La recherche dans le laboratoire Ghanim a été financée par la subvention de recherche no. 908-42.12/2006 de la Fondation germano-israélienne (GIF), accordent pas. IS-4062-07 du-Unis Israël Royaume-Fonds binational de recherche agricole et le développement (BARD), et subvention de recherche no. 884/07 de la Fondation israélienne des sciences (ISF) à MG

Une. Préparatifs général aleurodes, des plantes, et Virus pour l&#39;analyse FISH <ol><li> B arrière et Q biotype aleurodes sur les plants de coton (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) et maintenir dans des cages insect-proof et chambres de croissance dans des conditions standard de 25 ± 2 ° C, 60% d&#39;humidité relative, et une lumière de 14 h / 10 h photopériode sombre. </li><li> Faire la PCR pour tester l&#39;infection par endosymbiontes en utilisant des amorces spécifiques endosymbiont comme décrit précédemment 15-19. </li><li> Acheter des plants de tomate (Solanum esculentum cv. Beefsteak) à partir d&#39;une pépinière commerciale ou végétales graines de tomates. </li><li> Maintenir dans les mêmes conditions d&#39;élevage décrites ci-dessus jusqu&#39;à ce que les plantes atteignent le stade quatre feuilles vraies, l&#39;âge le plus approprié pour l&#39;inoculation d&#39;aleurodes médiation du TYLCV 15 (voir la section 4.1 ci-dessous). </li></ol> 2. Manipulation des insectes, Fixation, sonde conception, hybridation, et visualisation pour Endosymbiote FISH <ol><li> Recueillir 10 aleurodes par aspiration de plants de coton, ou prendre 10 3 e ou 4 e nymphes âgées à partir de feuilles de coton. </li><li> Plonger immédiatement dans le fixateur de Carnoy (acide chloroforme-éthanol-acétique glacial, 06:03:01, v / v) à l&#39;intérieur des tubes Eppendorf. Fixer pendant 2 heures à une nuit (de préférence la nuit). </li><li> Supprimer complètement le fixateur et décolorer dans 6% H 2 O 2 dans l&#39;éthanol pendant 2 heures. </li><li> Préserver les échantillons dans de l&#39;éthanol absolu pendant plusieurs jours à plusieurs semaines à la température ambiante, ou passer à l&#39;étape suivante. </li><li> Conception des sondes amorces d&#39;ADN inverse comme complémentaires basées sur les ribosomique 16S gènes d&#39;ARN de chaque bactérie. Pour la conception des sondes, prendre en compte les mêmes considérations pour la conception des amorces de PCR. Utiliser les sondes oligonucléotidiques BTP1 5&#39;-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 &#39;, 5&#39;-Cy3 Rb1-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3&#39;, 5&#39;-Cy3 BTH-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 &#39;et 5&#39;-ARS2 Cy3TCATGACCACAACCTCCAAA-3 &#39;pour le ciblage spécifique de Portiera, Rickettsia, Hamilonella, et Arsenophonus, respectivement. </li><li> Hybrider les échantillons pendant une nuit dans l&#39;obscurité dans un tampon d&#39;hybridation (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,9 M de NaCl, 0,01% [p / v] de sodium dodécyl sulfate, 30% de formamide de [vol / vol]) contenant 10 pmol sonde fluorescente par ml . Combiner plus d&#39;une sonde avec différents colorants fluorescents, si nécessaire. Utiliser les aleurodes non infectées par la bactérie ciblée et des échantillons non-sonde de témoins négatifs. </li><li> Montez les échantillons ensemble, sur une lame de microscope, dans le tampon d&#39;hybridation contenue avec un bloqueur liquide, couvrir avec une lamelle, sceller avec du vernis à ongles, et vue sous une fluorescence ou microscope confocal. </li></ol> 3. Aleurode organes Dissection, Fixation, hybridation, et visualisation pour TYLCV FISH <ol><li> Recueillir aleurodes adultes élevés en permanence sur des plants de tomates TYLCV-infectés par aspiration et anesthetize par l&#39;exposition à la serviette en papier imprégné d&#39;acétone. Exposer les aleurodes seulement pendant 1-2 min trop longue exposition à l&#39;acétone peut fixer les tissus de aleurodes. Utilisez les aleurodes nonviruliferous élevés sur des plants de tomates