Notre protocole in situ est significatif parce qu’il fournit un moyen simple de visualiser les modèles d’expression des gènes avec un minimum de taches de fond. Cette technique rend un protocole compliqué et long relativement facile à exécuter. Benchtop a mis en place des suggestions et des listes de contrôle fournies rendre ce protocole encore plus facile à exécuter correctement et à reproduire.
Bien que les techniques présentées ici soient spécifiques à Astyanax mexicanus, elles pourraient probablement être adaptées à d’autres systèmes d’individus de taille comparable avec de petits ajustements au protocole. Tout d’abord, utilisez du ruban de laboratoire coloré pour désigner des flacons et des pipettes pour chaque gène. À l’aide d’une pipette Pasteur, trier les embryons.
Il n’y a généralement pas plus de 12 embryons par flacon, une fois triés. Ensuite, réglez un bain d’eau secouant à 70 degrés Celsius. Dessinez soigneusement le méthanol dans les flacons d’embryons triés et remplacez-le par 500 microlitres de méthanol frais à 100 %.
Lavez brièvement les embryons pendant environ une minute sur un shaker de plate-forme. Après cela, réhydrater les embryons dans une concentration croissante de 1x PBS avec Tween 20 sur un shaker plate-forme tel que décrit dans le protocole de texte. Pour commencer, placez un petit joint avec un fond en maille dans le bain d’eau rotatif qui a été préchauffé à 70 degrés Celsius.
Placez des aliquots de tampon d’hybridation moins et tampon d’hybridation plus dans le joint. Ajouter délicatement une solution pk préparée aux flacons d’embryons en veillant à ce que tous les tissus soient complètement recouverts de solution. Transférer les flacons dans un shaker de plate-forme et les laisser digérer dans la solution de travail proteinase K pendant environ 12 minutes.
Après cela, retirez doucement la solution PK et inondez brièvement le flacon avec PBT pour diluer le PK restant. Remplacez la solution PBT par 500 microlitres de PBT frais et laissez la solution rincer sur le shaker de la plate-forme pendant cinq minutes. Remplacez ensuite la solution PBT par 500 microlitres de 4% PFA décongelés. Laissez les embryons couver sur le shaker de plate-forme à température ambiante pendant 20 minutes.
Pour commencer la pré-hybridation, ajoutez 500 microlitres de tampon d’hybridation préchauré moins la solution aux flacons contenant de l’embryon. Placez soigneusement les flacons dans le joint dans le bain d’eau à 70 degrés Celsius sans trembler pendant cinq minutes. Ensuite, sortez du tampon d’hybridation moins la solution et inondez les flacons avec 500 microlitres de tampon d’hybridation préchauré plus la solution.
Remettre les flacons dans le joint dans le bain d’eau et incuber en secouant pendant quatre heures ou toute la nuit. Pour commencer l’hybridation, tirez le tampon d’hybridation plus des flacons et remplacez-le par 500 microlitres de tampon d’hybridation préchaurmé frais plus. Ajouter soigneusement deux microlitres de sonde d’ARN à chaque flacon et tourbillonner doucement pour assurer une distribution uniforme de la sonde.
Incuber dans le bain d’eau à 70 degrés Celsius pendant la nuit tout en secouant à 40 RPM. Pour commencer, préparez des tubes de microcentrifugeuse étiquetés tampon d’hybridation plus avec le gène d’intérêt sonde ARN tel que décrit dans le protocole de texte. Ensemble de deux tubes coniques de 15 millilitres et ajouter 0,2 grammes de réaccente de blocage et 10 millilitres de MABT.
Placer les deux tubes sur un mélangeur à noix jusqu’à ce que le reagent soit complètement dissous dans la solution. À l’aide d’une pipette pasteur en verre, puisez le tampon d’hybridation et sondez la solution et placez-la dans un tube stérile de microcentrifugeuse étiqueté. Conservez ce tube dans le congélateur à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation future.
Ajouter délicatement 500 microlitres du citrate de sodium salin chaud et du tampon d’hybridation moins les dilutions. Incuber dans des solutions séquentielles pendant 10 minutes chacune dans le bain d’eau secouant, puis à température ambiante sur un shaker plate-forme tel que décrit dans le protocole texte. Après la dernière incubation, remplacer le 100% PBT de chaque flacon par 500 microlitres de MABT.
