Le travail est notre laboratoire est soutenu par des subventions du National Institutes of Health.

Préparation <ul><li> Lamelles doivent être autoclavés. </li><li> Eau distillée stérile ou déminéralisée doit être utilisée pour préparer des solutions et des lamelles à laver. </li><li> AC (40% p / v) et de bis-secteur (1% p / v) solutions sont stérilisées par filtration 0,2 um. Préparer le persulfate d&#39;ammonium à 10% (APS, l&#39;eau 100μg/ml) peu avant l&#39;utilisation et le filtre stérile. Remplacer la solution APS mensuelle. </li><li> Réactifs chimiques tels que 3-APTMS, le chloroforme, glutaradehyde, NHS, et SurfaSil qui ne peuvent pas être autoclavés sont conservés dans une bouteille assigné utilisés uniquement pour la préparation d&#39;hydrogels. </li><li> Pour de meilleurs résultats, les hydrogels devraient être utilisées au sein d&#39;une couple de jours après la nuit d&#39;incubation avec la protéine appropriée ECM. </li><li> Préparer une solution SurfaSil 10% dans le chloroforme (10 ml est généralement suffisant pour 20 lamelles en haut) dans un tube de 50 ml en polypropylène Falcon avant de couler de l&#39;hydrogel. (Notre laboratoire siliconizes habituellement le couvre-dessus lors de l&#39;étape d&#39;incubation glutaraldéhyde 0,5%). Ajouter les lamelles sur le tube de Falcon et de roche pour au moins 10 min. Décanter la solution SurfaSil et l&#39;air sec sur les lamelles Kimwipes dans l&#39;enceinte de sécurité biologique où les hydrogels sera préparé. </li><li> Préparer la solution de BSA inactivée par la chaleur comme suit: a 20 mg / ml, solution d&#39;acides gras libres dans le PBS BSA est incubé dans un bain d&#39;eau à 68 ° C pendant 30 min. La solution est alors filtré stérile et stocké à 4 ° C. </li></ul> Procédure <ol><li> Placez une couche de parafilm sur la moitié inférieure d&#39;un plat de Pétri de 150 mm. </li><li> Placez jusqu&#39;à 9 lamelles de 25 mm sur le dessus du Parafilm et les couvrir avec 1 ml de NaOH 0,1 M. Incuber pendant 3 min, puis aspirer avec une ligne vide. </li><li> Travailler dans une hotte chimique, placer 0,5 ml 3-APTMS sur chaque lamelle. Incuber pendant 3 min, puis aspirer le APTMS. Si vous attendez trop longtemps, une mousse se forme. </li><li> Rincez les lamelles une fois avec 20 ml d&#39;eau désionisée dans le même plat. Retirez les lamelles de l&#39;antenne en utilisant une pince incurvée et de les transférer, avec leur traité côté vers le haut, à un nouveau plat de 150 mm. Lavez les lamelles avec de l&#39;eau déminéralisée à trois reprises, sur la bascule, pendant 10 min à chaque lavage. Si vous n&#39;arrivez pas à supprimer tous les APTMS, il va réagir avec le glutaraldéhyde à l&#39;étape suivante et laissez un précipité blanc laiteux (figure 1). </li><li> Décongeler les glutaraldéhyde (~ 10 min avant utilisation). </li><li> En utilisant des pinces courbes, transférer les lamelles dans un plat propre couches de Parafilm et aspirer tout le liquide restant. Utilisez une ligne vide ou Kimwipe pour éponger l&#39;eau restante, au besoin. </li><li> Couvrir chaque lamelle complètement avec 0,5 ml de glutaraldéhyde à 0,5% dans de l&#39;eau déminéralisée stérile et incuber pendant 30 min dans une hotte chimique. Aspirer le glutaraldéhyde. Rincez et lavez les lamelles comme dans l&#39;étape 4. Sécher les lamelles complètement. [Vous pouvez vous arrêter là et laisser les lamelles pendant plusieurs semaines dans un endroit sec]. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à préparer les hydrogels, utilisez une pince incurvée pour transférer les lamelles, jusqu&#39;à côté réactif, d&#39;une feuille de Parafilm qui a été enregistré sur la surface de l&#39;enceinte de sécurité biologique. Assurez-vous que les lamelles sont à plat sur la surface Parafilm. </li><li> Préparez une solution saturée du NHS dans le toluène. (Dissoudre une petite quantité de NHS en assez de toluène pendant l&#39;expérience particulière. Continuez à ajouter peu à peu jusqu&#39;à ce NHS le NHS ne se dissout plus. La solution saturée est généralement nuageux et rose.) </li><li> Ensuite, préparer l&#39;acrylamide, le bis-acrylamide, l&#39;eau et l&#39;APS pour atteindre le pourcentage d&#39;acrylamide désiré. Ajouter les réactifs dans des microtubes comme indiqué ci-dessous pour un volume total de 0,8 ml. </li><li> Ensuite, une aliquote à un moment, ajoutez le NHS et TEMED à la solution 0,8 ml AC, vortex brièvement et verser immédiatement 3-5 gels en utilisant 140 ul par lamelle dans la hotte de sécurité biologique. Autant que possible, toutes les étapes de ce point devrait être effectué dans une enceinte de sécurité biologique. [Note: des lamelles de tailles différentes peuvent