non infectées et aucun échantillon de la sonde pour les contrôles de confirmer l&#39;hybridation spécifique. </li><li> Aleurodes montage sur la dépression des lames de microscope de dissection des organes à l&#39;aide d&#39;un microscope stéréo. </li><li> Arracher la tête d&#39;insecte du prothorax et disséquer les glandes salivaires en 1x PBS additionné de 1% toluidine bleue pour une meilleure visualisation, en raison de leur petite taille. Permettre l&#39;absorption de la tache pendant 2-3 min. </li><li> Tirez l&#39;insecte part à la jonction entre le thorax et l&#39;abdomen d&#39;observer et d&#39;expulser hors de l&#39;intestin moyen. Expulser le contenu de l&#39;abdomen en poussant avec une pince sur le bout de l&#39;abdomen. </li><li> Retirez délicatement le PBS et le bleu de toluidine de dissections succès et ajouter délicatement 300 pi de fixateur de Carnoy pour fixer les organes pendant 5 min. </li><li> Add le fixateur d&#39;un côté du puits et non déprimée par le haut pour empêcher un mouvement non contrôlé des organes disséqués. Une fois de toucher le fixateur, les organes adhèrent au verre, et dans le processus, ils ne bougeront pas. </li><li> Retirer fixateur et ajouter 500 ul de tampon d&#39;hybridation supplémenté avec 10 pmol de la sonde d&#39;ADN fluorescent Cy5-5&#39;-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 &#39;, qui est complémentaire d&#39;une séquence dans le gène de protéine d&#39;enveloppe du TYLCV. </li><li> Hybrider une nuit à température ambiante dans l&#39;obscurité par la lame à incuber avec l&#39;échantillon à l&#39;intérieur d&#39;une petite chambre humide composée de petite boîte en plastique avec du papier de serviette humide au fond. </li><li> Après l&#39;hybridation, ramasser les organes d&#39;un outil de dissection fine et rapidement les déplacer sur une lame de microscope frais contenant 30 pi de nouveau tampon d&#39;hybridation supplémenté avec DAPI (0,1 mg / ml dans PBS 1x) et contenus avec bloqueur liquide. </li><li> Couvrir les échantillons avec une lamelle, sceller l&#39;esprith vernis à ongles et vue sous une fluorescence ou microscope confocal. </li></ol> 4. Manipulation de l&#39;usine, la main sectionnement, fixation, et l&#39;hybridation pour TYLCV FISH <ol><li> Inoculer des plants de tomates avec l&#39;aide de TYLCV virulifères inoculation d&#39;aleurodes médiation. Le virus peut être détecté en utilisant cette méthode FISH dans les plantes asymptomatiques d&#39;une semaine après l&#39;inoculation. Symptômes typiques de la maladie sont visibles trois semaines après l&#39;inoculation. Utilisez des plants de tomates non infectées et aucun échantillon de la sonde pour les contrôles de confirmer l&#39;hybridation spécifique. </li><li> Utilisez une lame de rasoir histologique forte pour la préparation de longues sections 2-4 cm coupé à la main longitudinales ou transversales de tomate tiges et les feuilles. </li><li> Dans des tubes Eppendorf, fixer les sections de fixateur de Carnoy pendant 2 heures à une nuit à température ambiante. </li><li> Retirer fixateur et préserver les sections dans l&#39;éthanol absolu pour plusieurs jours à plusieurs semaines à la température ambiante, ou passer à l&#39;étape suivante. </li><li> Laver les sectionstrois fois, 1 minute chaque fois, dans du tampon d&#39;hybridation. </li><li> Hybrider les sections avec 500 ul de tampon d&#39;hybridation supplémenté avec 10 pmol de la sonde oligonucléotidique fluorescente Cy3-5&#39;-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 &#39;qui est complémentaire d&#39;une séquence dans le gène de protéine d&#39;enveloppe du TYLCV. </li><li> Laver les sections trois fois, 1 min chacune, dans un tampon d&#39;hybridation. </li><li> Sections de montage entières dans le tampon d&#39;hybridation supplémenté avec DAPI (0,1 mg / ml dans PBS 1x) et contenus avec bloqueur liquide, couvrir avec une lamelle, sceller avec du vernis à ongles et vue sous une fluorescence ou microscope confocal. </li></ol>