Répétez ce processus deux fois pendant cinq minutes chacun. Tout d’abord, retirez le MABT de chaque flacon et inondez-le d’une solution de blocage préméxée de l’un des tubes coniques de 15 millilitres. Déposer les deux flacons sur le mélangeur à noix pendant quatre heures à température ambiante.
Ajouter deux microlitres des fragments d’anticorps au deuxième tube de la solution de blocage préparée et brièvement vortex. Remplissez ensuite chaque flacon presque complètement avec la solution de blocage et placez-les sur un mélangeur de noix pendant la nuit dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Pour commencer, préparez un flacon d’actions de 10% NGS dans MABT.
Remplacez la solution de blocage dans chaque flacon par 500 microlitres de cette solution NGS. Incuber à température ambiante sur le shaker de la plate-forme pendant 25 minutes. Après cela, remplacer le mélange NGS par 500 microlitres de 100%MABT.
Incuber sur le shaker de plate-forme à température ambiante pendant 30 minutes. Répétez ce rinçage 11 fois de plus tout au long de la journée, toutes les 30 minutes. Remplissez ensuite chaque flacon de 100% MABT et placez-les sur un mélangeur à noix toute la nuit dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius.
Tout d’abord, remplacez le MABT dans chaque flacon par un millilitre de tampon AP et laissez-le laver pendant cinq minutes. Répétez ce lavage deux fois pour enlever complètement le MABT. Remplacez ensuite le tampon AP par un millilitre de tampon AP frais contenant 3,5 microlitres de BCIP et 4,5 microlitres de MBT.
Remplacez-le par un nouveau mélange de tampon AP contenant le BCIP et le MBT toutes les heures jusqu’à ce que la réaction soit terminée, en vous assurant de surveiller la réaction de près et de vérifier toutes les 15 minutes jusqu’à ce que le niveau désiré de coloration ait été atteint. Arrêtez la réaction de coloration en rinçant les embryons dans une concentration croissante de 1X PBT dans le tampon AP tel que décrit dans le protocole. Rincer les embryons en environ cinq millilitres de 100% PBT sur un mélangeur à noix jusqu’à ce que la coloration minimale désirée soit atteinte.
Lorsque le rinçage est terminé, lavez les embryons en 500 microlitres de PBS stérile sur un shaker plate-forme et postfixez les spécimens tels que décrits dans le protocole de texte. Après le rinçage des embryons, placez-les en quatre millilitres de PBS 100% stérile et, si nécessaire, stockez-les à long terme à quatre degrés Celsius. Dans cette étude, les spécimens embryonnaires d’Astyanax sont étiquetés pour une analyse d’expression génétique de haute qualité.
Ce processus a été mis en œuvre avec succès dans les embryons de poissons des cavernes pachon et de surface. Les embryons cavefish étiquetés pour l’expression Sox9 démontrent une étiquetage clair dans les arches branchiales en développement et la nageoire pectorale. Notez que la coloration est pratiquement absente dans le sac jaune ou les somites en développement sur le flanc.
De même, l’expression tfap2a est évidente dans les parties de la tête en développement comme cellules de crête neuronale de migration précoce le long de la région dorsale de flanc de l’embryon. Le troisième gène présenté pour les embryons de poissons des cavernes, Phf20a, est observé dans les parties du mésoderm somatique et de la tête postérieure qui sont destinées à donner naissance à des tissus osseux. Les embryons de poissons de surface étiquetés pour le CXCR présentent un étiquetage positif dans les régions isolées de la tête et du flanc, ainsi que dans quelques cellules individuelles qui survolent le sac jaune.
Le gène Adcyap1a est exprimé dans les régions du système nerveux central, y compris les cellules pituitaires. Notez l’expression très spécifique dans les grappes bilatérales jumelées de cellules sur l’aspect dorsale de l’embryon, ainsi qu’une plus grande région d’expression médiane. Le dernier gène examiné pour les embryons de poissons des cavernes, Sox10, est évident comme un marqueur précoce de la crête neurale sur les côtés gauche et droit de l’embryon dorsal.
Après avoir terminé in situ, nous entons généralement nos résultats à l’aide d’une microscopie légère. Il est préférable de le faire dans les deux semaines suivant l’achèvement afin d’éviter la dégradation des taches.
