Ce travail a été soutenu par le NIH R01 HG002995 &quot;labourer le génome de zebrafish: une approche de génétique inverse&quot; à CBM.

Partie A: Solutions congélation du sperme 1. Ringers poisson Ginsberg (Faire frais tous les 3 jours; Ginsburg, 1963) REMARQUE: l&#39;ordre d&#39;ajout est important de prévenir PRÉCIPITATION Dans 450 ml stériles ddH2O dissoudre: <ul><li> NaCl 3,25 g </li><li> KCl 0,125 g </li><li> CaCl2 • 2 H2O 0,175 g Puis ajouter: </li><li> NaHCO3 0,10 g </li></ul> Amener le volume final à 500 ml avec ddH2O stériles et conserver à 4 ° C. 2. Milieu de congélation (Faire frais du jour) <ol style="list-style-type:lower-roman"><li> Sans méthanol <ul><li> Poissons Ginsburg Ringers 10 ml (température ambiante). </li><li> Lait écrémé en poudre 1,5 g </li></ul></li><li> Avec du méthanol REMARQUE: l&#39;ordre d&#39;ajout est important de prévenir PRÉCIPITATION <ul><li> Poissons Ginsburg Ringer 9 ml (température ambiante). </li><li> 1 ml de méthanol </li><li> Lait écrémé en poudre 1,5 g </li></ul> Après le montage des médias de congélation, bien mélanger pendant 20 min. sur agitateur orbital ou de bascule. Avant d&#39;utiliser, dans la partie aliquote 1 ml tubes Eppendorf, en évitant les bulles de surface. </li></ol> Partie B: Matériel nécessaire pour la congélation du sperme Matériel nécessaire pour la congélation du sperme <ol><li> 10 ul pipettes jetables (chat Fisherbrand # 22-358697) </li><li> Béchers de 250ml d&#39;eau contenant des poissons MESAB / tricaïne </li><li> verres de montre (chat Pyrex # 9985-75) </li><li> P20 Pipetman (ou équivalent) et des conseils </li><li> Détenteur de poissons éponge (pour tenir hommes tout en serrant) </li><li> Dissection microscope avec éclairage de la scène ci-dessus </li><li> Pince plate (type Millipore, par exemple) </li><li> 2.0ml flacons cryogéniques (Cat # 430488 Corning) </li><li> 10X10 cryoboîtes (Nalgene cat # 03-337-7AA) </li><li> Styromousse récipient rempli de ~ 15 cm de ICE1 sèche finement broyées </li><li> 15 ml conique tubes (Falcon # 352099) </li><li> Vase Dewar contenant de l&#39;azote liquide </li><li> Pince à long terme (par exemple CMS Fisher chat Soins de santé # 10-316B) </li><li> Cryogloves </li><li> Réservoir de récupération pour les hommes </li><li> Un tube Eppendorf remplis avec les médias de congélation sans méthanol </li><li> Un tube Eppendorf remplis avec les médias de congélation avec du méthanol </li><li> Cryofreezer (par exemple, Taylor-Warton série K) </li></ol> 1 Une méthode simple pour faire de la glace finement broyées à sec est de l&#39;envelopper dans une serviette et pulvériser avec un marteau. Une méthode plus efficace est d&#39;utiliser un broyeur de glace carbonique, par exemple Clawson modèle RE-2. Partie C: méthode de congélation de sperme <ol><li> MARK TUBES CAPILLAIRES: Avant de commencer, marquer les tubes capillaires 10 ul avec un stylo de laboratoire au niveau de 3,33 ul (c&#39;est à dire 16,7 mm du bas, voir Figure 1.1.). </li><li> Anesthésier MALE: masculin Lieu (x) dans le bécher contenant MESAB / tricaïne dilué dans l&#39;eau les poissons (recette dans «Le Livre de poisson zèbre») </li><li> Poisson séché: Une fois anesthésié, ascenseur poisson hors de l&#39;anesthésie à l&#39;aide d&#39;une cuillère en plastique et éponger délicatement les poissons à sec sur une serviette en papier, en accordant une attention particulière au séchage de la face ventrale. L&#39;eau actionne le sperme il est donc important de sécher complètement autour du cloaque. Position sur les poissons porte-éponge, jusqu&#39;à la face ventrale (Fig. 1.2). Si la région autour de la nageoire anale est encore humide, doucement à sec avec un Kimwipe. Prenez soin de ne pas presser le sperme prématurément! </li><li> Placez marqués tube capillaire dans un adaptateur en caoutchouc pipeter à la bouche qui est inclus avec les tubes capillaires. L&#39;adaptateur est un tuyau en caoutchouc qui a une embouchure sur une extrémité et un porte-capillaire sur l&#39;autre. Alternativement, le tube capillaire peut être reliée à une seringue Hamilton 50 pl via un petit bout de tube Tygon de diamètre approprié. </li><li> Placer sous le mâle de la portée et d&#39;exposer l&#39;ouverture urogénitale par attentivement la propagation des nageoires pelviennes en dehors en utilisant l&#39;extrémité du tube capillaire. </li><li> Recueil de sperme: Expulser spermatozoïdes par caresser doucement les côtés du poisson avec des pinces lisses (par exemple, Millipore), ou en pressant doucement les côtés du poisson entre votre index et le