Nous reconnaissons les dons en nature des souches bactériennes à partir des groupes du professeur Judith Armitage (Université d&#39;Oxford, Royaume-Uni) et le professeur Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London, UK). IMD est financé conjointement par le Département de biochimie (Université d&#39;Oxford) et OCISB; AR est financé par une ingénierie et sciences physiques Research Council (EPSRC) stagiaire de DTC; ND est financé à partir des biotechnologies et des sciences biologiques du Conseil de recherches (BBSRC); MCL est financée par une bourse de la Société royale de recherche universitaire.

<ol><li> Pour commencer cette procédure, 50 pl de stocks congelés de la protéine fluorescente Escherichia coli exprimant les cellules bactériennes sont d&#39;abord décongelée et culture aérobie avec agitation dans 5 ml de milieu LB de croissance nuit à 37 ° C. Dans la matinée, 50 pi de cette culture saturée est extrait et sous-culture dans les milieux de culture minimale M63 glucose, l&#39;incubation à 30 degrés C pendant 4 à 6 heures. Ici nous démontrons l&#39;aide de deux souches de cellules différentes, dont l&#39;un exprime un transport d&#39;électrons du cytochrome fusionnée à la GFP, l&#39;autre qui exprime une protéine impliquée dans le moteur flagellaire des bactéries fusionnée à la GFP. </li><li> Les cellules peuvent soit récoltée directement de la sous-culture de plus en plus, si les considérant comme des échantillons immobilisés, ou ils peuvent être cisaillées pour tronquer flagelles bactériens Si la visualisation sous la rubrique «captif» des conditions. </li><li> Cisaillement consiste à placer généralement 1-5ml de la sous-culture dans un dispositif constitué de deux seringues stériles rejoint par une tuyauterie stérile. La tonte se fait en alternance dans chacun poussant pompe seringue pour pousser la culture à travers le tuyau étroit. Ceci est fait de 50 à 100 fois, selon l&#39;étendue de cisaillement requise. La culture est ensuite centrifugée pour sédimenter les cellules, qui est remis en suspension dans un milieu minimal pour éliminer les fragments de flagelles. </li><li> Nous préparons ensuite nettoyé BK7 lamelles de verre en la plongeant dans une solution saturée de KOH dans l&#39;éthanol pendant 20 min, puis rincer abondamment à l&#39;eau désionisée et de l&#39;éthanol et laisser sécher à l&#39;air pendant au moins 1 h. </li><li> Nous construisons un simple flux de cellules à la maison des cellules au microscope. Cela implique de tracer des lignes de graisse de paraffine sur une lame de verre BK7 microscope et en créant ensuite un tunnel-sandwich en plaçant l&#39;un des coverlips nettoyé sur le dessus, et en appuyant doucement avec une paire de pinces, ce qui donne un volume cellulaire débit de 50 à 10 ul . </li><li> Pour observer des cellules immobilisées, nous remplissons le flux de cellules par injection avec un 0,1% p / v solution de poly-L-lysine, et lui permettre d&#39;incuber à température ambiante pendant au moins 1 min. Nous avons ensuite rincer à l&#39;aide de 100 ul milieu minimal en injectant les médias d&#39;un bout de la circulation des cellules et de mèche avec du papier absorbant de l&#39;autre. </li><li> Nous avons ensuite la mèche à 20 pi d&#39;une dilution 1:500 de 200 nm de diamètre des microsphères de latex (Polysciences) dans un milieu minimal pour marquer la surface lamelle. Le flux de cellules est inversée de telle sorte que la lamelle est orienté vers le bas, placé sur une plate-forme claire de la surface dans une chambre humide simple, et incubée à température ambiante pendant 5 min. Unbound perles sont ensuite emportées par capillarité à travers les médias 100 ul minime. </li><li> Si nous voulons observer des cellules captif nous omettons l&#39;étape de poly-L-lysine et au lieu de remplir le flux des cellules avec 5 mg / ml d&#39;anticorps anti-flagelline. Le flux de cellules est placé dans la chambre humide pendant 10 min et est ensuite rincé à travers une mèche. </li><li> 20 ul de la culture cellulaire est alors méchants à travers le flux de cellules, soit en utilisant l&#39;échantillon cisaillé, si l&#39;observation des cellules à l&#39;attache ou l&#39;échantillon cisaillé dans la visualisation des cellules immobilisées. </li><li> Le flux de cellules est inversé et placé dans la chambre humide pendant 20 min. Unbound cellules sont ensuite lavées par capillarité à travers les médias 100 ul minime. </li><li> Une goutte d&#39;huile d&#39;immersion est placé dans le centre de la surface supérieure de la lamelle et le flux de cellules est ensuite placé délicatement sur le porte-échantillon du microscope à fluorescence intégré personnalisée, la prise de contact optique avec la lentille de grande ouverture numérique objectif. </li><li> Le microscope électronique multipliant appareil est allumé et l&#39;appareil a été réglée pour être refroidi à -70 ° C, le logiciel est mis à acquérir des images à une cadence typique de 25 Hz en mode de transfert cadre, initialement disenabling le contrôle de gain sur la caméra. </li><li> L&#39;éclairage fond clair est allumé et l&#39;image est mis en évidence, en sélectionnant une cellule appropriée ou d&#39;un groupe de cellules à imager sur la base de leur être coincés avec leur axe parallèle à la surface à long lamelle. L&#39;accent est finement ajusté afin de s&#39;assurer