Je remercie le Dr Jessica Dominguez Rieg pour la lecture critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par l&#39;American Heart Association (Scientist Development Grant 10SDG2610034), un Carl W. Gottschalk subvention de recherche de la Société américaine de néphrologie, l&#39;Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales O&#39;Brien Center for Acute Kidney Injury Research ( P30DK079337), et le ministère des Anciens Combattants.

1. Solutions <ol><li> 0,85% NaCl: 8,5 g de NaCl / 1 l trou DDH 2 O (8,5 g / L). </li><li> 0,5 mol / L HEPES pH 7,4 (dissoudre 59,6 g d&#39;HEPES dans 0,5 L de trou DDH 2 0 et ajuster le pH à 7,4 avec NaOH 10 N). </li></ol> 2. Préparation de la solution d&#39;injection FITC-inuline <ol><li> Peser FITC-inuline pour préparer une solution à 5% et se dissoudre dans NaCl à 0,85% (généralement 100 mg / 2 ml de NaCl à 0,85%) par chauffage à 90 ° C jusqu&#39;à dissolution complète. </li><li> Peser dissous solution FITC-inuline et le poids de la note. </li><li> Coupez un morceau de 20 cm membrane de dialyse (poids moléculaire de coupure: 1000) et mettre dans le trou DDH 2 O pendant 30 min pour éliminer les résidus de NaN3 de la membrane et rincez plusieurs fois par la suite. </li><li> Remplissez dissous FITC-inuline dans la membrane de dialyse et sceller correctement avec des fermetures. </li><li> Peser toute membrane de dialyse. </li><li> Mettez la membrane de dialyse dans une solution de 1 L à 0,85% de NaCl et remuer lentement protégé par la lumière pendant 24 heures à rotempérature om. </li><li> Peser à nouveau toute la membrane de dialyse et calculer la nouvelle concentration (eau osmotique se déplacer dans la membrane et FITC non lié, ou liés au FITC inuline &lt;1,000 poids moléculaire se déplace hors de la membrane, ainsi, la concentration de FITC-inuline diminue sensiblement) . </li><li> La nouvelle concentration FITC inuline (c) est calculé selon la formule suivante: C = N / V, où n = initiale montant FITC-inuline, V = nouveau volume (différence de poids d&#39;un tube de dialyse, avant et après la dialyse ainsi que le volume de départ solution FITC-inuline). </li><li> Avant d&#39;utiliser stériliser dialysée solution FITC-inuline par filtration à travers un filtre à seringue de 0,22 um. </li><li> Conserver le FITC-inuline abri de la lumière (feuille d&#39;aluminium) à 4 ° C. Dialysée et stérilisée FITC-inuline peut être utilisé pour un maximum de 2 semaines. A participé au FITC inuline peut être dissoute par réchauffage à 90 ° C pendant quelques minutes. </li></ol> Remarque: si vous utilisezFITC-sinistrine 16-18, qui ne nécessite pas de dialyse, toutes les mesures nécessaires pour la dialyse peuvent être ignorés. 3. Injection et de prélèvement sanguin <ol><li> Prendre du poids corporel (pc) de la souris avant l&#39;expérience. </li><li> Anesthésier la souris brièvement avec l&#39;isoflurane. </li><li> Pour haut-débit de 6 souris s&#39;il vous plaît suivre le protocole prévu dans la figure 3. </li><li> Injecter 2 pl / g de poids corporel de dialyse FITC-inuline dans le plexus rétro-orbital 24 en utilisant un G30 ½ en aiguille (enlever les bulles d&#39;air de 100 pi seringue Hamilton en utilisant d&#39;abord un G26 ½ en aiguille, puis de passer à un G30 ½ à aiguille pour injection). </li><li> Coupez 1 mm de la queue de la souris avec des ciseaux une fois et prélever du sang à 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 et 75 min après injection dans Na-héparine minicapillaries. Seal minicapillaries après la collecte de sang avec Cha-joint. </li><li> Conserver les échantillons à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Mettez scellé minicapillaries intérieur hématoCritique capillaires et centrifuger pendant 5 min. </li><li> Casser minicapillaries en utilisant un tailleur de diamants et tout transfert de plasma à la pipette dans un tube de 0,2 ml. </li><li> Faire une dilution de 1:10 à l&#39;aide de 2 pi de plasma et 18 pi de 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4) dans le nouveau tube de 0,2 ml (échantillons peuvent être conservés pendant une nuit à 4 ° C pour les mesures de fluorescence). </li><li> Mesurer 2 ul d&#39;échantillon dilué avec NanoDrop 3300 en double. La description et l&#39;utilisation de l&#39;instrument est décrit ici 5. </li></ol> 4. Préparation des étalons <ol><li> Recueillir le sang des souris de la même souche de fond dans de l&#39;héparine revêtu hématocrite capillaires, ralentit et diluer à 1:10 avec 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4), le plus souvent 80 plasmatiques pl + 720 pl HEPES. </li><li> Diluer la solution d&#39;injection FITC-inuline avec plasma dilué de la souris pour obtenir les dilutions standards suivants: 01h10: 10 pl solution FITC-inuline non dilué + 90 pl plasma dilué de souris 1:100: 10 &amp; mu, L (1:10) solution + 90 pl plasma dilué de souris 1:1000: 10 pi (1:100) solution + 90 pl plasma dilué de souris 1:2000: 30 pl (1:1) solution + 30 pl plasma dilué de souris 1:10.000: 10 pl (1:5) solution + 40 pl plasma dilué de souris 1:20.000: 20 pl (1:1) solution + 20 pl plasma dilué de souris 1/100.000: 10 pl (1:5) solution + 40 pl plasma dilué de souris La concentration des normes dépendra de la dialyse et sera toujours différent pour chaque préparation de FITC-inuline. Il est nécessaire d&#39;entrer la concentration de la courbe standard nouveau à chaque fois. </li><li> Analyser les données pour calculer GFR avec un logiciel approprié (par exemple GraphPad Prism) en utilisant une fonction de décroissance exponentielle en deux phases comme décrit ici 15, 20 et montré dans la section des résultats représentatifs. </li></ol>

