Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la microscopie optique, telles que la façon de prendre des images à super résolution ainsi que des images FRET à l’aide du même microscope. Le principal avantage de cette technique est que nous pourrions combiner trois modules d’imagerie différents en un seul microscope, réduisant considérablement le coût global. La démonstration visuelle de cette méthode est critique car l’assemblage du chemin d’excitation est difficile à apprendre.
Ils nécessitent un bon choix de pièces et un alignement optique sensible. Pour commencer, installez une carte d’acquisition de données via une interface PCI et utilisez-la pour connecter les lasers à l’ordinateur. Contrôlez les comportements lasers’on et off par sortie logique transistor-transistor et leur réglage de puissance par la sortie analogique de cette carte.
Ensuite, préparez une table optique isolée par vibration avec des miroirs et des séparateurs de faisceaux comme indiqué ici et décrit dans le protocole texte qui l’accompagne. Combinez les faisceaux laser dans une fibre optique à mode unique en montant d’abord une plaque d’adaptateur de fibre dans une monture de traduction z-axis. Ensuite, montez une lentille de doublette achromatique dans une plaque de cage.
Utilisez une tige d’extension pour connecter l’adaptateur et l’objectif pour former une cage. Ensuite, utilisez des poteaux optiques d’un pouce d’épaisseur pour monter la cage sur la table optique. Alignez le laser de 647 nanomètres en ajustant les composants pour obtenir une puissance laser maximale à travers la fibre.
Une fois l’alignement du premier laser terminé, installez temporairement une paire d’iris et alignez le reste des lasers un par un. Vérifiez l’efficacité d’alignement de chaque laser à l’aide d’un compteur de puissance. Assurez-vous de laisser un iris devant la plaque d’adaptateur pour réduire les reflets des lasers.
Ensuite, concevez et installez la lentille de grossissement décrite dans le protocole texte qui l’accompagne. Afin de créer l’effet d’astigmatisme nécessaire à l’extraction des coordonnées z de chaque molécule, placez une lentille 3D avec une longueur focale de 10 mètres dans la cassette et insérez-la dans le chemin du faisceau d’émission. Pour minimiser les vibrations lors de l’imagerie séquentielle d’épifluorescence multicolore, utilisez des filtres à émission placés dans une roue filtrante de barrière reliée à côté du microscope.
Pour la détection multicolore simultanée lors d’expériences FRET à molécule unique, placez un autre filtre dans un séparant d’émission. Pour configurer l’imagerie limitée à la diffraction à l’aide de l’épi-excitation, réglez d’abord l’angle accessoire du laser excitation en mode épi dans le bras d’éclairage. Ensuite, désengagez la lentille 3D et insérez le cube de dérivation dans le séparant d’émission.
Ensuite, insérez l’objectif mag pour un éclairage élargi. Une fois mis en place, prenez des images multicanaux, z-stack et/ou périmées de votre échantillon en fonction des résultats souhaités. Pour mettre en place la détection multicolore d’une molécule unique de molécules immobilisées en surface, déplacez d’abord la roue filtrante vers une position vide.
Cela permettra aux lasers de passer à travers. Ensuite, réglez l’angle accessoire des lasers excitation à l’angle de gazon, et désengagez les lentilles mag et 3D. Ensuite, engagez le mode trois canaux dans le séparant d’émission en remplaçant d’abord le cube de dérivation par un cube d’étalonnage qui permet à toute la lumière de passer par tous les canaux.
Ensuite, allumez la caméra sous DIC et ajustez l’ouverture du séparateur d’émission jusqu’à ce que trois canaux entièrement séparés apparaissent à l’écran. Tournez les boutons de commande de réglage vertical-horizontal sur le séparant d’émission, et alignez approximativement les trois canaux. Ensuite, éteignez la caméra et remplacez le cube d’étalonnage par le triple cube.
Placer un échantillon de perles multicanaux de 100 nanomètres. À l’excitation à 488 nanomètres, les perles multicanaux de 100 nanomètres émettent différentes longueurs d’onde de lumière, permettant l’alignement à trois canaux. Ensuite, allumez la caméra et le laser de 488 nanomètres, zoomez sur l’une des perles brillantes, et enfin aligner les trois canaux en tournant les boutons de commande de réglage à nouveau.
Avec l’échantillon maintenant en place, à l’aide d’un laser faible, naviguer vers une zone avec une densité ponctuelle raisonnable et ajuster la puissance laser et le temps d’exposition pour atteindre des niveaux acceptables de signal-to-noise et de photobleaching. Utilisez ensuite le logiciel d’imagerie pour prendre des images en accéléré. Pour l’imagerie à super résolution, commencez par insérer l’objectif 3D et retirez l’objectif mag.
Déterminez ensuite l’angle accessoire optimal du laser d’excitation pour être l’angle de gazon. Afin de trouver la hauteur objective appropriée pour l’imagerie SR, utilisez l’imagerie DIC pour trouver le plan intermédiaire des cellules. Identifiez le plan par la hauteur à laquelle les cellules deviennent transparentes.
Une fois que le plan focal désiré est déterminé, commencez l’imagerie à super résolution. Pendant l’imagerie, modifiez la puissance du laser de 405 nanomètres pour maintenir une densité raisonnable de taches clignotante. Commencez l’imagerie sans puissance laser violet.
Comptez le nombre de points clignotants dans une certaine période et augmentez la puissance laser violet de sorte que le nombre de points clignotants soit maintenu au-dessus d’un seuil de comptage défini par l’utilisateur dans le champ de vision. Analyser les données en détectant les centroïdes de chaque endroit dans les cadres d’imagerie et extraire les valeurs z pour chaque endroit à partir des largeurs X et Y. Construisez une image reconstruite et visualisez des objets en 3D.
Cette configuration au microscope permet une commutation flexible et reproductible entre différentes méthodes d’imagerie, y compris l’imagerie épifluorescente conventionnelle, l’imagerie à super résolution basée sur la détection d’une molécule unique et la détection multicolore d’une molécule unique. Afin de révéler des détails plus fins dans l’assemblage moléculaire, la microscopie à super résolution combine des milliers d’images comme celle-ci. Ces images sont ensuite reconstruites pour générer une image finale en super-résolution.
Les techniques de super-résolution permettent une haute résolution spatiale, fournissant des détails qui ne peuvent pas être vus avec d’autres techniques. Ceci est mis en évidence dans les deux images montrées ici. L’image de super-résolution montre la même RNase réglementaire bactérienne que l’image d’épifluorescence, mais permet la détection d’une seule molécule.
SmFRET est une autre méthode capable d’angstrom à la résolution nanométrique. Ici, les molécules d’ARN pliées ont été étiquetées avec un colorant vert de donneur et un colorant rouge d’accepteur. Les trajectoires d’intensité de fluorescence peuvent être extraites de molécules individuelles, générant l’efficacité du FRET en fonction du temps.
N’oubliez pas que travailler avec des lasers peut être dangereux, et des précautions telles que le port de la protection oculaire ou l’abaissement des pouvoirs laser doivent toujours être prises lorsque vous effectuez cette procédure.