<ol>
	<li>Czosnek, H., Laterrot, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+worldwide+survey+of+Tomato+yellow+leaf+curl+viruses.">A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses.</a> Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).</li><li>Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+Tomato+Yellow+Leaf+Curl+Virus+in+South+Carolina.">First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina.</a> Plant Dis. 90, 379 (2006).</li><li>Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+Florida+and+implications+for+the+spread+of+this+and+other+geminiviruses+of+tomato.">Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato.</a> Plant Dis. 83, 984-988 (1999).</li><li>Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+North+Carolina.">Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina.</a> Plant Dis. 86, 73 (2002).</li><li>Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phylogeographical+analysis+of+the+Bemisia+tabaci+species+complex+based+on+mitochondrial+DNA+markers.">A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers.</a> Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).</li><li>Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+translocation+in+the+circulative+transmission+pathway+of+its+vector,+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Phytopathology. 91, 188-196 (2001).</li><li>Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestive++salivary+and+reproductive+organs+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+Hemiptera:+Aleyrodidae)+B+type.">Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type.</a> J. Morphol. 248, 22-40 (2001).</li><li>Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+geminiviruses+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci+(Homoptera:+Aleyrodidae).">Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae).</a> Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).</li><li>Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pathway+of+geminivirus+in+whitefly+extracts,+saliva,+hemolymph+and+honeydew.">Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew.</a> Phytopathology. 89, 239-246 (1999).</li><li>Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circulative+pathway+of+begomoviruses+in+the+whitefly+vector+Bemisia+tabaci&#8212;insights+from+studies+with+Tomato+yellow+leaf+curl+virus.">The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci&#8212;insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus.</a> Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).</li><li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virusby+the+whitefly+Bemisiatabaciis+correlated+with+the+presence+of+aspecificsymbiotic+bacterium+species.">The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species.</a> J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).</li><li>Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transovarial+transmission+of+Rickettsia+spp.+and+organ-specific+infection+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).</li><li>Ghanim, M., Medina, V., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. , 175-187 (2007).</li><li>Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+rapid+and+inexpensive+method+for+localization+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+and+Potato+leafroll+virus+in+plant+and+insect+vectors.">A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors.</a> J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).</li><li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions.">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).</li><li>Nirgianaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).</li><li>Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+bacteriocyte-associated+endosymbionts+of+plant+sap-sucking+insects.">Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects.</a> Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).</li><li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+localization+of+a+Rickettsia+sp.+in+Bemisia+tabaci+(Homoptera)+Aleyrodidae).">Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae).</a> App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).</li><li>Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Wolbachia+infection+in+Bemisia+tabaci.">Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci.</a> Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).</li><li>Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+localization+of+bacterial+symbionts+in+three+whitefly+species+(Hemiptera:+Aleyrodidae)+from+the+east+coast+of+the+Adriatic.">Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic.</a> Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Le protocole décrit ici pour la localisation d&#39;un virus de plante dans son hôte de plante et l&#39;insecte vecteur, et les bactéries symbiotiques dans leur hôte de la mouche blanche spécifique, peut être adapté pour la localisation d&#39;autres virus dans les plantes et, même dans les tissus animaux. En outre, le protocole peut être utilisé pour localiser les bactéries symbiotiques et pathogènes et d&#39;autres microorganismes dans les systèmes de plantes et d&#39;animaux. Les méthodes décrites repose...