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+Renal+Blood+Flow+and+Glomerular+Filtration+in+Normal+Man.">The Control of Renal Blood Flow and Glomerular Filtration in Normal Man.</a> J. Clin. Invest. 17 (5), 683-697 (1938).</li><li>Darling, I. M., Morris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+"true"+creatinine+clearance+in+rats+reveals+extensive+renal+secretion.">Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion.</a> Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).</li><li>Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+endogenous+creatinine+clearance+as+a+measure+of+renal+function+in+mice.">Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice.</a> Kidney Int. 65 (5), 1959-1967 (2004).</li><li>Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney Int. 77 (6), 519-526 (2010).</li><li>Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+A1+adenosine+receptors+augments+diabetic+hyperfiltration+and+glomerular+injury.">Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).</li><li>FINGL, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+excretion+of+creatinine+in+the+rat.">Tubular excretion of creatinine in the rat.</a> Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).</li><li>Keppler, A., Gretz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+creatinine+determination+in+mice+and+rats:+an+enzymatic+method+compares+favorably+with+a+high-performance+liquid+chromatography+assay.">Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay.</a> Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).</li><li>Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+creatinine+and+renal+function.">Serum creatinine and renal function.</a> Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).</li><li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin.">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).</li><li>Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picric+acid+methods+greatly+overestimate+serum+creatinine+in+mice:+more+accurate+results+with+high-performance+liquid+chromatography.">Picric acid methods greatly overestimate serum creatinine in mice: more accurate results with high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 144 (1), 285-290 (1985).</li><li>Qi, Z., Breyer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice.">Measurement of glomerular filtration rate in conscious mice.</a> Methods Mol. Biol. 466, 61-72 (2009).</li><li>Qi, Z., Whitt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance.">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).</li><li>Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+using+FITC-sinistrin+in+rats.">Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats.</a> Nephrol. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+creatinine+as+a+filtration+marker+in+glomerulopathic+patients.">Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients.</a> Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).</li><li>Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+glomerular+filtration+rate+by+single-bolus+inulin:+a+comparison+of+estimation+analyses.">Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses.</a> J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).</li><li>Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+[corrected]+type+1+diabetes+mellitus:+a+tubulo-centric+view.">Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).</li><li>Vallon, V., Eraly, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+organic+anion+transporter+OAT3+in+renal+creatinine+secretion+in+mice.">A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).</li><li>Vallon, V., Schroth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+A(1)+receptors+determine+glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+streptozotocin+diabetes+mellitus.">Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus.</a> Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).</li></ol>

L&#39;auteur a reçu des fonds pour couvrir les frais de cette publication par Thermo Fisher Scientific.