pouce. Recueillir le sperme dans le tube capillaire comme il est expulsé en utilisant une aspiration douce (Fig. 1.2). Evitez les matières fécales qui peuvent être expulsés avec le sperme. </li><li> Normaliser le volume de sperme à 3,3 ul: Si le volume de sperme atteint ou dépasse la marque stylo sur tube capillaire (soit 16,7 mm ou plus), puis passez à l&#39;étape 8. Si le volume de sperme n&#39;atteint pas le volume cible, puis de normaliser le volume de marquer stylo en utilisant le milieu geler sans méthanol (figure 1.3). Montant minimum du sperme qui est acceptable varie avec la qualité du sperme. Bonne spermatozoïde est blanche et opaque. Pauvre de sperme ressemble larmoyants. En général, nous acceptons que des minimums: 1 spermatozoïde ul bon (ou 1 / 3 cible) et 2 ul de sperme pauvre (ou 2 / 3 cible). Le volume est maintenant normalisée à 3,3 pi. </li><li> AJOUTER cryoprotecteur aux spermatozoïdes: Aspirez moyen de congélation avec Ml&#39;éthanol pour la marque orange (approx. volume total est maintenant de 20 ul;. Fig 1.4). Expulser le mélange de sperme et cryoprotecteur sur zone propre d&#39;un verre de montre, en accordant une attention particulière à ne pas introduire de bulles. Mélanger doucement par aspiration et refoulement ~ 4 fois (éviter l&#39;introduction de bulles). </li><li> LIEU 10 ul sperme dans chacune des 2 cryotubes: pipette 10 ul de sperme: solution cryoprotectrice dans le fond de deux cryotubes distincts qui ont été étiquetés avec des informations pertinentes (Fig. 1.5). Déplacement rapide, flacons capuchon et déposez-les dans le bas de la température ambiante 15 ml tubes Falcon-un cryovial / tube. Cap Falcon tube et insérer la paire de tubes Falcon cryovial contenant en glace sèche écrasée. </li><li> Congeler du sperme pendant 20 min. Sur glace sèche: La glace sèche doit être sous forme de poudre fine, pas de pastilles. Les tubes doivent être insérées dans la glace sèche assez profonde que seuls leurs bouchons montrent (fig. 1.6). Afin de garder une trace de tubes dans la glace sèche, donner à chaque paire de tubes Falcon un numéro de 1-20 (écrit sur les bouchons) et enregistrer le temps ils vont dans la glace sèche. </li><li> Cryotubes placer dans l&#39;azote liquide:. Après le sperme a été congelé sur glace sèche pendant 20 minutes, les transférer sur un contenant de l&#39;azote liquide vase Dewar. Le sperme est stocké ici jusqu&#39;à ce que le temps de placer au congélateur azote liquide. Lorsque vous placez dans les boîtes de congélation, coffre congélateur placer dans un bain d&#39;azote liquide afin que les échantillons ne chauffent pas. Utiliser des pinces métalliques longs à récupérer les flacons de vase Dewar et manipuler avec cryogloves. Alternativement, cryotubes peuvent être transférées directement à partir de la glace sèche dans la boîte congélateur si la boîte du congélateur est maintenue immergée dans l&#39;azote liquide dans un récipient en polystyrène expansé. </li><li> Cryotubes magasin à long terme dans un congélateur à azote liquide cryogénique. Afin de maintenir la viabilité des spermatozoïdes, il est important que les flacons sont conservés immergés dans l&#39;azote liquide. Dans notre expérience, flacons stockés dans la phase vapeur perdent leur viabilité dans le temps. La vitesse est importante! Le temps entre l&#39;ajout du cryoprotecteur et en plaçant les flacons de sperme dans la glace sèche (ie les étapes 6-10) ne devrait pas être plus de 30 sec. </li></ol> Partie D: Méthode de fécondation in vitro avec le sperme cryoconservés Nous constatons que cela fonctionne mieux avec deux personnes. Une personne serre les œufs des femelles tandis que l&#39;autre personne dégèle le sperme. <ol><li> Définissez un bain d&#39;eau à 33 ° C. </li><li> Retirer du congélateur cryovial azote liquide et le transfert de l&#39;azote liquide contenant vase Dewar jusqu&#39;au moment de dégel. </li><li> Presser les oeufs des femelles dans les boîtes de Pétri 35mm en plastique. Si possible, essayez d&#39;obtenir trois couvées d&#39;œufs et de combiner en un seul plat. Si vous ne pouvez pas obtenir trois embrayages bonne au sein de 1 min de votre premier embrayage, puis passez à l&#39;étape 4 (un embrayage bonne est suffisant). Définition de l&#39;embrayage bonne:&gt; 150 oeufs à la recherche de manière uniforme belle (jaunâtre-dire, sans aucun débris blancs indique une dégradation). Gardez plat couvert pendant que le sperme est décongelé. </li><li> Retirez le flacon de l&#39;azote liquide et enlever le capuchon. Flacon rapidement plonger ~ 1 / 2 chemin dans 33 ° C bain d&#39;eau pendant 8-10 sec. </li><li> Ajouter rapidement 70 ul température ambiante Hanks au flacon et mélanger par pipetage de haut en bas. Immédiatement ajouter les oeufs et mélanger délicatement avec la pointe de pipette. </li><li> Sans plus tarder, activer le sperme et les oeufs en ajoutant 750 poissons d&#39;eau ul. Faire tourbillonner pour mélanger. Incuber 5 min à température ambiante. </li><li> Après 5 min, remplissez-vaisselle avec l&#39;eau du poisson et un plat incuber à 28 ° C. Après 2-3 heures, le comte et le transfert d&#39;embryons fertiles à des plats 100mm (50/dish). Comptez oeufs stériles de telle sorte que la fréquence de fertilisation peut être déterminée. </li><li> Prenez bien soin des larves! Pour les 5 premiers jours, changer l&#39;eau tous les jours et retirer les embryons morts. Mettez les larves qui ont seuls la vessie natatoire en pépinière sur 5 jours. </li></ol> Partie E: Résultats Représentant Nous avons utilisé cette méthodologie crypreservation de faire une bibliothèque de 8600 échantillons de sperme congelé pour labourer entre les années 2001 et 2003. Nous avons décongelés 106 de ces échantillons et déterminé leur fertilité. La fertilité est le ratio des embryons viables produites dans une fécondation in vitro, divisé par le nombre total d&#39;oeufs qui ont été fécondés avec le sperme congelé. Frais (non cryporeserved) spermatozoïde a généralement la fertilité&gt; 95%; de sperme cryoconservés a fécondité beaucoup plus faible: une moyenne de 29% (n = 106 flacons). La variabilité flacon à flacon de fécondité est élevé, allant de moins de 1% à aussi haut que 62%. Cette variabilité est représentée par les barres d&#39;erreur importante représentant l&#39;écart type dans la Fig. 2. Cependant, dans 106 échantillons de sperme décongelé à jour, nous avons seulement une fois expérimenté la fertilité 0% dans deux échantillons de sperme et a échoué à récupérer la mutation TILLING correspondant. Par le dégel des flacons de sperme provenant de notre bibliothèque au cours de plusieurs années (2001-2008), nous avons constaté que la fécondité moyenne des échantillons de sperme congelé par cette méthode restestables au fil du temps (Fig. 2). La fécondité moyenne des échantillons de sperme congelé dégelé en 2001 était de 23,5% (basé sur 11 échantillons de sperme) et en 2008 était de 25% (basé sur 21 échantillons de sperme). Un certain nombre d&#39;autres chercheurs sont maintenant en utilisant ce protocole de congélation de sperme dans leurs laboratoires. Certains ont rapporté de bons résultats avec des taux de fécondité et de l&#39;échantillon à l&#39;échantillon une variabilité similaire à ce que nous avons observés. D&#39;autres auraient échoué à faire de ce protocole de travail dans leurs mains. Nous croyons que des sources probables de problèmes sont les suivants: <ol><li> Ne pas utiliser les cryotubes exacte ou tubes coniques, nous avons suggéré dans le protocole, conduisant à un taux différent de refroidissement lorsque dans la glace sèche; </li><li> La non utilisation de poudre de glace sèche, conduisant à une vitesse de refroidissement sous-optimale; </li><li> En utilisant les poissons mâles à la fertilité médiocre: vous devriez obtenir au moins 1 ul de sperme à partir d&#39;un seul mâle. Vous pouvez également tester la fertilité masculine en faisant une fécondation in vitro avec le sperme frais, mais cela peut être trompeur, car il prend très peu de sperme frais de s&#39;approcher de la fertilité de 100%. </li><li> En utilisant des oeufs de qualité inférieure aux normes dans la fécondation in vitro. Utiliser tout sauf embrayages parfaite conduit toujours à proximité de la fertilité de 0%, même à partir d&#39;échantillons de sperme qui ont réellement une bonne fertilité (basé sur la fertilité de la fiole en double). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Schéma de la méthodologie de la congélation du sperme. <img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Fertilité des spermatozoïdes cryoconservés reste stable au fil du temps. La fertilité pour cent est le nombre d&#39;embryons viables produites dans une fécondation in vitro, divisé par le nombre total d&#39;oeufs qui ont été fécondés avec le sperme congelé. &quot;N&quot; désigne le nombre de flacons de sperme cryoconservés dont la fertilité a été testé dans l&#39;année correspondante. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;écart-type. Comme chaque flacon de sperme est d&#39;un mâle différent, flacon à flacon variabilité est observée.