être utilisées en fonction des besoins. Si 18 mm lamelles sont utilisées, l&#39;utilisation ~ 33 ul solution CA par lamelle et une lamelle de 18 mm supérieure siliconée.] <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"><div align="center"> Bis-AC (%) </div></td></tr><tr><td></td><td> 0,3 (rigide) </td><td> 0,15 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 (soft) </td></tr><tr><td></td><td> ul </td><td> ul </td><td> ul </td><td> ul </td></tr><tr><td> Eau </td><td> 402 </td><td> 522 </td><td> 594 </td><td> 618 </td></tr><tr><td> AC </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Bis-AC </td><td> 240 </td><td> 120 </td><td> 48 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> APS</td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> NHS </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td></tr></tbody></table></li><li> Placer rapidement l&#39;siliconé de 25 mm lamelle sur le dessus de chaque gel avant qu&#39;il ne commence à se polymériser. Ajout de la lamelle supérieure doit permettre à l&#39;AC pour couvrir complètement la lamelle du bas. Incuber ce «sandwich» à température ambiante jusqu&#39;à ce que le CA se polymérise. (Vérifiez la solution résiduelle AC dans le tube à centrifuger pour déterminer quand la polymérisation s&#39;est produite. Généralement que quelques minutes pour les gels rigides et un peu plus long pour les doux suffira.). </li><li> Soigneusement ramasser les sandwichs (gants stériles sur!) Et faites glisser la lamelle supérieure jusqu&#39;à ce qu&#39;elle surplombe le gel polymérisé. Vous pouvez alors le soulever hors gel. Si vous attendez trop longtemps avant d&#39;enlever la lamelle supérieure, le gel va déchirer que la lamelle est retirée. </li><li> Jeter la lamelle supérieure. Placez le fond de gel des lamelles (ci-après appelé l&#39;hydrogel) dans des plaques 6 puits avec 2 ml de PBS / puits. PBS peuvent être ajoutés avant ou après le gel-lamelle à chaque puits. Lavez les hydrogels avec PBS à trois reprises, sur une bascule, à 5 min par lavage. </li><li> Répétez les étapes 11 à 14 jusqu&#39;à ce que le nombre requis d&#39;hydrogels ont été préparés. </li><li> Couvrir chaque hydrogel avec 2 ml d&#39;une solution de fibronectine (3 pg / ml dans le PBS) ou de protéines ECM d&#39;autres (voir Klein et al. 13 pour plus de détails.). La protéine ECM devient liée de manière covalente à l&#39;hydrogel pendant une nuit d&#39;incubation à 4 ° C. </li><li> Aspirer la solution d&#39;ECM et de bloquer NHS n&#39;ayant pas réagi avec 1mg/ml inactivé à la chaleur des acides gras libres dans le sérum de BSA-médias libres pendant au moins 30 min à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire. Rincez les hydrogels une fois avec du PBS stérile ou de milieu de culture cellulaire. </li><li> Cellules de la plaque dans le milieu de culture approprié contenant FBS. Le nombre de cellules ensemencées sur l&#39;hydrogel doit être déterminée par l&#39;utilisateur basée sur le degré d&#39;étalement cellulaire et la confluence requis pour l&#39;expérimentation. Environ 10 5 cellules est généralement suffisante pour l&#39;analyse western blot et qPCR. </li><li> Après la période d&#39;incubation, les protéines cellulaires ou ARNm peut être extrait. Les lamelles sont soigneusement retirés du puits en utilisant une pince incurvée et placé (cellule vers le bas) sur le dessus de 100 gouttelettes ul de tampon de lyse qui ont été espacées (2-3cm) le long d&#39;une feuille de parafilm sur la paillasse. (Nous utilisons tampon standard de l&#39;échantillon SDS et TRIzol, respectivement, pour préparer des échantillons pour western blot et d&#39;isoler l&#39;ARN pour qPCR). Incuber les cellules avec le tampon de lyse pour exactement une minute. Retirez les lamelles et le transfert du tampon de lyse à un tube à centrifuger. Sinon, pour l&#39;extraction d&#39;ARN seulement, l&#39;utilisateur peut transférer chaque hydrogel pour un nouveau 6-même assiette et ajouter 1ml de TRIzol / puits. Incuber pendant 3 minutes et retirer la solution pour le stockage dans TRIzol un microtube. </li></ol> Des informations supplémentaires sur les procédures telles que l&#39;immunofluorescence, marquage BrdU, la transfection, etc pour les cellules ensemencées sur des hydrogels est décrite dans Klein et al. 2007 13. Les résultats représentatifs Lavage soigneux des lamelles après addition de APTMS est une étape importante dans la production de «réactive» des lamelles. Si on ne parvient pas à retirer le APTMS complètement, il va réagir avec le glutaraldéhyde à l&#39;étape suivante et de produire un précipité blanc laiteux comme on le voit dans la figure 1A. Figure 1B montre une lamelle correctement