La recherche présentée ici a été soutenue par Charles River. Les auteurs sont très reconnaissants à l&#39;Modèles génétiquement modifiés et le groupe Services et le personnel de l&#39;embryologie pour les soins des animaux et l&#39;injection d&#39;hormones.

1. Cryoconservation du sperme de souris <ol><li> Pour chaque ligne d&#39;être cryoconservés, préparer la suivante avant de commencer. <ol><li> 1 puits d&#39;un plat 4-bien avec 240 l de kit CPA </li><li> 15 pailles cryoconservation du sperme comme suit <ol><li> Connectez l&#39;0,25 ml pailles à l&#39;seringues de 1 ml avec le tampon de coton plus proche de la seringue. Dans chaque paille, charge de 8 cm (environ 160 pi) de moyennes FIV, puis 1 cm d&#39;air. Étiquette les pailles avec le nom de la ligne doit être préservée. </li></ol></li></ol></li><li> LN 2 devrait être de 15 cm de profondeur dans la boîte de mousse. Fermez le couvercle. </li><li> 2 euthanasier les souris mâles de chaque ligne pour être cryoconservés. Souris devrait se situer entre 10 et 60 semaines. Retirez les deux épididymes caudales avec le canal déférent de chaque souris. </li><li> Placez les épididymes dans le CPA préalablement préparé contenant bien d&#39;un plat 4-même (étape 1.1). </li><li> Faire 5-7 coupes longitudinales dans chaque épididyme et doucementpresser chaque canal déférent pour pousser le sperme sortir. </li><li> Agiter le mélange de l&#39;ACP et de l&#39;épididyme à la main en douceur à la température ambiante pendant 3-5 minutes. Cela permettra aux spermatozoïdes de nager sur. </li><li> Utilisation de la paille préalablement préparé, aspirer 5 mm (environ 10 pi) de la suspension de spermatozoïdes et ensuite 1 cm d&#39;air. </li><li> Répétez ce processus jusqu&#39;à un total de 15 pailles. Charger et sceller des pailles dans les 10 minutes pour la survie des spermatozoïdes mieux. </li><li> Thermoscellez deux côtés de la paille soigneusement. Placer les pailles dans le bidon de congélation du sperme avec la colonne première. </li><li> Fixer la pipette 1 ml fournie dans le cadre de la trousse à la boîte de prolonger la poignée. Placez la cartouche dans la LN 2 dans la boîte de mousse à travers le trou dans le couvercle. Laisser le réservoir de flotter à la verticale dans la LN 2 pendant 10 minutes. </li><li> Immergez la cartouche dans le LN2. Le sperme est maintenant cryoconservés et peut être déplacé à long terme LN 2 de stockage. </li><li> La cartouche ne doit pas être utilisé pourla ligne suivante jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit réchauffé à la température ambiante. </li></ol> 2. Superovulation souris <ol><li> Généralement, l&#39;utilisation de jeunes souris femelles de la même origine que les donneurs de sperme. </li><li> Souris devrait être ~ 12 g (3-4 semaines d&#39;âge). </li><li> Effectuer une injection intrapéritonéale avec UI 5-10 de gonadotrophine de sérum de jument enceinte (PMSG). </li><li> Attendre 46 à 48 heures. </li><li> Effectuer une injection intrapéritonéale avec UI 5-10 de la gonadotrophine chorionique humaine (hCG). </li><li> Récolte ovocytes 14-16 h après l&#39;injection d&#39;hCG comme décrit ci-dessous. </li></ol> 3. La récupération des spermatozoïdes de souris et FIV <ol><li> Avant la FIV, pour chaque paillette d&#39;être décongelé, préparer la suivante et s&#39;équilibrer pendant au moins une heure dans un 37 ° C incubateur à CO 2. <ol><li> Plat d&#39;incubation de sperme: une boîte de Petri de 35 mm, avec une chute de 90 ul de milieu de traitement du sperme (STM) recouvert d&#39;huile. </li><li> Découpe plat: Pour la collecte des ovocytes à partir d&#39;un maximum de 10 sfemelles uperovulated, une boîte de Petri de 35 mm avec 3 ml de milieu de FIV. </li><li> FIV ainsi: Pour chaque groupe de 5 femelles superovulées pour la FIV, un puits d&#39;un plat bien avec 4 500 pi de milieu de FIV (si vous utilisez 10 femelles superovulées, par exemple, vous aurez besoin de 2 puits...) </li><li> Laver la vaisselle: une boîte de Petri de 35 mm avec 3 ml de simplex de potassium moyenne optimisée (KSOM) pour le lavage dans chaque puits de l&#39;antenne 4-FIV ainsi utilisée </li><li> Boîte de culture: une boîte de Petri de 35 mm