que les 200 billes de latex nm collé à la surface lamelle sont juste à point. </li><li> Une séquence d&#39;image est acquise en fond clair d&#39;enregistrer le contour du corps cellulaire. L&#39;éclairage fond clair est éteint et le gain de la caméra est activé au maximum. </li><li> Pour une acquisition standard à l&#39;aide totale à fluorescence à réflexion interne (ou la FRBR) un faisceau laser sur longueur d&#39;onde appropriée (ici, pour l&#39;excitation protéine fluorescente verte, nous utilisons un laser nm 473) est pré-établis de manière à se concentrer dans le plan focal arrière de la l&#39;objectif, mais déplacées latéralement de l&#39;axe optique pour générer un champ évanescent d&#39;excitation de fluorescence dans l&#39;échantillon de cellules. </li><li> L&#39;acquisition de la caméra est démarré et l&#39;obturateur ouvert au laser pour exciter les protéines fluorescentes dans les bactéries. Les paramètres de l&#39;intensité du laser et la vitesse d&#39;acquisition doivent être optimisés pour le système biologique particulier sous enquête par l&#39;expérimentation avec des valeurs différentes, mais une gamme typique rPERTINENTES à l&#39;étude de complexes protéiques mobiles dans la membrane cellulaire sont de 10 à 10 mW de puissance laser sur une zone d&#39;excitation circulaire de diamètre ~ 30 um, avec un temps d&#39;exposition par image de 5-40 ms. Les échantillons sont éclairés jusqu&#39;à ce photobleached, généralement pour ~ 10 s. </li><li> Ce protocole peut être utilisé aussi bien pour les cellules captif dans lequel le corps de la cellule est en rotation autour d&#39;un point d&#39;attache entre la lamelle et un talon flagellaire, et pour des cellules immobilisées qui sont rigidement fixées à la surface lamelle. </li><li> Certaines souches de cellules qui ont un nombre élevé de copies de complexes de bénéficier d&#39;une eau de Javel initiale limitée par la diffraction laser focalisé sur un pôle de la cellule avant de la FRBR imagerie. Cette eau de Javel est équivalent à celui utilisé dans la récupération de fluorescence après photoblanchiment (ou PAF). En utilisant notre microscope personnalisée partie de la lumière laser d&#39;excitation peut être alimenté au loin dans un second chemin indépendant utilisé pour FRAP type de blanchiment. Typiquement 1-10mW de puissance laser est utilisé, avec un temps de javel typique dans la gamme 10-300 ms. Ce résultat contraste d&#39;imagerie beaucoup plus élevé dans la zone blanchi de la cellule permettant complexes individuels qui par la suite diffuser dans ce domaine pour être plus facilement visible. </li><li> Pour visualiser les complexes dans le cytoplasme de la cellule qui diffusent beaucoup plus vite que ceux de la membrane cellulaire un mode d&#39;éclairage différent appelé &quot;slimfield&quot; est employé. Voici un laser focalisé est élargi latéralement pour simplement couvrir une seule cellule. Cela produit un champ très intense permettant des expositions beaucoup plus rapide d&#39;une milliseconde généralement à prendre. </li><li> Suite à l&#39;acquisition de données, les images sont introduites dans un logiciel créé sur mesure (code dans LabVIEW 8.5). Il détecte automatiquement les positions des taches fluorescentes dans les cellules avec une précision de quelques nanomètres et quelques extraits généralement leur taille et leur luminosité. Le brightnessof la trace photoblanchiment par rapport au temps d&#39;un complexe moléculaire est suivi ensuite utilisée pour estimer la stoechiométrie, à savoir combien individuels protéines fluorescentes forment un complexe moléculaire unique. </li></ol> Les résultats représentatifs: Lorsque le protocole est fait correctement les images des cellules considérées en fond clair est très distincte, avec les périmètres des organismes de cellule sombre contre un corps cellulaire blanc / gris (figure 1a). En utilisant la fluorescence des cellules immobilisées, nous pouvons voir l&#39;intensité des taches distinctes, généralement d&#39;une largeur de 250-300 nm (figure 1b). Sains, les cellules captif sera vu à tourner autour du point d&#39;attache d&#39;ancrage dans les images en fond clair. Sous l&#39;excitation de fluorescence des complexes moléculaires dans notre cas pourrait aussi être vu au point de fixation, indiquant une localisation de la protéine marqués avec le moteur flagellaire. Ces taches sont individuelles complexes moléculaires et le nombre d&#39;entre eux vu dépendra du mode d&#39;éclairage utilisé et combien de complexes sont effectivement présents dans la cellule à un moment donné. La mobilité des taches dépend du système biologique spécifique à l&#39;étude. Si la densité de points est initialement très élevé, comme c&#39;est le cas avec les cytochromes marqué utilisé ici, puis en effectuant une eau de Javel FRAP initiale peut améliorer le contraste d&#39;imagerie. <img src="/files/ftp_upload/1508/1508Figure1tmb.jpg" border="0" alt="Figure 1" /> Figure 1. (A) clair et (B) l&#39;image TIRF (fausses couleurs) pour une cellule d&#39;Escherichia coli immobilisé exprimant une protéine fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP) qui est connue pour être impliquée dans les moteurs flagellaires de bactéries. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1508/1508Figure1.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 1.