Lors de l&#39;étude des interactions entre les virus de plantes et d&#39;autres agents pathogènes avec leurs hôtes végétaux infectés, il est important de visualiser les agents pathogènes et leurs acides nucléiques respectifs in situ, indépendamment du fait qu&#39;ils ont des effets négatifs sur leurs hôtes. Ceci est très important lorsque l&#39;on étudie le mouvement de l&#39;agent pathogène à l&#39;intérieur et entre les cellules de la plante. En localisation in situ de produits du gène de l&#39;agent pathogène est une étape essentielle qui s&#39;ajoute à d&#39;autres approches pour l&#39;étude du processus de pathogénicité. De nombreux agents pathogènes des plantes, en particulier les virus, sont transmis par les insectes, comprenant des interactions complexes et intimes avec leurs vecteurs. La localisation de ces virus dans leurs vecteurs est important pour l&#39;étude de la voie de transmission, et les sites possibles d&#39;interaction à l&#39;intérieur du vecteur. La transmission de certains virus de plantes contre les insectes vectorisé est aidée par des bactéries symbiotiques qui se trouvent dans ces insectes. Pour mieux étudier la transmission de ces virus de plantes by leurs vecteurs, il est également essentiel de visualiser les bactéries symbiotiques en général, et ceux qui sont impliqués dans la transmission du virus, en particulier. Colocalisation des virus et des bactéries symbiotiques est donc souhaitable pour enquêter sur les relations possibles entre ces organismes dans leur insecte hôte. En dehors de la transmission du virus, les bactéries symbiotiques influencent plusieurs aspects de la biologie des insectes vecteurs, la localisation ainsi spatiale de ces bactéries dans les insectes est d&#39;un grand intérêt et d&#39;importance. Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) est le plus important complexe de la maladie virale de la tomate cultivée dans le monde 1-4. TYLCV est un virus limitée au phloème et est exclusivement guidé par l&#39;aleurode Bemisia tabaci 5,6. Un modèle décrivant la translocation de bégomovirus dans leurs vecteurs aleurodes a été proposée 6-9. Deux obstacles spécifiques sont activement croisés pendantment cette transmission circulante: l&#39;intestin moyen / hémolymphe et les obstacles de la glande hémolymphe / salivaires. Ce procédé de transmission est supposé être médiée par des récepteurs qui reconnaissent inconnus la capside du virus. TYLCV est pensé pour traverser B. tabaci intestin moyen de 6,10, et est absorbé à travers le primaire des glandes salivaires 6 avant d&#39;être injecté dans la plante. Dans l&#39;hémolymphe aleurodes, TYLCV interagit avec une protéine GroEL produite par l&#39;insecte secondaire endosymbiotique bactérie Hamiltonella. Cette interaction assure la sécurité du transport de TYLCV dans l&#39;hémolymphe, et la protège contre l&#39;attaque par le système immunitaire des insectes 11. Hamiltonella et Portiera, la endosymbiote primaire aleurodes, sont logés dans bactériocytes, des cellules d&#39;insectes trouvés dans l&#39;hémolymphe et la maison endosymbiotiques bactéries 11. B. tabaci abrite des bactéries symbiotiques supplémentaires, y compris Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, et Fritschch, qui peuvent être localisés à l&#39;intérieur ou à l&#39;extérieur des bactériocytes, et ont des effets divers sur la biologie de l&#39;insecte 12. Plusieurs rapports ont tenté d&#39;étudier la localisation de TYLCV dans les plantes et les aleurodes en utilisant des protocoles de fastidieuses et coûteuses telles que microscopie électronique à transmission (MET), les anticorps et l&#39;ARN in situ sur la section d&#39;épaisseur microscopique 10,13, une étude récente décrit la localisation des virus de plantes à l&#39;intérieur de leurs hôtes végétaux et vecteur à l&#39;aide d&#39;un protocole simple 14. Nous décrivons ici un protocole simple pour la localisation de TYLCV dans B. tabaci disséqué estomacs et les glandes salivaires, et aux articles préparés à partir de plantes infectées par le TYLCV. Nous décrivons en outre la localisation de Portiera, la endosymbiote primaire de B. tabaci, et ses endosymbiontes secondaires Hamitonella, rickettsies et Arsenophonus. Ce protocole est basé sur l&#39;utilisation de sondes d&#39;ADN courts, quesont marqués par fluorescence sur leur extrémité 5 &#39;, et de s&#39;hybrider spécifiquement à des séquences complémentaires dans les séquences géniques virales ou bactériennes. Le traitement de l&#39;échantillon est relativement facile et le signal obtenu est très spécifique. Le protocole décrit peut être utilisé pour localiser des virus, des bactéries et d&#39;autres agents pathogènes chez leurs hôtes végétaux, les animaux et les insectes, et peut en outre être utilisé pour localiser l&#39;ARNm dans un tissu donné.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="653">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Fluorescently labeled&#160; Probes</td>
			<td style="width:95px;">Metabion</td>
			<td style="width:129px;">20 bp HPLC purified</td>
			<td style="width:212px;">Sequence designed by customer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Toluidine blue</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">89640</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">L3771</td>
			<td style="width:212px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Formamide</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">F9037</td>
			<td style="width:212px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">T5941</td>
			<td style="width:212px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">320099</td>
			<td style="width:212px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Blocker</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>22309</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence in situ hybridizations (fish) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues

Hybridation in situ fluorescente (FISH) est un nom donné à une variété de techniques couramment utilisées pour la visualisation de la transcription de gènes dans des cellules eucaryotes et peuvent être en outre modifiées pour visualiser d&#39;autres composants dans la cellule telles que l&#39;infection par des virus et des bactéries. Localisation spatiale et la visualisation des virus et des bactéries au cours du processus d&#39;infection est une étape essentielle qui vient compléter le profil d&#39;expression des expériences comme les puces et RNAseq en réponse à différents stimuli. Comprendre les infections spatio-temporelles avec ces agents complète expériences biologiques visant à mieux comprendre leur interaction avec les composants cellulaires. Plusieurs techniques de visualisation des virus et des bactéries telles que les systèmes de gènes rapporteurs ou des méthodes immunohistochimiques sont longues, et certains sont limités à travailler avec des organismes modèles et sur les méthodologies complexes. FISH qui cible les espèces d&#39;ARN ou d&#39;ADN dans la cellule est un moi relativement facile et rapidethode pour étudier la localisation spatio-temporelle des gènes et à des fins diagnostiques. Cette méthode peut être robuste et relativement facile à mettre en œuvre lorsque les protocoles emploient court hybridation, les sondes commercialement achetés, qui ne sont pas chers. Ceci est particulièrement robuste lorsque la préparation des échantillons, la fixation, l&#39;hybridation, et la visualisation microscopique ne comportent pas d&#39;étapes complexes. Nous décrivons ici un protocole de localisation de bactéries et de virus dans les tissus d&#39;insectes et de plantes. La méthode est basée sur une préparation simple, la fixation et l&#39;hybridation des supports entiers insectes et les organes disséqués ou sections de plantes fabriqués à la main, avec 20 paires de bases des sondes d&#39;ADN courts conjugués à des colorants fluorescents sur leur extrémité 5 &#39;ou 3&#39;. Ce protocole a été appliqué avec succès à un certain nombre de tissus d&#39;insectes et de plantes, et peut être utilisée pour analyser l&#39;expression des ARNm ou d&#39;autres espèces d&#39;ARN ou d&#39;ADN dans la cellule.