avec 50 gouttes ul de milieu KSOM recouvert d&#39;huile pour la culture d&#39;embryons de chaque puits de la parabole de FIV. </li></ol></li><li> Suppression d&#39;une paille de LN 2 et placer dans un bain à 37 ° C l&#39;eau pendant 2-3 minutes. </li><li> Retirez la paille du bain d&#39;eau et essuyez pour enlever l&#39;excès d&#39;eau. Faire la première coupe à proximité de la colonne de First Air le plus proche du bouchon de coton. Couper la paille au milieu de FIV il y aura encore une colonne d&#39;air visibles avant que la colonne de sperme. </li><li> Ensuite, couper l&#39;extrémité de la paille dans le seuxièmement l&#39;air colonne, en prenant soin d&#39;éviter de couper la colonne de sperme. Couper à un angle de 45 - ce qui rendra beaucoup plus facile à aspirer le sperme. </li><li> Aspirer la suspension de spermatozoïdes à partir de l&#39;extrémité distale de la paille avec une pipette 200 pi. </li><li> Placer la suspension de spermatozoïdes dans le centre de la goutte de la STM et incuber le plat pendant 45-60 minutes dans un 37 ° C CO 2 5% incubateur. </li><li> Durant l&#39;incubation des spermatozoïdes, disséquer les oviductes des femelles superovulation dans le plat de coupe. Utiliser une aiguille de 30 g ou une pince pour arracher chaque oviducte, libérant les complexes cumulus-ovocytes (COC). Évitez les gras et du sang dans les moyennes FIV comme sale des médias fait pour les étapes de lavage supplémentaires. </li><li> Une fois que tous les oviductes ont été arrachés, le transfert du COC à partir de 5 femelles à chaque puits de FIV. Le nombre de COC produite par superovulation est très dépendante de contrainte. </li><li> Recueillir 10-15 ul de sperme de la périphérie de la goutte STM et fertiliser un FIV ainsi d&#39;environ 14-16 heures après l&#39;hCG injection. Répétez la fertilisation pour chaque puits utilisé. Concentration du sperme final sera d&#39;environ 1 million / ml. </li><li> Spermatozoïdes et des ovocytes coculture pendant 4-6 heures dans un 37 ° C 5% CO 2 incubateur. </li><li> Laver les embryons avec KSOM un minimum de 2 fois et la culture en gouttes KSOM pour le développement dans un 37 ° C 5% CO 2 incubateur. </li><li> Taux de fécondation in vitro a été calculé que deux embryons au stade de cellules à des ovocytes totale utilisée, après une nuit de culture. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Le sperme de 5 souches de souris Charles River, consanguins a été gelé. Les rapports de protection sont calculés en divisant les valeurs d&#39;évaluation congelés sperme frais valeurs d&#39;évaluation du sperme. Rapports de protection de la motilité des spermatozoïdes ont été de 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% pour C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCRL, DBA/2NCrl, et BALB / cAnNCrl, respectivement. Rapports de protection pour la motilité progressive rapide ont été de 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% en C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas<html> LCR, FVB / NCRL, DBA/2NCrl, et BALB / cAnNCrl, respectivement (figure 1). Le taux de fécondation in vitro avec du sperme congelé-décongelé ont été de 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% et 26,2% en C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCRL, DBA/2NCrl, et BALB / cAnNCrl, respectivement (figure 2) . Sur une période de 1,5 années, 49 lignées de souris génétiquement modifiées ont été archivées par la cryoconservation du sperme. Ces lignes ont ensuite été récupéré avec succès (tel que défini par les chiots nés vivants) par FIV en quatre souches femelles (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 et 129Sv) (Fig. 3). <img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig1.jpg" /> Figure 1. Les rapports de protection de la motilité des spermatozoïdes et la motilité progressive rapide chez la souris <img alt="Figure 2." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig2.jpg" /> Figure 2. Fécondation in vitro avec du sperme congelé-décongelé chez la souris 3713fig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3. Fécondation in vitro avec du sperme congelé-décongelé dans des souris transgéniques