La présente étude décrit une technique pour la détermination du taux de filtration glomérulaire chez des souris conscientes par injection bolus unique et l&#39;analyse de la fluorescence dans 8 échantillons sanguins en décroissance exponentielle en deux phases. A mesure GFR à 1 souris prend 75 min. En utilisant un organigramme spécial, il est possible de mesurer le taux de filtration glomérulaire de 6 souris en 130 min. Il est possible de répéter ce protocole organigramme jusqu&#39;à 4 fois par jour et de mesurer GFR à 24 souris. Nous avons modifié cette méthode de sorte qu&#39;il est possible de prélever du sang à partir d&#39;une petite queue snip plutôt que de veine de la queue crevaison, ce qui est plus rapide et plus facile pour les enquêteurs à effectuer par rapport à la veine caudale crevaison. En utilisant 10 pl hématocrite capillaires et une dilution de 1:10, il est possible de réduire la quantité totale de sang nécessaire à &lt;100 pi. Enfin, la fluorescence est mesurée à l&#39;aide d&#39;un NanoDrop 3300 fluorospectromètre, qui permet de déterminer la fluorescence dans 1-2 pi d&#39;échantillon dilué. Cette méthode donnera le investigato intéresséra vraie valeur GFR. En revanche, les mesures de la créatinine chez les souris présentent plusieurs faiblesses dont &quot;la créatinine zone aveugle» et les difficultés liées à la détermination spécifique et sensible. La «zone aveugle de la créatinine&quot; limite sa fonction en tant que marqueur pour GFR parce que la créatinine sérique reste dans la fourchette normale jusqu&#39;à 50% de la fonction rénale est perdue 19. Depuis plusieurs chercheurs utilisent des souris génétiquement modifiées dans leurs recherches pour étudier la physiologie rénale et la physiopathologie, cette porte le problème suivant: en supposant une souris knockout des gènes X aurait un taux de filtration glomérulaire significativement plus faible (de 40%) par rapport à une souris de type sauvage, un dépistage simple en comparant la créatinine plasmatique serait pas détecter cette différence. La nécessité d&#39;une bonne méthode précise de détermination GFR devient plus critique plus les différences de taux de filtration glomérulaire devenir. Les souris ont des concentrations élevées de chromagens non-créatinine dans le plasma et l&#39;urine qui interfèrent avec le commercedosages de créatinine disponibles. En conséquence, les tests qui sont basés sur le picrate Jaffé réaction alcaline surestimation concentration de créatinine dans le plasma par rapport à la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) détermination 6, 13. Une autre limitation est que la créatinine sérique est inférieure aux limites de détection de plusieurs tests disponibles dans le commerce par rapport à la détermination HPLC. Cependant, en utilisant des réactions enzymatiques enquêteurs ont pu déterminer la créatinine plasmatique chez les souris 10, 22. GFR dans une fourchette similaire a été observée chez des souris conscientes utilisant un procédé d&#39;injection bolus unique comparable ainsi que urinaire dégagement FITC-inuline 14. Contrairement à leur protocole, notre protocole utilisant snip de queue ne nécessite pas de précautions particulières afin de préserver l&#39;intégrité du navire par rapport à la veine de la queue ou la ponction de la veine saphène. Pour la clairance urinaire / plasma basé FITC-inuline, il est nécessaire d&#39;implanter chirurgicalement deux mi osmotiquenipumps. Deux pompes sont nécessaires pour atteindre plasma FITC-inuline concentrations à l&#39;équilibre suffisamment élevées qui se distinguent clairement de l&#39;arrière-plan. Cela nécessite également l&#39;utilisation de cages métaboliques pour une collection complète et datés urine. Les cages doivent être rincés afin de tenir compte d&#39;une perte de 25-37% de FITC-inuline, qui survient par ailleurs sans rinçage. Les pièges de l&#39;utilisation de cette méthode FITC-inuline sont limitées. Les enquêteurs doivent être conscients de ce qui suit: (i) assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air dans la seringue utilisée pour l&#39;injection de la solution de FITC, (ii) injection rétrobulbaire complet doit être réalisé parce que la quantité injectée détermine le taux de filtration glomérulaire calculé, et ( iii) Les souris seront plus susceptibles d&#39;uriner pendant la min expérience GFR 75, de sorte d&#39;éviter la contamination des échantillons de sang à l&#39;urine, ce qui aura une concentration FITC-inuline très élevé en raison de la capacité de concentration des reins. Avantages généraux of cette méthode FITC-inuline sont les suivants: (i) il s&#39;agit d&#39;une technique non-radioactive, (ii) il est possible de répéter les mesures plusieurs fois dans la même souris, (iii) le test peut être effectué sur des souris conscientes, ( iv) aucune collecte d&#39;urine est nécessaire, et (v) une option à haut débit peut être utilisé. Inconvénients pour l&#39;injection d&#39;un bolus unique comprennent la nécessité d&#39;une dialyse de FITC-inuline, qui peut être surmonté en utilisant une meilleure FITC-marqueur, FITC-sinistrine, qui est maintenant disponible et peut être mesurée par voie transcutanée en utilisant un dispositif miniaturisé spéciale 18. Même si GFR est mesurée, il n&#39;est pas possible de mesurer les excrétions fractions de liquide ou ions avec cette méthode. Dans l&#39;ensemble, cette méthode fournit la faisabilité d&#39;une méthode à haut débit pour la mesure du DFG chez des souris conscientes. Ainsi, cette technique pourrait être d&#39;intérêt pour d&#39;autres chercheurs qui sont intéressés à la détermination de la fonction rénale chez les souris.

