Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation Fellowship Graduate Research au SK et des National Institutes of Health octroi R01EB008722.

Préparation A. Matériel et stérilisation <ol><li> Avant de matériaux d&#39;encapsulation préparation, préparer une solution de 0,5% en poids du photoamorceur Irgacure 2959 (I2959) en tampon phosphate salin (PBS), en mélangeant et en incubant pendant plusieurs jours à 37 ° C. La solution peut alors être filtrée pour la stérilisation de seringues et stockés à température ambiante pendant une utilisation prolongée. </li><li> Basé sur la composition souhaitée des gels d&#39;être synthétisée, calculer (à l&#39;aide d&#39;un tableur comme Microsoft Excel) le poids de polymère et de réticulant nécessaire. Parce que un poids donné de polymère doit être dissous dans un volume défini au total pour atteindre une concentration souhaitée dans les hydrogels, le réticulant et des portions de la solution de polymère le volume du gel total doit également être déterminée en utilisant le tableur. Des calculs similaires devraient être faites le cas échéant parties pendantes (par exemple, un adhésif contenant RGD ou YGSR oligopeptide) doivent être incorporés avant réticulation. </li><li> Peser la quantité requise de polymère et de réticulant et le placer dans des tubes Eppendorf. Ajuster la feuille de calcul en conséquence pour le poids réel du polymère obtenu. (Remarque: les volumes peuvent être modifiés afin de compenser la masse réelle de polymère et de réticulant obtenus). </li><li> Préparer les moules de gel en utilisant une lame de rasoir pour couper les sommets hors des seringues stériles enveloppés séparément 1 mL à usage unique. Assurer une coupe à plat est fait pour les moules à être utilisé pour des gels photopatterned. </li><li> Placer les moules seringue, des tubes Eppendorf (avec bouchons ouverts) et tout autre matériel nécessaire sous une source de lumière germicide (généralement intégré dans les armoires de sécurité biologique) et stériliser pendant 30 minutes. </li></ol> Préparation des cellules B. <ol><li> Après stérilisation, ajouter le volume tampon stérile approprié (par les calculs sur tableur, tandis que le choix de la mémoire tampon peut varier, et un tampon PBS base faible telle que la triéthanolamine sont généralement utilisés pour la réticulation radicale et de type Michael libres, respectivement) au polymère et Eppendorf fraction pendentif (en option) d&#39;être inclus (par exemple, de l&#39;adhésif peptide) et le vortex de dissoudre (si vortex en dehors de la hotte stérile envelopper l&#39;Eppendorf avec du parafilm). </li><li> Ajouter le volume approprié de la solution de fraction de pendant à la solution de polymère et envelopper le joint avec du parafilm. Brièvement au vortex et incuber à 37 ° C à réagir (si possible, au sommet d&#39;une plaque d&#39;agitation rotatif) lors de la préparation cellulaire. Cela implique la réaction d&#39;un thiol sur un peptide (via le groupe cystéine) à un acrylate ou méthacrylate de sorte que le peptide est inclus en tant que groupe pendentif en hydrogel finale. </li><li> Trypsiniser et compter les cellules et les séparer en portions contenant le nombre approprié pour chaque ensemble de gels. Par exemple, pour un ensemble de trois gels 50 uL d&#39;une densité de 10 millions de cellules / ml, 1,5 millions de cellules séparées dans un tube conique individuelle. Il est recommandé que pas plus de 4 gels être préparés dans un ensemble individuel en raison du calendrier de gélification (note: si la synthèse de plusieurs ensembles de gels, d&#39;un seul Eppendorf contenant un volume adéquat de solution de polymère pour tous les jeux peuvent être préparés). </li><li> Centrifuger les cellules. </li><li> Alors que les cellules sont filer vers le bas <ol class="lalpha"><li> Lumière initiée sans réticulation radicale: ajouter 0,5% I2959 solution à la solution de polymère égale à 10% du volume total des mis en gel (pour une concentration de l&#39;initiateur finale de 0,05% en poids). </li><li> Type Michael (ajout) de réticulation: ajoutez tampon pour le réticulant pour atteindre la solution de concentration appropriée. </li><li> Pour réticulation séquentiel: ces gels intégrer les deux types de réticulation et nécessitent à la fois des étapes précédentes. </li></ol></li></ol> Formation d&#39;hydrogel C. <ol><li> Aspirer le surnageant de la partie cellulaire centrifugé. Attendez de liquide pour régler après aspiration initiale et ré-aspiration pour enlever les médias autant que possible, sans perturber le culot cellulaire. </li><li> Reprendre le culot cellulaire avec la solution de polymère jusqu&#39;à cellules sont réparties uniformément. Minimiser la formation de bulles par lentement pipetage la solution de haut en bas (environ 10 cycles devrait être suffisante pour distribuer des cellules). </li><li> Les hydrogels de réticulation <ol><li> Lumière initiée sans réticulation radicalaire: Aliquoter le volume approprié dans des moules bout de la seringue. Exposer les seringues à la lumière UV