lavés et séchés. Si le précipité se développe, toute la procédure doit être recommencé depuis le début que la lamelle n&#39;est plus utilisable. Après la formation d&#39;hydrogel et le revêtement avec des protéines ECM nuit, les cellules peuvent être ensemencées le jour suivant. Comme la figure 2 montre, il ya une nette différence entre les cellules épandage sur des hydrogels raides et douces. Comme peut être vu par coloration phalloïdine dans des fibroblastes de souris embryonnaires (MEF), les cellules réparties à une plus grande mesure sur les raides par rapport aux hydrogels mous. En effet, la plupart des cellules attachant à un hydrogel mou restera compact et attachent moins efficacement. Bien que la morphologie du MEF est montré dans la figure 2, la différence dans la cellule d&#39;épandage est uniforme à travers plusieurs autres lignées cellulaires testées 11-12,14. Les secrets du succès <ol><li> Une fois la procédure est lancée, il est très important de garder les lamelles avec le «réactif» vers le haut et garder à l&#39;esprit de quel côté a été enduit. </li><li> Les gants doivent être portés à tout moment pendant la procédure d&#39;offrir un environnement de travail qui est aussi stérile que possible. </li><li> La plupart des étapes initiales sont effectuées entre une hotte et la table de laboratoire. Toutes les étapes ultérieuresà éliminer l&#39;excès de glutaraldéhyde les lamelles doivent être exécutées sous une enceinte de sécurité biologique. </li><li> En raison de différences dans la cellule d&#39;étalement (figure 2), nous recommandons l&#39;ensemencement du double du nombre de cellules sur des hydrogels mous par rapport aux hydrogels raide. </li><li> Le procédé de polymérisation AC est extrêmement rapide. Pour les utilisateurs de première fois, on peut diminuer la quantité de l&#39;APS ou TEMED dans la solution de prolonger le processus de polymérisation. Ne pas essayer de préparer plus d&#39;un couvre-rares à la fois. </li><li> Dans les études du cycle cellulaire où la synchronisation dans G0 est nécessaire, nous avons l&#39;habitude de sérum affamer les cellules dans des boîtes de culture en plastique, trypsiniser les cellules et les réensemencer sur les hydrogels de conformités différente en présence de mitogènes (FBS et / ou facteurs de croissance). Cette procédure garantit que la population de départ de G0-synchronisés cellules est identique dans tous les échantillons. Cependant, de nombreuses études de transduction du signal, la période de stimulation mitogène requise ne peut être suffisamment longue pour permettre l&#39;attachement et la propagation des cellules. Dans ce cas, nous sérum affamer les cellules sur les hydrogels et ensuite directement les stimuler avec des mitogènes. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1a.jpg" alt="Figure 1a" /> Figure 1A. Mal lavés lamelle. Après ajout de APTMS, lamelle a été lavé pendant 1-2 minutes avant l&#39;addition de la solution de glutaraldéhyde. Un précipité se forme sur la lamelle qui n&#39;a pas été lavés selon les étapes décrites dans la procédure. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1b.jpg" alt="Figure 1b" /> Figure 1B. Correctement lavés lamelle. Après l&#39;addition des APTMS, lamelle a été lavé trois fois de 10 minutes chacune, avant addition de la solution de glutaraldéhyde. Aucun précipité se forme sur la lamelle. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Morphologie des cellules sur des hydrogels de différentes raideurs. Établie FAE ont été ensemencées sur fibronectine revêtement hydrogels de rigidité élevée ou basse pendant 9 heures. Après la période d&#39;incubation, les cellules ont été fixées, perméabilisées et colorées avec FITC-phalloïdine qui se lie à la F-actine. FAE sur des gels présentent une grande rigidité des fibres de stress et sont bien réparties par rapport à celles ensemencées sur les hydrogels faible rigidité. Barre d&#39;échelle = 50 microns. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Représentant la PCR quantitative raison des niveaux de la cycline D1 souris ARNm. Sérum fibroblastes de souris affamée embryonnaires ont été plaquées sur élevé (3% d&#39;acrylamide) ou faible rigidité des hydrogels (0,3% d&#39;acrylamide) et stimulées avec du FBS à 10% pour 9 heures. Suite à l&#39;extraction d&#39;ARN, analyse en temps réel de PCR quantitative a été réalisée pour D1 niveaux d&#39;ARNm cycline (normalisée à l&#39;ARN 18S). G0 représente cycline D1 ARNm de cellules quiescentes. Niveaux d&#39;ARNm cycline D1 augmenter de manière significative sur les hydrogels raides mais pas sur des hydrogels mous. Données sont des moyennes + / - SD de réactions PCR en double.