<ol>
	<li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes.">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li><li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol.">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li></ol>

Un certain nombre d&#39;autres chercheurs sont maintenant en utilisant ce protocole de congélation de sperme dans leurs laboratoires. Certains ont signalé la fertilité similaires et le même échantillon à l&#39;échantillon que nous avons la variabilité observée. D&#39;autres auraient échoué à faire de ce protocole de travail dans leurs mains. Nous croyons que des sources probables de problèmes sont les suivants: <ol><li> Ne pas utiliser les cryotubes exacte ou tubes coniques, nous avons suggéré dans le protocole, conduisant à un taux différent de refroidissement lorsque dans la glace sèche; </li><li> La non utilisation de poudre de glace sèche, conduisant à une vitesse de refroidissement sous-optimale; </li><li> En utilisant les poissons mâles à la fertilité médiocre: vous devriez obtenir au moins 1 ul de sperme à partir d&#39;un seul mâle. Vous pouvez également tester la fertilité masculine en faisant une fécondation in vitro avec le sperme frais, mais cela peut être trompeur, car il prend très peu de sperme frais de s&#39;approcher de la fertilité de 100%. Plus grand, plus robuste mâles colorés donnent généralement le sperme de qualité plus élevés. </li><li> En utilisant des oeufs de qualité inférieure aux normes dans la fécondation in vitro. Utiliser tout sauf embrayages parfaite conduit toujours à proximité de la fertilité de 0%, même à partir d&#39;échantillons de sperme qui ont réellement une bonne fertilité (basé sur la fertilité de la fiole en double). </li></ol>

