiosperms.</a> Dev Genet. 25 (3), 253-266 (1999).</li><li>Tandre, K., Svenson, M., Svensson, M. E., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+gene+structure+and+activity+in+the+regulation+of+reproductive+organ+development+of+conifers+and+angiosperms.">Conservation of gene structure and activity in the regulation of reproductive organ development of conifers and angiosperms.</a> Plant J. 15 (5), 615-623 (1998).</li><li>Winter, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+genes+reveal+that+gnetophytes+are+more+closely+related+to+conifers+than+to+flowering+plants.">MADS-box genes reveal that gnetophytes are more closely related to conifers than to flowering plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (13), 7342-7347 (1999).</li><li>Savard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+and+nuclear+gene+sequences+indicate+late+Pennsylvanian+time+for+the+last+common+ancestor+of+extant+seed+plants.">Chloroplast and nuclear gene sequences indicate late Pennsylvanian time for the last common ancestor of extant seed plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (11), 5163-5167 (1994).</li><li>Jack, T., Brockman, L. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeotic+gene+APETALA3+of+Arabidopsis+thaliana+encodes+a+MADS+box+and+is+expressed+in+petals+and+stamens.">The homeotic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens.</a> Cell. 68 (4), 683-697 (1992).</li><li>Bowman, J. L., Smyth, D. R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+directing+flower+development+in+Arabidopsis.">Genes directing flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 1 (1), 37-52 (1989).</li><li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development.">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399 (6732), 144-148 (1999).</li><li>Sundstrom, J., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conifer+reproductive+development+involves+B-type+MADS-box+genes+with+distinct+and+different+activities+in+male+organ+primordia.">Conifer reproductive development involves B-type MADS-box genes with distinct and different activities in male organ primordia.</a> Plant J. 31 (2), 161-169 (2002).</li><li>Carlsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+altered+expression+of+a+large+number+of+nuclear+genes+in+developing+cytoplasmic+male+sterile+Brassica+napus+flowers.">Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers.</a> Plant J. 49 (3), 452-462 (2007).</li><li>Teixeira, R. T., Farbos, I., Glimelius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+levels+of+meristem+identity+and+homeotic+genes+are+modified+by+nuclear-mitochondrial+interactions+in+alloplasmic+male-sterile+lines+of+Brassica+napus.">Expression levels of meristem identity and homeotic genes are modified by nuclear-mitochondrial interactions in alloplasmic male-sterile lines of Brassica napus.</a> Plant J. 42 (5), 731-742 (2005).</li><li>Ying, S., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+technique+of+in+situ+hybridization.">The technique of in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Medicine. 56, 263-283 (2001).</li></ol>