<ol>
	<li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol.">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li><li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa.">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing.">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li><li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa:+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks,+mutagenesis+screens,+and+mouse+backcrosses.">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm.">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li><li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL/6+mice.">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li><li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization.">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li><li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates.">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li><li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing.">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li><li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity.">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li><li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserving,+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation.">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li></ol>

Les auteurs sont des employés de Charles River, le fabricant de ce kit.

Depuis 1990, le protocole de sperme base de gel en utilisant le raffinose 18% et 3% de lait écrémé a été prouvé fiable dans de nombreuses souches de souris et un grand nombre de lignées de souris ont été cryoconservés 1,2,3,4,5,6,7. Les principales causes de dommages aux cellules du sperme pendant le processus de congélation et de décongélation ont été associés à la formation de glace et de 8,9 espèces réactives de l&#39;oxygène 10. La supplémentation avec piégeurs de radicaux libres, tels que des acides aminés, et les agents réducteurs, tels que monothioglycérol, dans le milieu de congélation a été étudiée et prouvée d&#39;augmenter substantiellement le taux de FIV avec du sperme congelé-décongelé dans des souches consanguines y compris les C57BL / 6 11,6. Dans le présent protocole, nous avons développé un nouveau I • Cryo kit pour la cryoconservation du sperme de souris en optimisant le CPA avec base disponibles dans le commerce des antioxydants et les inhibiteurs de la glace et en modifiant le point de congélation du sperme et la procédure de FIV. Rapports de protection de la motilité des spermatozoïdes(&gt; 60%) et la motilité progressive rapide (&gt; 45%) ont été observés pour les spermatozoïdes à partir de cinq souches de souris consanguines congelés avec le kit I • Cryo. Le taux de 2-cellules stade embryonnaire de développement avec du sperme congelé-décongelé en 5 souches de souris consanguines a été nettement améliorée par rapport à celui avec base CPA 11,6. En utilisant la trousse, l&#39;utilisateur crée une suspension de spermatozoïdes du sperme concentré par congélation de 2 hommes pour chaque ligne. En seulement 15 pailles de congélation le processus est rapide, facile et occupe moins d&#39;espace de stockage pour l&#39;entreposage à court ou à long terme. La plupart du temps, des lignées de souris peuvent être récupérées par le dégel seulement 1 ou 2 pailles.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				Materials</th>
			<th>
				Supplier</th>
			<th>
				Catalogue number</th>
			<th>
				Comments</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPA</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STM</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF medium</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 ml plastic straw</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm freezing canister</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cane and goblet</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5310</td>
			<td>Should be embryo tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-106-D</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat sealer</td>
			<td>ABTEC</td>
			<td>TISH-200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well multidish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>73521-424</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Various</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&deg;C + 5% CO2 incubator</td>
			<td>Various</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2 storage system</td>
			<td>Various</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&deg;C water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>EMDChemicals</td>
			<td>367222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc syringe w/ 26G 3/8 needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD309625</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5602</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge &frac12; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6802</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135, RS-5110, RS-5005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse sperm cryopreservation and recovery using the i&middot;cryo kit