<ol>
	<li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+turnover+in+single,+functioning+membrane+protein+complexes.">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li><li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging.">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay.">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay.">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane.">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane.">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential,+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli.">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells.">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Des précautions doivent être prises pour ne pas «plus de cisaillement&quot; cellule pour regarder les bactéries attachées, car cela pourrait nuire à la fonctionnalité des moteurs flagellaires. Il est important d&#39;utiliser des cellules pour beaucoup plus d&#39;une heure une fois sur la lame du microscope, car ils peuvent devenir pauvre en oxygène. Optimisation considérables peuvent être nécessaires pour trouver les meilleurs conditions d&#39;imagerie microscope traiteur à votre système biologique spécifi...

visualizing single molecular complexes in vivo using advanced fluorescence microscopy

Aperçu complet sur les mécanismes de cellules vivantes peuvent être atteints que par l&#39;étude des processus clés qui déclenchent et direct d&#39;événements au niveau cellulaire. À ce jour, la complexité des systèmes biologiques de cisaillement a provoqué précise molécule unique d&#39;expérimentation à être beaucoup trop exigeant, de se concentrer plutôt sur des études de systèmes simples à l&#39;aide en vrac relativement rudimentaires ensemble de la moyenne des mesures. Toutefois, plusieurs processus importants se produisent dans la cellule vivante, au niveau d&#39;un seul ou de quelques molécules; mesures d&#39;ensemble masque généralement la nature stochastique et hétérogène de ces événements. Ici, en utilisant la microscopie optique de pointe et d&#39;analyse des outils d&#39;analyse d&#39;image, nous démontrons comment surveiller les protéines au sein d&#39;une seule cellule vivante bactérienne avec une précision de molécules uniques et comment nous pouvons observer la dynamique au sein de complexes moléculaires dans le fonctionnement des machines biologiques. Les techniques sont directement pertinents physiologiquement. Ils sont peu-perturbatifs et non-invasive à l&#39;échantillon biologique à l&#39;étude et sont entièrement à l&#39;écoute pour des recherches dans la matière vivante, les fonctionnalités ne sont pas facilement disponibles pour les autres une seule molécule des approches de biophysique. En outre, les échantillons biologiques étudiés tous les produits de protéines par fluorescence marqués à des niveaux qui sont presque identiques aux souches de cellules non modifiées («codage» génomique), par opposition à l&#39;approche la plus commune, mais moins idéal pour générer des protéines beaucoup plus que ne se produisent naturellement («plasmide d&#39;expression»). Ainsi, les échantillons biologiques réelles qui seront étudiés sont beaucoup plus près les organismes naturels, et donc la plus pertinente pour les observations réelles des processus physiologiques.

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Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Ici nous démontrons les protocoles pour effectuer une seule molécule de microscopie par fluorescence sur des cellules vivantes pour permettre aux bactéries fonctionnelles complexes moléculaires à détecter, suivre et quantifiés.

Visualisation simple complexes moléculaires In Vivo Utilisation avancée de microscopie par fluorescence

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

9.2K vues.  University of Oxford. Ici nous démontrons les protocoles pour effectuer une seule molécule de microscopie par fluorescence sur des cellules vivantes pour permettre aux bactéries fonctionnelles complexes moléculaires à détecter, suivre et quantifiés.

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualisation de la réplication d&#39;ADN molécule unique par microscopie à fluorescence

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Recherche

Biologie

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualisation des bactéries dans nématodes en utilisant la microscopie à fluorescence

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Analyse quantitative de l&#39;autophagie en utilisant avancée Fluorescence Microscopy 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Analyse rapide et exploration de microscopie par fluorescence Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualisation Fréquence Stromule avec Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

Imagerie fonctionnelle des usines de Transcription virale à l’aide de la microscopie en Fluorescence 3D

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

Visualisation de la structure des ganglions lymphatiques et de la localisation cellulaire à l'aide de la microscopie confocale ex-Vivo

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Examen de la dynamique nucléaire de levure de fission mitotique et méiotique par fluorescence Microscopie à cellules vivantes

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...