pour réticulation radicalaire (par exemple, une exposition de 10 minutes à 365 nm, 4 mW/cm2 lumière UV est commun pour les polymères fonctionnalisés acrylate). Cette étape doit être effectuée rapidement afin de minimiser la cellule de décantation avant d&#39;exposition à la lumière UV. </li><li> Type Michael (ajout) de réticulation: Utilisation d&#39;un large orifice pointe de la pipette, ajouter le volume approprié de solution réticulant à la solution polymère / cellule, mis la pipette au volume désiré de gel individuels, une pipette la solution haut et bas pourhomogénéiser et aliquot dans les moules bout de la seringue. Cette étape doit être effectuée rapidement afin d&#39;assurer une répartition homogène de cellules. Laisser 10-30 minutes (selon le système individuel) d&#39;incubation dans la hotte de la culture de la réticulation. </li><li> Réticulation séquentielle: Cela implique la réaction d&#39;addition de type Michael d&#39;abord, puis l&#39;exposition à la lumière pendant la réticulation secondes. Seule une fraction des liaisons de réticulation théorique devrait être mis à réagir lors de la réticulation d&#39;abord et ensuite un masque stérile doit être appliqué directement sur la surface du gel avant d&#39;exposition à la lumière en utilisant une pince à épiler stérilisée. Un colorant fonctionnalisés (par exemple, la rhodamine méthacrylatée (MeRho) à une concentration finale dans le gel de 20 nM) peuvent également être ajoutés à la solution initiale pour visualiser les motifs, car il va incorporer préférentiellement dans les régions radicalement réticulé du gel (figure 2 ). </li></ol></li></ol> Culture cellulaire D. et analyse <ol><li> Après réticulation, les gels plonger dans les puits d&#39;une plaque de culture de tissus contenant des milieux d&#39;incubation et de l&#39;analyse (voir les étapes ci-dessous). </li><li> Les cellules peuvent être visualisées pour la morphologie par microscopie optique (figure 3; généralement, les hydrogels synthétisés sont transparentes) et de la viabilité en utilisant un kit de coloration fluorescente vivants / morts (Figures 3 et 4). Coloration pour cellulaires actine (par exemple, la rhodamine ou fluorescéine phalloïdine étiquetés) et des noyaux (par exemple, 4&#39;-6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)) peut être réalisée à l&#39;aide de fixation et des procédures standard de perméabilisation (figure 4) avec la procédure suivante. <ol class="laplha"><li> Rincez les constructions 3X pendant 5 min avec du PBS. </li><li> Fixer des gels par incubation dans une ml de formaldéhyde 4% pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Rincez les constructions 3X avec une solution de blocage contenant 3% (p / v) de BSA et 0,5% (p / v) de Tween dans le PBS. </li><li> Perméabiliser la membrane de 0,25% (p / v) de Triton X dans la solution de blocage pendant 20 min. </li><li> Rincez les constructions 3X avec une solution de blocage. </li><li> Tache de F-actine avec 0,66 g / mL FITC ou rhodamine phalloïdine dans une solution de blocage pendant deux heures à température ambiante. </li><li> Rincez 3x avec une solution de blocage. </li><li> Tache noyaux cellulaires utilisant 0,4 ul / ml DAPI dans du PBS pendant 20 min. </li><li> Rincer avec du PBS 3X. </li><li> Visualisez les cellules en utilisant la microscopie à épifluorescence ou confocal. </li></ol></li><li> Prolifération des cellules dans des gels est communément évaluée en utilisant des analyses disponibles dans le commerce (par exemple, l&#39;ADN total ou le contenu biochimique). PicoGreen est couramment utilisé et sensible d&#39;acide nucléiques fluorescentes tache pour quantifier l&#39;ADN double brin (Singer et al.). Les cellules peuvent également être comptés et normalisée à un nombre de contrôle initial en utilisant les méthodes de visualisation décrit dans l&#39;étape 2. </li><li> Sectionnement et coloration histologique peut aussi être utilisé pour visualiser les cellules et la matrice formée. Le protocole suivant pour la déshydratation et le sectionnement des hydrogels 3D peut être utilisée pour obtenir des tranches transversales sur des lames de verre: <ol class="lalpha"><li> Fixation et la déshydratation <ol class="lroman"><li> Rincez 3X spécimen dans du PBS. </li><li> Correction pour les 5 - 30 minutes dans du paraformaldéhyde 4%. </li><li> Rincez 3X spécimen dans du PBS. </li><li> Incuber l&#39;échantillon dans EtOH à 25 ° C pendant 1 heure à chacune des catégories suivantes EtOH (v / v) sur les concentrations dans l&#39;eau (dans l&#39;ordre): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (A ce point, des échantillons peut être stockée pendant la nuit à 25 ° C). </li></ol></li><li> Compensation et d&#39;infiltration <ol class="lroman"><li> Transfert à 100% Citrisolv pendant 1 heure à 25 ° C, suivie d&#39;une heure à 65 ° C. </li><li> Couper les échantillons en deux avec une lame de rasoir dans une boîte de Pétri de telle sorte que la section transversale de l&#39;échantillon est exposé. </li><li> Transfert à 01h01 mélange de Citrisolv / Micro-cut paraffine pendant 1 heure à 65 ° C. </li><li> Transfert à 100% Micro-coupure de paraffine pendant 1 heure à 65 ° C. </li><li> Transfert à 100% de micro-coupé paraffine nuit à 65 ° C. </li><li> Transfert à 100% Micro-coupure de paraffine pendant 1-2 heures à 65 ° C. </li></ol></li><li> Embedding <ol class="lroman"><li> Spécimen Position dans pelable moule avec de la paraffine à 100%. </li><li> Placer une petite quantité de cire dans le lit de la moisissure, et insérez les deux moitiés de l&#39;échantillon avec la section transversale vers le bas. </li><li> Appliquez dessus morceau de filtre <ol><li> Ajouter la cire supplémentaire pour plonger la pièce supérieure et laisser durcir pendant environ 10 minutes. </li></ol></li><li> Transfert inserts à 4 ° C pour permettre réfrigérateur spécimen à durcir nuit. </li><li> Échantillon peut être la sectioned le jour suivant, généralement au micron d&#39;épaisseur 5-10 par tranche en utilisant microtomes disponibles commercialement. Typiquement le moule pelable est monté à la verticale contre le stade microtome, et les commandes manuelles sont utilisées pour définir l&#39;épaisseur de coupe, trancheuse et l&#39;alignement de l&#39;échantillon avec la lame. </li></ol></li><li> Extraction des ARN L&#39;expression des gènes peut également être évalués quantitativement (par exemple, via en temps réel la réaction en chaîne polymérase (PCR)). Le protocole d&#39;extraction d&#39;ARN à partir d&#39;hydrogels 3D, dont un exemple est donné ci-dessous, est assez différent du cas beaucoup plus simples en 2D. <ol class="lroman"><li> Étiqueter un certifié RNAse tube Eppendorf pour chaque hydrogel 3D et ajouter 500 uL Trizol ® réactif pour chaque tube. </li><li> Utilisez un pilon (broyeur de tissus) à la main broyer les hydrogels jusqu&#39;à ce qu&#39;une solution claire soit obtenue. Assurez-broyeurs différents sont utilisés pour chaque condition. </li><li> Vortex chaque Eppendorf pendant 20 secondes afin d&#39;homogénéiser les échantillons. </li><li> Incuber les échantillons à température ambiante pendant cinq minutes afin de permettre la dissociation complète des complexes nucléoprotéiques. </li><li> Laisser refroidir sur des échantillons de glace pendant 20 min </li><li> Ajouter 200 ul (par ml Trizol) chloroforme pour chaque échantillon et vortex. </li><li> Incuber les échantillons à température ambiante pendant cinq minutes. </li><li> Centrifuger les échantillons à 12000 xg à 4 ° C pendant 15 min. </li><li> Transférer la phase aqueuse (clair couche supérieure) à de nouveaux tubes Eppendorf (en évitant la région interfaciale et inférieure rouge, phénol-chloroforme phase). ARN reste dans la phase aqueuse limpide. </li><li> Techniques communes pour l&#39;isolation de l&#39;ARN et de stockage peut désormais être utilisé. </li><li> Suite à l&#39;extraction d&#39;ARN, des kits disponibles dans le commerce pour la transcriptase inverse et la PCR en temps réel sont souvent utilisés avec quelques modifications (Elisseff et al. Strehin et al.). </li></ol></li></ol></li></ol> Les résultats représentatifs: Voir les figures 2-4 (tel que référencé dans les protocoles ci-dessus) pour obtenir des résultats représentatifs de la visualisation d&#39;hydrogels photopatterned et l&#39;encapsulation des cellules à l&#39;intérieur des gels. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig1_2.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de la procédure d&#39;encapsulation 3D. Schéma étapes correspondent aux titres de section dans les protocoles par étapes. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Hydrogel Photopatterned utilisant séquentielle de polymérisation par addition de type Michael, puis radicale. (A) Schéma de photopatterning d&#39;un hydrogel partiellement réticulé avec incorporation d&#39;un colorant réactif photo. (B) Cercle ou (C) masque de bandes film transparent à motifs hydrogels d&#39;acide hyaluronique. Rhodamine méthacrylatée (MeRho) est constituée uniquement dans les régions du gel qui ont été exposés à la lumière. Barres d&#39;échelle = 100 pm. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Visualisation des cellules dans des hydrogels 3D. Les cellules souches visualisés via (a) microscopie optique ou (b) direct (vert, calcéine AM) et morts (rouge, éthidium homodimère-1) coloration 24 heures suivant l&#39;encapsulation moins 1 million de cellules / ml dans un hydrogel d&#39;acide hyaluronique réticulé par une lumière initiée sans mécanisme radicalaire. Barres d&#39;échelle = 100 pm. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Visualisation des cellules dans des hydrogels 3D. hMSCs colorées pour (a) des cellules vivantes (calcéine AM) ou (b) l&#39;actine cellulaire (rhodamine phalloïdine) et des noyaux (DAPI) cinq jours après l&#39;encapsulation à 1 millions de cellules / ml dans un hydrogel d&#39;acide hyaluronique réticulé par un mécanisme de type Michael ( en utilisant des peptides adhésives pendentif et bifonctionnels réticulants peptide protéolytique dégradable). Barres d&#39;échelle = 100 pm.