Le taux de formation de plasma ultrafiltré par le glomérule est devenue la base pour évaluer la fonction rénale (débit de filtration glomérulaire, DFG). Le marqueur idéal pour déterminer GFR doit être librement filtrée, ni sécrétée ou réabsorbé et non métabolisé. Un tel comportement a été trouvé pour être vrai pour l&#39;inuline, et clairance de l&#39;inuline est devenu une référence pour la détermination du DFG 3. Alors que la clairance de la créatininémie est largement utilisé comme une mesure du DFG chez les humains et les animaux, de la créatinine ne satisfait pas aux exigences d&#39;un marqueur GFR idéal. Environ 10 - 40% de la clairance de la créatinine chez les humains est la conséquence de la sécrétion tubulaire active 1, 11, et la sécrétion rénale de la créatinine est également importante chez les souris et les rats 4, 7, 9, 22. Dysfonction rénale est connue pour augmenter la sécrétion tubulaire de la créatinine qui limite sa valeur comme marqueur du DFG 1, 2. Nous avons précédemment montré que les composés organiques anion transporteur isoforme3 (OAT3) contribue à murin sécrétion de la créatinine 22. Cependant, la clairance de l&#39;inuline nécessite généralement l&#39;utilisation de matières radioactives inuline marquée (3 H ou 14 C). La détermination radioactive de l&#39;inuline peut être utilisée chez les souris anesthésiés et conscients, mais héberge les inconvénients de nombreuses règles de sécurité et les questions de manipulation strictes inhérentes à l&#39;utilisation des isotopes radioactifs. Le long de ces lignes, les préparatifs de dédouanement chirurgicaux pour la détermination du taux de filtration glomérulaire sont coûteux en temps ainsi que la borne dans la nature. En 1999, Lorenz et al. 12 introduit FITC-inuline comme marqueur de la seule nephron GFR chez la souris anesthésiés. Cinq ans plus tard Qi et al. 15 déterminée ensemble GFR du rein chez les souris conscients en utilisant FITC-inuline. Des protocoles alternatifs utilisent maintenant FITC-inuline comme un marqueur exogène pour mesurer GFR chez la souris conscients et anesthésiés. Ces protocoles conservent la sensibilité de l&#39;inuline radioactive en utilisant la fluorescence DETECTIsur et contourner les inconvénients de travailler avec un marqueur radioactif marqué. Le test FITC-inuline a été modifié par d&#39;autres 7, 8 et nous 22, 23 pour profiter de la capacité microvolume du NanoDrop 3300 fluorospectromètre. Cela permet de réduire le volume de l&#39;échantillon total nécessaire pour &lt;100 ul de sang par mesure GFR. Avec la méthode et le protocole à haut débit fourni dans cette publication, nous démontrons la faisabilité de la mesure du DFG chez jusqu&#39;à 24 souris conscientes par jour. Cette technique pourrait être utile à d&#39;autres chercheurs qui étudient murin GFR et nous espérons qu&#39;il va remplacer les méthodes moins précises que les indices de la fonction rénale, comme la créatinine et de l&#39;urée sanguine.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-inulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7706</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Webster Veterinary</td>
			<td>78366551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (MWCO 1000)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132636</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane closure</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132736</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 &mu;l Hematocrit capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>22362566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Micro-MB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l Na+-Heparin minicaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9000210</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (100 &mu;l)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorospectrometer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 3300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &mu;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>880-26464-UE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealant</td>
			<td>Ch&acirc;-seal</td>
			<td>510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (G26 &frac12; and G30 &frac12;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305111 &amp; 305106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice

La mesure du débit de filtration glomérulaire (DFG) est l&#39;étalon-or dans l&#39;évaluation de la fonction rénale. Actuellement, les enquêteurs déterminent GFR en mesurant le niveau de la créatinine endogène ou exogène biomarqueur appliquée radioactive inuline marquée (3 H ou 14 C). Créatinine présente l&#39;inconvénient important que proximales comptes tubulaires de sécrétion de ~ 50% de l&#39;excrétion totale de la créatinine et donc de la créatinine n&#39;est pas un marqueur fiable GFR. Selon l&#39;expérience réalisée, la clairance de l&#39;inuline peut être déterminée par une injection unique en bolus intraveineux ou par perfusion continue (minipompe intraveineuse ou osmotique). Les deux approches nécessitent la collecte de plasma ou plasma et l&#39;urine, respectivement. Autres inconvénients de l&#39;inuline marquée radioactive comprennent l&#39;utilisation d&#39;isotopes, le temps de préparation chirurgicale de consommer des animaux, et l&#39;exigence d&#39;une expérience de terminal. Nous décrivons ici une méthode qui utilise une seule injection d&#39;un bolus del&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC), l&#39;inuline marquée et la mesure de sa fluorescence dans 2.1 l de plasma dilué. En appliquant un modèle à deux compartiments, avec 8 collectes de sang par souris, il est possible de mesurer GFR dans un maximum de 24 souris par jour en utilisant un protocole de flux de travail spécial. Cette méthode ne nécessite brève anesthésie isoflurane avec tous les échantillons de sang sont prélevés chez une souris non-retenue et éveillé. Un autre avantage est qu&#39;il est possible de suivre la souris sur une période de plusieurs mois et traitements (c.-à faire des expériences appariées avec des changements alimentaires ou des applications de la drogue). Nous espérons que cette technique de mesure du DFG est utile à d&#39;autres chercheurs qui étudient la fonction rénale de la souris et remplacera des méthodes moins précises pour estimer la fonction rénale, comme la créatinine plasmatique et de l&#39;urée sanguine.