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		<tr>
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		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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<tr>
<td>10 &mu;l disposable pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-358697</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Watch glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pyrex</td>
<td>9985-75</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 ml cryogenic vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430488</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 x 10 cryoboxes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene</td>
<td>03-337-7AA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>352099</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tongs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Health Care</td>
<td>10-316B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cryofreezer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Taylor-Warton</td>
<td>K-series</td>
<td>For example</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

a high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization

C&#39;est une méthode pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre qui est une adaptation de la méthode Harvey (Harvey et al., 1982). Nous avons introduit deux modifications au protocole original que les deux rationaliser la procédure et l&#39;uniformité de l&#39;échantillon augmente. Premièrement, nous normalisons tous les volumes de sperme à l&#39;aide des médias de congélation qui ne contient pas l&#39;cryoprotecteur. Deuxièmement, les spermatozoïdes cryopréservés sont stockés dans des cryotubes au lieu de tubes capillaires. Le taux de spermatozoïdes gel et de dégel (δ ° C / heure) sont probablement les deux variables les plus critiques à contrôler dans cette procédure. Pour cette raison, ne pas remplacer les tubes différents de ceux spécifiés. Travaillant en équipes de 2, il est possible de congeler le sperme de 100 hommes par équipe dans ~ 2 heures. Le sperme cryoconservés en utilisant ce protocole a une moyenne de fertilité de 25% (mesurée par le nombre d&#39;embryons viables généré en une fécondation in vitro, divisé par le nombre total d&#39;œufs fécondés) et cette fertilité pour cent est stable depuis de nombreuses années.

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A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Ceci est un protocole de haut débit de cryoconservation des spermatozoïdes de poisson zèbre. Le sperme cryoconservés en utilisant ce protocole a une moyenne de fertilité de 25% de fécondation in vitro ultérieure et est stable depuis de nombreuses années.

Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

30.8K vues.  University of California, Davis. Ceci est un protocole de haut débit de cryoconservation des spermatozoïdes de poisson zèbre. Le sperme cryoconservés en utilisant ce protocole a une moyenne de fertilité de 25% de fécondation in vitro ultérieure et est stable depuis de nombreuses années.

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A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Recherche

Biologie

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Un rapide à haut débit Méthode de cartographie ribonucléoprotéines (RNP) sur l&#39;homme pré-ARNm

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: un procédé de croissance Arabidopsis Et plants de tomates dans des plaques à 96 puits pour génotypage à haut débit

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Cryoconservation du sperme de souris et de récupération utilisant les I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Une méthode à haut débit pour la mesure de débit de filtration glomérulaire chez des souris conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Production de haploïdes embryons de poisson zèbre par<em&gt; In Vitro</em&gt; Engrais

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Un petit écran Molecule Manuel approchant à haut débit utilisant embryons de poissons zèbres

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recouvrement des adultes coeurs de poisson zèbre à haut débit pour des applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...