<ol>
	<li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation.">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).</li><li>Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Responsive+Synthetic+Hydrogels.">Cell-Responsive Synthetic Hydrogels.</a> Adv Mater. 15, 888-892 (2003).</li><li>Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Photoencapsulation+in+Hydrogels.">Cellular Photoencapsulation in Hydrogels.</a> Culture of Cells for Tissue Engineering. , (2006).</li><li>Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+auricular+chondrocyte+expansion+on+neocartilage+formation+in+photocrosslinked+hyaluronic+acid+networks.">Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks.</a> Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).</li><li>Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+microenvironments+for+controlled+stem+cell+differentiation.">Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).</li><li>Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Mode+Thiol-Acrylate+Photopolymerization+for+the+Synthesis+of+PEG-Peptide+Hydrogels.">Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels.</a> Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-responsive+hydrogel+for+encapsulation+of+vascular+cells.">Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells.</a> Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).</li><li>Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+ECM+Production+by+Cells+Encapsulated+in+Hydrogels.">Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels.</a> Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).</li><li>Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+crosslinking+to+control+cellular+spreading+in+3-dimensional+hydrogels.">Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels.</a> Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).</li></ol>

Les protocoles décrits représentent une méthode simple et puissant pour encapsuler des cellules au sein de l&#39;hydrogel échafaudages de manière cytocompatible. Ces techniques sont particulièrement importantes car terminale différenciées et des cellules souches peuvent présenter un comportement nettement différent dans des microenvironnements 2D contre 3D. Même pour des approches thérapeutiques impliquant l&#39;implantation de matériaux (par exemple, in situ de polymérisation radicalaire), l&#39;encapsulation de cellules et l&#39;analyse de la viabilité et la différenciation peut aider dans le processus de développement matériel. Le processus décrit séquentielle peut être utilisée pour manipuler l&#39;environnement spatialement hydrogel, et le comportement en conséquence cellulaires (voir Khetan et al.). Globalement, l&#39;élément le plus critique des protocoles décrits est l&#39;homogénéité de l&#39;ensemble des solutions utilisées. En particulier, une attention particulière doit être prise pour assurer les cellules sont réparties uniformément dans la solution de prépolymère, et que la solution est bien mélangée par resuspension pipette après addition de la solution de réticulant. Avoir omis de veiller cela peut conduire à l&#39;agglutination des cellules ou des variations locales de la structure de gel et de l&#39;enflure. Alors que les protocoles présentés ici portent essentiellement sur la procédure à suivre pour l&#39;encapsulation des cellules, il est important de noter également que l&#39;encapsulation peut nécessiter une certaine adaptation à des protocoles d&#39;analyse qui sont généralement écrites pour l&#39;ensemencement 2D. Plusieurs exemples ont été illustrés pour la visualisation et l&#39;évaluation des cellules dans des hydrogels.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>I2959</td>
<td>Reagent</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.2 M Triethanolamine Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0449</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14040-117</td>
<td>1x, sterile liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Live/Dead staining kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>L3224</td>
<td>Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-FITC</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine Phalloidin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>R415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D9542</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences</td>
<td>23591</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Citrisolv</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-143975</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-cut paraffin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>24202</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizol reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.22 &mu;m pore size nylon syringe filters</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>09-719C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 mL disposable syringes</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>Cut syringes at consistent height for UV exposure</td>
</tr>
<tr>
<td>Wide orifice pipette tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Exfo Life Sciences Division</td>
<td>S1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>254 nm germicidal UV light source</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Built into most biological safety cabinets</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cellular encapsulation in 3d hydrogels for tissue engineering 