GFR sera calculé selon la formule suivante: GFR = n / (A/K1 + B/K2), où n = quantité injectée (n = c • V, où c = concentration FITC-inuline, V = volume injecté) A = span1, ordonnée à l&#39;origine de l&#39;élimination K1 = constante d&#39;élimination décroissance B = span2, ordonnée à l&#39;origine de la distribution K2 = constante de décroissance de la distribution Note: A, K1, K2 et B sont des abréviations donnés par GraphPad Prism, chaque logiciel capable d&#39;analyser décroissance exponentielle en deux phases peuvent être utilisés, cependant, un autre logiciel scientifique peut utiliser des abréviations différentes. En utilisant un ajustement de la courbe de décroissance exponentielle en deux phases, qui est basé sur les concentrations plasmatiques de FITC-inuline, une courbe comparable à celui montré à la figure 1 doit être obtenu. Calcul GFR par la formule ci-dessus (et comme décrit ici &lt;sup&gt; 20) permet de détecter une insuffisance de la fonction rénale ou 15 hyperfiltration glomérulaire 8, 23 que l&#39;on trouve chez la souris avec diabète de type 1 (figure 2). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig1.jpg" /> Figure 1. Pour mesurer GFR chez des souris conscientes, cinétique plasmatique de FITC-inuline après une injection intraveineuse d&#39;une dose unique est utilisé. Pour le calcul du taux de filtration glomérulaire, un modèle à deux compartiments est utilisé. Dans le modèle à deux compartiments, la phase de décroissance rapide initiale représente la redistribution de FITC-inuline à partir du compartiment intravasculaire pour le fluide extracellulaire. La phase ultérieure, avec décroissance plus lente de la concentration FITC-inuline, reflète principalement la clairance systémique du plasma. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig2.jpg" /> Figure 2. Detection de hyperfiltration diabétique chez les souris de type sauvage. diabète de type I a été induite par l&#39;application intrapéritonéale de streptozotocine (STZ, 50 mg / kg pendant 5 jours consécutifs). GFR a été déterminée avant (basale) et 5 semaines après l&#39;induction du diabète. Grâce aux commentaires des tubuloglomérulaire, une augmentation primaire dans la réabsorption proximale provoque début hyperfiltration diabétique 21, un constat qui est reproductible chez les souris de type sauvage (n = 10, p &lt;0,01 vs basale même souris). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig3.jpg"/> Figure 3. Organigramme pour la mesure du DFG dans un ensemble de 6 souris. Pour mesurer toute GFR du rein par la méthode de l&#39;injection d&#39;un bolus unique, 8 échantillons de sang doivent être prélevés à 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 et 75 min après injection FITC-inuline. Les chiffres indiquent points dans le temps. Les chiffres entre parenthèses indiquent le nombre d&#39;échantillons. points de Temps restant de la ligne verticale rouge indiquent injectionpoints dans le temps (à 0, 11, 22, 33, 44 et 55 min). Chaque souris est marqué avec une couleur différente. Pour obtenir des collectes de sang séquentielles suivre les flèches. Les cases grises indiquent quand le prochain souris doit être préparé pour isoflurane avant l&#39;injection. En utilisant ce protocole le temps minimum entre 2 collectes de sang à partir de différentes souris est de 1 min.

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A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

Mesure du débit de filtration glomérulaire (GFR) est la norme d&#39;or pour l&#39;évaluation de la fonction rénale. Nous décrivons ici une méthode à haut débit qui permet la détermination du DFG chez des souris conscientes en utilisant une seule injection en bolus, la détermination de l&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-inuline dans le plasma et le calcul du taux de filtration glomérulaire par un modèle de décroissance exponentielle en deux phases.

Une méthode à haut débit pour la mesure de débit de filtration glomérulaire chez des souris conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

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Research

JoVE Journal

Biology

43.1K vues.  University of California, San Diego. Mesure du débit de filtration glomérulaire (GFR) est la norme d'or pour l'évaluation de la fonction rénale. Nous décrivons ici une méthode à haut débit qui permet la détermination du DFG chez des souris conscientes en utilisant une seule injection en bolus, la détermination de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-inuline dans le plasma et le calcul du taux de filtration glomérulaire par un modèle de décroissance exponentielle en deux phases.

Vidéo: A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Recherche

Biologie

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Un rapide à haut débit Méthode de cartographie ribonucléoprotéines (RNP) sur l&#39;homme pré-ARNm

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

High-Throughput mesure et de classification de P organique dans les échantillons environnementaux

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: un procédé de croissance Arabidopsis Et plants de tomates dans des plaques à 96 puits pour génotypage à haut débit

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

À haut débit microinjections oursins zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Mesure des taux métabolique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; En utilisant Respirométrie

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Laboratoire de Physiologie et de démonstration: taux de filtration glomérulaire dans un Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...