Le système étudié dans ce manuscrit est illustré à la figure 1 et comprend une plante infectée avec TYLCV, un adulte et d&#39;une nymphe de l&#39;aleurode B. tabaci, et l&#39;anatomie interne de l&#39;aleurode montrant le chemin pour TYLCV translocation dans l&#39;insecte. Figure 2 montre deux poissons dans un aleurode adulte pour le symbiote primaire Portiera et le symbiote secondaire Arsenophonus. Figure 3 montre le double FISH pour <e...

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Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues | Immunology and Infection | Video

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Nous décrivons ici d&#39;une simple hybridation fluorescente in situ (FISH) Méthode pour la localisation des virus et des bactéries dans les tissus d&#39;insectes et de plantes. Ce protocole peut être étendu pour la visualisation de l&#39;ARNm dans la montagne ensemble et coupes microscopiques.

Fluorescence<em&gt; In situ</em&gt; Hybridations (FISH) pour la localisation des virus et des bactéries dans Endosymbiotic plantes et d&#39;insectes tissus

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

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Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

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23.2K vues.  Volcani Center.  Nous décrivons ici d'une simple hybridation fluorescente in situ (FISH) Méthode pour la localisation des virus et des bactéries dans les tissus d'insectes et de plantes. Ce protocole peut être étendu pour la visualisation de l'ARNm dans la montagne ensemble et coupes microscopiques. 

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Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

Verrouillé flux Nucleic Acid cytométrie de fluorescence In situ</emHybridation> (LNA flux FISH): une méthode d&#39;bactérienne détection de l&#39;ARN petits

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Recherche

Immunologie et infection

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Administration intranasale de vaccins contre la grippe recombinant chimérique dans les modèles de souris pour étudier l&#39;immunité muqueuse

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ détection des bactéries dans les tissus inclus en paraffine Utiliser une sonde ADN de digoxine marqué ciblage ARNr 16S

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Identification de séquences de localisation Plasmodesmal en protéines In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Protocoles pour étudier l&#39;hôte d&#39;un tissu de distribution, en mode de transmission, et l&#39;effet sur la remise en forme de l&#39;hôte d&#39;un Densovirus dans le coton Heliothis

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basées sur la fluorescence neuraminidase Essai d&#39;inhibition pour évaluer la sensibilité des virus de la grippe à la neuraminidase Inhibiteur Classe de Antiviraux

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

Fluorescence quantitative In Situ Hybridization (FISH) et Immunofluorescence (IF) de produits génétiques spécifiques dans les cellules infectées par le KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

Microscopie de fluorescence à cellules vivantes pour étudier la localisation des protéines subcellulaires et les changements de morphologie cellulaire chez les bactéries

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. Considering the extensive damage caused by begomoviruses to crop production worldwide, it is imperative to understand the interaction between begomoviruses and their whitefly vector. To do so, localization and quantification of the virus in the vector tissues is crucial. Here, using tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) as an example, we describe a detailed protocol to localize begomoviruses in whitefly midguts, primary salivary glands, and ovaries by immunofluorescence. The method is based on the use of specific antibodies against a virus coat protein, dye-labeled secondary antibodies, and a confocal microscope. The protocol can also be used to colocalize begomoviral and whitefly proteins. We further describe a protocol for the quantification of TYLCV in whitefly midguts, primary salivary glands, hemolymph, and ovaries by quantitative PCR (qPCR). Using primers specifically designed for TYLCV, the protocols for quantification allow the comparison of the amount of TYLCV in different tissues of the whitefly. The described protocol is potentially useful for the quantification of begomoviruses in the body of a whitefly and a virus-infected plant. These protocols can be used to analyze the circulation pathway of begomoviruses in the whitefly or as a complement to other methods to study whitefly-begomovirus interactions.

We describe an immunofluorescence and quantitative PCR method for the localization and quantification of begomoviruses in insect tissues. The immunofluorescence protocol can be used to colocalize viral and vector proteins. The quantitative PCR protocol can be extended to quantify viruses in whole whitefly bodies and virus-infected plants.

Localisation et quantification des bégomovirus dans les tissus de la mouche blanche par immunofluorescence et PCR quantitatif

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...