L&#39;encapsulation 3D de cellules dans des hydrogels représente une technique de plus en plus importante et populaire pour la culture de cellules et vers le développement de constructions pour l&#39;ingénierie tissulaire. Cet environnement imite mieux ce que les cellules d&#39;observer in vivo, par rapport à la culture de tissus standard, en raison des propriétés des tissus-like et un environnement 3D. Synthétique hydrogels polymères sont gonflé d&#39;eau des réseaux qui peuvent être conçus pour être stables ou à dégrader par hydrolyse ou protéolyse que le nouveau tissu est déposé par des cellules encapsulées. Une grande variété de polymères ont été explorées pour ces applications, tels que le poly (éthylène glycol) et d&#39;acide hyaluronique. Le plus souvent, le polymère est fonctionnalisé avec des groupes réactifs tels que méthacrylates ou d&#39;acrylates capable de subir une réticulation par divers mécanismes. Dans la dernière décennie, beaucoup de progrès ont été réalisés dans l&#39;ingénierie de ces microenvironnements - par exemple, via l&#39;incorporation physique ou pendentif covalente de signaux biochimiques - pour améliorer la viabilité et le phénotype cellulaire direct, y compris la différenciation des cellules souches encapsulées (Burdick et al.). Les méthodes suivantes pour l&#39;encapsulation de cellules en 3D ont été optimisés dans nos laboratoires et d&#39;autres afin de maximiser cytocompatibilité et minimiser le nombre d&#39;étapes de traitement d&#39;hydrogel. Dans les protocoles suivants (voir Figure 1 pour une illustration de la procédure), il est supposé que les polymères fonctionnalisés capable de subir une réticulation sont déjà dans la main; d&#39;excellentes critiques de la chimie des polymères appliqués au domaine de l&#39;ingénierie tissulaire peut être trouvée ailleurs (Burdick et al.) et ces méthodes sont compatibles avec une gamme de types de polymères. En outre, l&#39;addition de Michael-type (voir Lutolf et al.) Et de la lumière à l&#39;initiative des radicaux libres (voir Elisseeff et al.) Mécanismes axés sur ici ne constituent qu&#39;une petite partie des techniques de réticulation signalés. Réticulation en mode mixte, dans lequel une partie des groupes réactifs est d&#39;abord consommé par réticulation addition et suivi par un mécanisme radicalaire, est un autre paradigme couramment utilisé et puissant pour diriger le phénotype des cellules encapsulées (Khetan et al. Salinas et al.).