Deux aspects de la P. abies protocole ont été optimisés par rapport à la A. thaliana / B. napus protocole, le traitement et la RNase protéinase K concentration. La RNase supprime signaux de fond et augmente ainsi la spécificité de 17 signaux. Le traitement protéinase K est nécessaire pour perméabiliser les tissus afin de la sonde peut entrer et s&#39;hybrident à la piscine d&#39;ARN d&#39;intérêt. La sonde antisens DAL13 a donné un signal plus élevé, sans RNase-traitement (Fig. 3C, E, G) par rapport aux articles traités à la RNase pendant 30 min (figure 2D, F et H). Depuis le RNase-traitement n&#39;améliore pas le signal qu&#39;il a été retiré du protocole. Le traitement protéinase K ont été testés à trois concentrations différentes; 1, 3 et 5 pg / ml. Dans le cas de P. abies un signal faible ou nul a été observé en utilisant 1 ug / ml de protéinase K (Fig. 3C-D). Un signal fort a été obtenue à la fois avec 3 pg / ml (Fig. 3E-F) et 5 pg / ml (Fig. 3G-H) protéinase K. Comme aucune différence apparente dans la force du signal a été trouvé lors de l&#39;utilisation 5 ug / ml de protéinase K comparativement à 3 pg / ml, nous avons choisi d&#39;utiliser 3 pg / ml dans notre protocole. Il est probable que la nécessité d&#39;une concentration plus élevée de protéinase K à la p. abies cônes mâles par rapport aux A. thaliana et B. bourgeons floraux napus est due à des tissus plus compacte avec des niveaux plus élevés de composés phénoliques et des polysaccharides. Lors de la fixation et l&#39;inclusion des différences entre les A. thaliana / B. napus protocole et le P. abies protocole sont évidents. Le tissu d&#39;intérêt est fixé à assurer la rétention de l&#39;ARN et cela est une étape critique puisque les matériaux mal fixés pourrait donner un signal faible ou indétectable, même si l&#39;ARNm est très abondante. Le tissu est déshydraté, effacé et intégrés dans de la cire dans les changements graduels pour éviter d&#39;endommager les tissus et, dans certains protocoles de NaCl 0,85% est ajouté à l&#39;éthanol dans la déshydratation de continuer à éviter le rétrécissement et le gonflement des 3 cellules. L&#39;étape de déshydratation pendant l&#39;enrobage peut être effectué sur la glace pour maintenir l&#39;activité RNase au minimum. Dans le P. abies protocole de la solution de paraformaldéhyde 4% correctif contient glutaraldéhyde 0,25%, ce qui est censé donner une meilleure rétention d&#39;ARN 17, même si certains prétendent que c&#39;est sans doute ne font aucune différence 3. Après sectionnement de la matière est fixée sur des lames et prétraités (c&#39;est à dire déparaffinées, réhydratées, perméabilisées, traitée pour réduire la liaison non spécifique de la sonde et enfin déshydratés) avant l&#39;hybridation. Dans le protocole présenté ici toute la procédure de détection peut être effectuée dans les laboratoires ordinaires, le signal se développe habituellement dans les 1-3 jours et le ratio entre le signal sur fond peuvent être surveillés en permanence. Le DIG sondes marquées donnent généralement un signal plus distinctes par rapport aux sondes marquées radioactives, sont plus stables et peuvent être réutilisés dans des expériences consécutives. D&#39;autre part, la sensibilité est réduite par rapport aux sondes radioactives 17. L&#39;hybridation in situ détecte l&#39;expression en utilisant une sonde marquée spécifique pour un ARNm donné. Radio-étiquetage est une méthode de marquage robuste et sensible, mais elle nécessite la manipulation de la radioactivité et il faut plusieurs semaines avant que les résultats peuvent être détectés. Antigène sondes marquées d&#39;autre part, sont plus stables, moins dangereux et nécessitent une exposition au milieu de détection de quelques jours seulement 17. Ainsi, l&#39;antigène étiquetage méthodes sont actuellement dominant. L&#39;étape la plus critique indépendamment du protocole est la conception de la sonde. Des précautions doivent être prises pour s&#39;assurer que la sonde a une haute spécificité et est étiqueté avec des PDU de haute qualité. Parfois, l&#39;hybridation de température et / ou la longueur de réaction doivent être ajustées pour des sondes spécifiques. Notre protocole modifié en fonction des DIG sondes marquées facilitera la localisation de l&#39;expression des ARNm simultanément en espèces allant de A. thaliana à P. abies, et devraient avec des ajustements mineurs soit utilisable dans d&#39;autres espèces végétales. Le protocole a, à côté des cônes mâles, également été testé sur différentes étapes de pousses végétatives et dans des embryons zygotiques et somatiques de P. fois abies avec de bons résultats (résultats non publiés;. Karlgren et al.)

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetic anhydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A6404-200ml</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Acrylamide, linear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-DIG-antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blocking reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11 175 041 910 or 11 096 176 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7030-50g</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Deionized formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Denhardts solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D2532-5ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC, diethylpyrocarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11175025910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde (25%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9510G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histoclear II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.</td>
</tr>
<tr>
<td>Histowax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histowax or Paraplast can be used for embedding.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148-500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraplast plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P3683-1kg</td>
<td>Histowax or Paraplast can be used for embedding.</td>
</tr>
<tr>
<td>Phusion&#x2122; High-Fidility DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Finnzymes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Probe-on Plus slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>22-230-900</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2308-5mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R5503-100mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue-clear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sakura Finetek Europ&#233; BV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triethanolamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1377-100ml</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>use your standard product in the lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.</td>
</tr>
<tr>
<td>tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>83853-100mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>use your standard product in the lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.</td>
</tr>
<tr>
<td>Western Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

non-radioactive in situ hybridization protocol applicable for norway spruce and a range of plant species