<ol>
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Un élément crucial du processus de polymérisation hydrogel est d&#39;éviter la formation de bulles d&#39;air qui permettent aux cellules de se lier à la lamelle de verre plutôt que l&#39;hydrogel ECM revêtement lui-même. Ceci peut être évité en prenant soin de pipetage la solution de polymérisation après vortex et visuellement en s&#39;assurant qu&#39;aucune bulle d&#39;air sont devenus piégés dans le gel. Nous recommandons toujours la préparation supplémentaires &quot;réactive&quot; des lamelles et de...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glutaraldehyde, 70%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G7776</td>
<td>Store at -20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>281778</td>
<td>Store at room temperature</td>
</tr>
<tr>
<td>SurfaSil Siliconizing Fluid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>42800</td>
<td>Store at room temperature</td>
</tr>
<tr>
<td>NHS (N-hydroxysucinimide Ester)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A-8060</td>
<td>Store at 4&deg;C Replace monthly</td>
</tr>
<tr>
<td>Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A6003-100G</td>
<td>Store at 4&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Coverslips (25mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-86 25 Cir 1D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (18mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-84 18 Cir 1D</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels

La rigidité des tissus est un déterminant important de la fonction cellulaire, et des changements dans la rigidité des tissus sont couramment associés à la fibrose, le cancer et les maladies cardiovasculaires 1-11. Des approches traditionnelles de cellules biologiques à l&#39;étude de la fonction cellulaire impliquent la culture de cellules sur un substrat rigide (plats en plastique ou en lamelles de verre) qui ne peuvent pas rendre compte de l&#39;effet d&#39;un ECM élastique ou les variations de la raideur d&#39;ECM entre les tissus. Pour le modèle in vivo les conditions de conformité des tissus in vitro, nous et d&#39;autres utilisent ECM enduits hydrogels. Dans notre laboratoire, les hydrogels sont à base de polyacrylamide qui peut imiter la gamme de tissus conformités vu biologiquement 12. «Réactive» lamelles sont générés par une incubation avec NaOH suivie par l&#39;addition de 3-APTMS. Le glutaraldéhyde est utilisé pour réticuler la 3-APTMS et le gel de polyacrylamide. Une solution d&#39;acrylamide (AC), le bis-acrylamide (Bis-AC) et le persulfate d&#39;ammonium est utilisé pour la polymérisation de l&#39;hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) est incorporé dans la solution CA pour réticuler ECM de protéines pour l&#39;hydrogel. Après la polymérisation de l&#39;hydrogel, la surface du gel est recouvert d&#39;une protéine d&#39;ECM de choix tels que la fibronectine, vitronectine, collagène, etc La rigidité d&#39;un hydrogel peut être déterminé par la rhéologie ou la microscopie à force atomique (AFM) et ajustée en faisant varier le pourcentage de CA et / ou le bis-AC dans la solution 12. De cette manière, la rigidité du substrat peut être adaptée à la rigidité des tissus biologiques qui peuvent également être quantifiés à l&#39;aide de rhéologie ou AFM. Les cellules peuvent ensuite être ensemencées sur ces hydrogels et cultivée en fonction des conditions expérimentales nécessaires. Imagerie des cellules et leur récupération pour l&#39;analyse moléculaire est simple. Pour cet article, nous définissons des substrats souples que ceux ayant modules d&#39;élasticité (E) &lt;3000 Pascal et substrats rigides / tissus comme ceux avec E&gt; 20 000 Pascal.