Des milliers de nouveaux génétiquement modifiés (OGM) des souches de souris ont été créés depuis l&#39;avènement des technologies de transgénèse et KO. Beaucoup de ces précieux animaux n&#39;existent que comme des animaux vivants, sans plan de sauvegarde en cas d&#39;urgence. Cryoconservation des embryons peuvent fournir ce secours, mais elle est coûteuse, peut être une procédure longue, et nécessite généralement un grand nombre d&#39;animaux pour le succès. Depuis la découverte que le sperme de souris peuvent être cryoconservés avec succès avec un agent de base cryoprotecteurs (CPA), composé de raffinose 18% et 3% de lait écrémé, la cryoconservation du sperme est devenu une procédure acceptable et rentable pour l&#39;archivage, la distribution et la récupération de ces souches précieuses . Ici nous démontrons une nouvellement développé, je • Cryo Kit pour la cryoconservation du sperme de souris. Le sperme de cinq souches couramment utilisé des souris consanguines ont été gelés en utilisant ce kit et ensuite récupéré. Rapports de protection plus élevé de la motilité des spermatozoïdes (&gt;60%) et la motilité progressive rapide (&gt; 45%) par rapport au contrôle (de base CPA) ont été vus pour sperme congelé avec ce kit de 5 souches de souris consanguines. Deux cellules d&#39;embryons de stade de développement après FIV avec le sperme retrouvé a été améliorée de manière cohérente dans l&#39;ensemble des 5 souches de souris examinées. Sur une période de 1,5 années, 49 lignées de souris génétiquement modifiées ont été archivées par la cryoconservation du sperme avec le kit I • Cryo et récupéré plus tard par FIV.

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Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Ici nous démontrons l&#39;nouvellement développé, je • Cryo Kit pour la cryoconservation du sperme de souris. Deux cellules du développement embryonnaire scène avec des spermatozoïdes congelés-décongelés a été améliorée de manière cohérente dans cinq souches de souris à l&#39;utilisation de ce kit. Sur une période de 1,5 années, 49 lignées de souris génétiquement modifiées ont été archivées par la cryoconservation du sperme avec le kit I • Cryo et plus tard avec succès récupéré par FIV.

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Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Collecte et cryoconservation des ovocytes de hamster et d&#39;embryons de souris

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Cryoconservation d&#39;embryons de souris par base d&#39;éthylène glycol vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems for sperm analysis were developed to measure several parameters and one of the most commonly measured is the sperm motility.
Initially, this computer technology was designed for mammalian species, although it can also be used for fish sperm analysis. Fish have specific features that can affect sperm assessment such as a short motility time after activation and, in some cases, adaptation to lower temperatures. Thus, it is necessary to modify both software and hardware components to make motility analysis more efficient for fish sperm analysis. For mammalian sperm, the heating plate is used to maintain optimal temperatures of spermatozoa. However, for some fish species, it is advantageous to use a lower temperature to prolong the duration of motility, since the sperm remain active for less than 2 min. Therefore, cooling devices are necessary to refrigerate samples at constant temperature over the time of analysis, including on the optical microscope. This protocol describes the analysis of fish sperm motility using software for sperm analysis and new cooling devices to optimize the results.

The present protocol describes a procedure of fish sperm assessment using computer-assisted sperm analysis and cooling devices. The software gives a rapid, accurate and quantitative analysis of fish sperm quality based on spermatozoa motility, which can be a useful tool in aquaculture to improve reproduction success.

Évaluation de sperme de poissons à l’aide de logiciels et de dispositifs de refroidissement

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

Prélèvement du sperme de qualité différentielle en utilisant la Centrifugation en Gradient de densité

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is a newly isolated filamentous cyanobacterium. This paper describes how new filamentous cyanobacteria can be isolated from marine rockpools. It also describes how DNA can be extracted from filaments and how the genomes can be sequenced. Although transformation is established for many single-celled species, it is less frequently reported for filamentous cyanobacteria. A simplified method for the natural transformation of P. lacuna is described here. P. lacuna is the only member of the order Oscillatoriales for which natural transformation is established. This paper also shows how natural transformation is used to express superfolder green fluorescent protein (sfGFP). An endogenous cpcB promoter induced approximately 5 times stronger expression than cpc560, A2813, or psbA2 promoters from Synechocystis sp. PCC6803. Further, a method for the cryopreservation of P. lacuna and Synechocystis sp. CPP 6803 was established, and methods for assessing motility in a liquid medium and on agar and plastic surfaces are described.

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Phormidium lacuna is a filamentous cyanobacterium that was isolated from marine rockpools. This article describes the isolation of filaments from natural sources, DNA extraction, genome sequencing, natural transformation, expression of sfGFP, cryoconservation, and motility methods.

Transformation naturelle, expression des protéines et cryoconservation de la cyanobactérie filamenteuse Phormidium lacune

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...