Les technologies à haut débit d&#39;analyse d&#39;expression aujourd&#39;hui disponibles donnent aux scientifiques un débordement de profils d&#39;expression, mais leur résolution en termes d&#39;expression tissu spécifique est limitée à cause de problèmes dans la dissection des tissus individuels. Données d&#39;expression doit être confirmée et complétée par des profils d&#39;expression en utilisant par exemple l&#39;hybridation in situ, une technique utilisée pour localiser les cellules l&#39;expression des ARNm spécifiques. L&#39;hybridation in situ dans la méthode est laborieuse, chronophage et nécessite souvent l&#39;optimisation étendu selon les espèces et les tissus. Dans les expériences in situ sont relativement plus difficiles à réaliser dans les espèces ligneuses telles que l&#39;épinette de conifères Norvège (Picea abies). Nous présentons ici une DIG modifié protocole d&#39;hybridation in situ, ce qui est rapide et applicable sur une large gamme d&#39;espèces de plantes dont P. abies. Avec quelques ajustements, notamment modifié la RNase traitement et la protéinase K de concentration, on peut utiliser le protocole pour étudier l&#39;expression tissu-spécifique des gènes homologues dans les organes reproducteurs mâles d&#39;une gymnosperme et deux espèces d&#39;angiospermes; P. abies, Arabidopsis thaliana et de Brassica napus. Le protocole a travaillé aussi bien pour les espèces et les gènes étudiés. AtAP3 et BnAP3 ont été observées dans les deuxième et troisième verticille organes floraux en A. thaliana et B. napus et DAL13 de microsporophylls des cônes mâles de P. abies. Pour P. abies la concentration protéinase K, utilisé pour permeablize les tissus, a dû être augmenté à 3 g / ml au lieu de 1 g / ml, probablement due à des tissus plus compacts et des niveaux élevés de composés phénoliques et des polysaccharides. Pour toutes les espèces du traitement RNase a été retirée en raison de la force du signal réduit sans une augmentation correspondante de la spécificité. En comparant les modèles de tissu expression spécifique des gènes homologues à partir de plantes fleuries à la fois et d&#39;un conifère, nous démontrons que la DIG dans le protocole in situ présentées ici, avec seulement des ajustements minute, peut être appliquée à un large éventail d&#39;espèces végétales. Ainsi, le protocole évite à la fois l&#39;optimisation des espèces étendues spécifiques et l&#39;utilisation de sondes laborieuses radiomarqué en faveur des sondes étiquetées DIG. Nous avons choisi d&#39;illustrer les étapes techniquement exigeante du protocole dans notre film. Anna Karlgren et Jenny Carlsson ont contribué également à cette étude. Correspondant auteurs: Anna Karlgren au Anna.Karlgren @ ebc.uu.se et Jens Sundström F. Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

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Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

Nous décrivons une DIG modifiés<em&gt; In situ</emProtocole d&#39;hybridation&gt;, qui est rapide et applicable sur une large gamme d&#39;espèces de plantes, y compris l&#39;épinette de Norvège. Avec quelques ajustements, notamment modifié la RNase traitement et la protéinase K concentration, le protocole peut être utilisé dans les études sur les différents tissus et espèces.

Non radioactifs In situ</emProtocole d&#39;hybridation> Applicable pour l&#39;épinette de Norvège et d&#39;un éventail d&#39;espèces végétales

The high-throughput expression analysis technologies available today give scientists an overflow of expression profiles but their resolution in terms of ...

non-radioactive-situ-hybridization-protocol-applicable-for-norway

Research

JoVE Journal

Biology

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

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Non radioactifs In situ Applicable pour l'épinette de Norvège et d'un éventail d'espèces végétales