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Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

L&#39;effet de la rigidité des substrats sur la fonction cellulaire peut être modélisé<em&gt; In vitro</em&gt; En utilisant des hydrogels de polyacrylamide de différentes conformités.

Étudier les effets de matrice de rigidité sur la fonction cellulaire en utilisant l&#39;acrylamide basée hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

studying-effects-matrix-stiffness-on-cellular-function-using

Research

JoVE Journal

Biology

21.9K vues.  University of Pennsylvania. L'effet de la rigidité des substrats sur la fonction cellulaire peut être modélisé In vitro En utilisant des hydrogels de polyacrylamide de différentes conformités.

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Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Encapsulation Cellulaire dans les hydrogels 3D pour l&#39;ingénierie tissulaire

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Recherche

Biologie

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Mesure de la rigidité à la flexion des cellules bactériennes utilisant un piège optique

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

Identifier les effets des mutations du gène BRCA1 sur la recombinaison homologue en utilisant les cellules qui expriment endogène de type sauvage du gène BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Analyse de la fonction des petites GTPases par micro-injection de plasmides dans les cellules épithéliales polarisées

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

Visualisation de la fonction respiratoire mitochondriale utilisant Cytochrome C Oxydase / succinate déshydrogénase (COX / SDH) Double-histochimie étiquetage

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Création d&#39;environnements gazeux définies pour étudier les effets de l&#39;hypoxie sur la<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Mesurer les effets des bactéries sur<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportement aide d&#39;un test de rétention d&#39;oeufs

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Analyse de la fonction des cellules bêta à l’aide d’imagerie calcique résolution unicellulaire dans les îlots de poisson-zèbre

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights the need to better understand the molecular mechanism involved in adipocyte dysfunction to develop new therapies against obesity-related diseases. Modulating the expression of proteins and micro-RNAs in adipocytes remains highly challenging. This paper describes a protocol to differentiate murine fibroblasts into mature adipocytes and to modulate the expression of proteins and micro-RNAs in mature adipocytes through reverse-transfection using small-interfering RNA (siRNA) and micro-RNA mimicking (miR mimic) oligonucleotides. This reverse-transfection protocol involves the incubation of the transfection reagent and the oligonucleotides to form a complex in the cell culture plate to which the mature adipocytes are added. The adipocytes are then allowed to reattach to the adherent plate surface in the presence of the oligonucleotides/transfection reagent complex. Functional analyses such as the study of insulin signaling, glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis can be performed on the transfected 3T3-L1 mature adipocytes to study the impact of protein or micro-RNA manipulation on adipocyte function.

Presented here is a protocol to deliver oligonucleotides such as small-interfering RNA (siRNA), micro-RNA mimics (miRs), or anti-micro-RNA (anti-miR) into mature adipocytes to modulate protein and micro-RNA expression.

Un modèle de culture de cellules adipocytaires pour étudier l’impact de la modulation des protéines et des micro-ARN sur la fonction des adipocytaires

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...