Watch this Scientific Journal Video about Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering at JoVE.com

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

Nous présentons des protocoles pour les 3 dimensions (3D) d&#39;encapsulation des cellules à l&#39;intérieur des hydrogels synthétiques. La procédure d&#39;encapsulation est décrite pour les deux méthodes couramment utilisées de réticulation (type Michael addition et la lumière à l&#39;initiative gratuite mécanismes radicale), ainsi qu&#39;un certain nombre de techniques pour évaluer le comportement des cellules encapsulées.

Encapsulation Cellulaire dans les hydrogels 3D pour l&#39;ingénierie tissulaire

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

cellular-encapsulation-in-3d-hydrogels-for-tissue-engineering

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

36.7K vues.  University of Pennsylvania. Nous présentons des protocoles pour les 3 dimensions (3D) d'encapsulation des cellules à l'intérieur des hydrogels synthétiques. La procédure d'encapsulation est décrite pour les deux méthodes couramment utilisées de réticulation (type Michael addition et la lumière à l'initiative gratuite mécanismes radicale), ainsi qu'un certain nombre de techniques pour évaluer le comportement des cellules encapsulées.

Vidéo: Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Approches expérimentales pour le génie tissulaire

Recherche

Biologie

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titre encapsulation cellulaire par des gouttelettes

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Électrofilage treillis polymères fibreux pour l&#39;ingénierie tissulaire et de la culture cellulaire

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these models utilize reconstituted basement membrane derived from animals which contain a variable amount of growth factors and cytokines that can influence the growth of these cell culture models. Here, we describe in detail the preparation and use of PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel that is devoid of animal-derived material and pathogens to encapsulate and propagate the ovarian cancer cell line, OVCAR-5. We begin by describing how to prepare the PuraMatrix prior to use. Next, we demonstrate how to properly mix the PuraMatrix and cell suspension to encapsulate the cells in the hydrogel. Upon the addition of cell culture media or injection into a physiological environment, the peptide component of PuraMatrix rapidly self assembles into a 3D hydrogel that exhibits a nanometer scale fibrous structure with an average pore size of 5-200 nm1. In addition, we demonstrate how to propagate cultures grown in encapsulated PuraMatrix. When encapsulated in PuraMatrix, OVCAR-5 cells assemble into three dimensional acinar structures that more closely resemble the morphology of micrometastatic nodules observed in the clinic than monolayer in vitro models. Using confocal microscopy we illustrate the appearance of representative OVCAR-5 cells encapsulated in PuraMatrix on day 1, 3, 5, and 7 post plating. The use of PuraMatrix to culture cancer cells should improve our understanding of the disease and allow us to assess treatment response in more clinically predictive model systems.

This video demonstrates how to encapsulate and culture cancer cells in PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel.

L&#39;encapsulation des cellules cancéreuses PuraMatrix

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

Étudier les effets de matrice de rigidité sur la fonction cellulaire en utilisant l&#39;acrylamide basée hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un système de culture de cellules épithéliales de l&#39;iris Pigment étudier la régénération Lens Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Comparaison quantitative des Cis-Regulatory Element (CRE) Activités dans transgéniques Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Un système 3D pour les chondrocytes articulaires humains Culture dans le liquide synovial

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

La stimulation mécanique des chondrocytes-agarose hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, the effect of tissue elasticity on cell function is a major area of mechanobiology research because tissue stiffness modulates with disease, development, and injury. Static tissue-mimicking materials, or materials that cannot alter stiffness once cells are plated, are predominately used to investigate the effects of tissue stiffness on cell functions. While information gathered from static studies is valuable, these studies are not indicative of the dynamic nature of the cellular microenvironment in vivo. To better address the effects of dynamic stiffness on cell function, we developed a DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel system (DNA gels). Unlike other dynamic substrates, DNA gels have the ability to decrease or increase in stiffness after fabrication without stimuli. DNA gels consist of DNA crosslinks that are polymerized into a polyacrylamide backbone. Adding and removing crosslinks via delivery of single-stranded DNA allows temporal, spatial, and reversible control of gel elasticity. We have shown in previous reports that dynamic modulation of DNA gel elasticity influences fibroblast and neuron behavior. In this report and video, we provide a schematic that describes the DNA gel crosslinking mechanisms and step-by-step instructions on the preparation DNA gels.

Our laboratory has developed DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels, a dynamic hydrogel system, to better understand the effects of modulating tissue stiffness on cell function. Here, we provide schematics, descriptions, and protocols to prepare these hydrogels.

Préparation de l&#39;ADN réticulé polyacrylamide hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...