La recherche a été soutenue par le Prix Wallace H. Coulter Fondation en début de carrière dans la recherche translationnelle. Merci à Tim Andrews, Hématologie / oncologie pédiatrique, pour aider à la collecte de l&#39;échantillon sanguin. Aussi, grâce à Dr Sam Wellhausen, Core cytométrie en flux, James Graham Brown Cancer Center, pour les aider à exploiter des échantillons par cytométrie en flux.

Partie 1. Fabrication de dispositifs microfluidiques Un moule maître de silicium de l&#39;appareil lyse microfluidique a été créé en utilisant des techniques de photolithographie avec l&#39;équipement de l&#39;Université de Louisville salle blanche [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc, San Rafael, Californie) a été utilisée pour générer un masque de transparence (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) pour créer des répliques négatives des canaux. L&#39;appareil a été fabriqué lyse microfluidique de la moule maître de silicium en utilisant des techniques de lithographie molle avec l&#39;élastomère (diméthylsiloxane) poly (PDMS; Dow Corning, Midland, MI). L&#39;élastomère avec les canaux reproduits a été libéré, et les trous d&#39;accès au canal ont été perforé avec une aiguille de calibre 20 (petites pièces, Miramar, en Floride.). La plaquette a été irréversiblement PDMS collés sur une lame de verre par plasma d&#39;oxygène et testée pour l&#39;expérimentation. Partie 2. Protocole pour la course dispositif de lyse Après le dispositif microfluidique a été fabriqué et testé, les expériences avec lyse des globules rouges sont prêts à commencer. La section suivante détaille le protocole pour le dispositif microfluidique. 2.1 Prélèvement des échantillons <ol><li> Recueillir 4 millilitres de l&#39;échantillon de sang de la veine cubitale médiane, sur la veine avant-bras antérieur du patient avec l&#39;héparine comme anticoagulant chez les deux 2 ml verte vaccutainers haut. </li><li> Jeter les 2 premiers ml tube car il contient des cellules endothéliales matures délogé (faux positifs). </li><li> Reprendre le deuxième tube pour mélanger avec du sang héparine en tournant haut et en bas; enregistrer immédiatement sur la glace. </li><li> Transférer 1 ml de sang dans un tube de 1,5 ml Eppendorf. Traiter les échantillons de sang immédiatement (moins d&#39;une heure de la collecte). </li></ol> 2.2 dispositif de Premier microfluidiques avec PBS <ol><li> Procurez-vous un dispositif microfluidique collé au verre. Press-Fit tube d&#39;accès (petites pièces, Miramar, Floride) de diamètre légèrement plus grand dans les entrées et de sortie (figure 1). </li><li> Fixer une aiguille de seringue de calibre 30 (petites pièces, Miramar, Floride) pour le tuyau sur chacun des bras de mer, offrant la macro à l&#39;interface micro. </li><li> Remplir une seringue de 1 ml avec du PBS 1X et veillez à vous débarrasser des bulles en feuilletant l&#39;aiguille de la seringue. Branchez le PBS-chargé seringue de 1 mL d&#39;entrée 1 sur le dispositif microfluidique. Poussez la seringue contenant le PBS 1X doucement par la main jusqu&#39;à ce que la solution coule de l&#39;entrée 2, puis immédiatement pince entrée 2 avec un clip liant de bureau standard </li><li> Continuez à pousser le PBS 1X que le liquide atteint le port de sortie du dispositif microfluidique. Une fois la solution coule de la sortie, serrer le tube de sortie avec un autre clip liant. </li><li> Continuez à pousser la seringue de 1 ml de PBS 1X jusqu&#39;à ce que le sort de l&#39;entrée 3, et pince l&#39;entrée 3 de port avec un autre clip liant bureau. Le dispositif microfluidique est maintenant complètement amorcée. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Schéma du dispositif montrant les entrées pour les solutions respectives et à la sortie. 2.3 Préparation des pompes à seringues et de la solution <ol><li> Pour calibrer les pompes procédez comme suit: <ol class="lalpha"><li> Pour la pompe seringue Harvard grande (Harvard, PHD 22/2000 Partie # 702000): Définir la configuration de diamètre pour 22,5 mm, débit 600 l / min. </li><li> Pour la pompe seringue Harvard petits (Harvard, ainsi qu&#39;une partie de Pico # 702213): Définir la configuration de diamètre pour 4,61 mm, débit 20 l / min. </li></ol></li><li> Remplissez un seringue de 30 ml avec de l&#39;eau déminéralisée stérile. Ceci peut être accompli en retirant la solution directement sur le tube conique de 50 ml. (Label de la seringue) </li><li> Remplir une seconde seringue de 30 ml avec 2X tampon phosphate salin (PBS), 2% de paraformaldéhyde (PFA) en utilisant la procédure décrite dans l&#39;étape 9. (Label de la seringue) </li><li> Remplir une seringue de 1 ml avec du PBS 1X de la aliquotes stockées dans les 15 ml tubes coniques, en utilisant la procédure décrite dans l&#39;étape 9. </li><li> Connectez la seringue de 30 ml d&#39;eau déminéralisée à l&#39;entrée 2 et le 30 ml de PBS 2X seringue à l&#39;entrée 3 (assurez-vous d&#39;enfiler bulles piège t dans le tube ou d&#39;un dispositif microfluidique). Retirez la pince de criques 2 et 3 et le tube de sortie. Branchez le PBS 1X ml 1 seringue dans l&#39;entrée 1. Évitez d&#39;introduire des bulles en remplissant le aiguille de la seringue avec le liquide, reliant la seringue, et en tapotant l&#39;aiguille de la seringue pour débarrasser des bulles. </li></ol> 2,4 lyse des globules rouges <ol><li> Régler toutes les seringues sur les pompes à Harvard, telles que décrites ci-dessous: <ol class="lalpha"><li> Réglez les deux seringues 30 ml (un contenant stérile, de l&#39;eau déminéralisée et l&#39;autre avec 2X PBS, 2% PFA), ainsi que sur la pompe à Harvard grosse seringue. </li><li> Régler la seringue de 1 ml (contenant du PBS 1X) sur la pompe à Harvard petite seringue. </li><li> Placez le tuyau d&#39;écoulement dans un collecteur de déchets (50 ml tube conique qui est étiqueté wASTE). </li></ol></li><li> Mettez la pompe à Harvard grosse seringue (avec les 30 seringues ml) et le laisser fonctionner pendant une minute. (Assurez-vous qu&#39;il n&#39;ya pas de bulles et aucune fuite dans l&#39;appareil ou dans le tube). </li><li> Mettez la pompe à Harvard petite seringue et le laisser fonctionner pendant une minute supplémentaire. (Assurez-vous qu&#39;il n&#39;ya pas de bulles et aucune fuite dans l&#39;appareil ou dans le tube). L&#39;arrêt des pompes. Le dispositif microfluidique est maintenant prêt à être utilisé. </li><li> Retirez la seringue de 1 ml contenant du PBS 1X de la pompe Harvard petite seringue. </li><li> Après l&#39;obtention d&#39;un échantillon de sang, remplir la seringue de 1 ml à 0,05 ml de solution stérile PBS 1X, sans piégeage des bulles. Ensuite, remplir la seringue avec 0,5 ml de sang provenant du tube Eppendorf. (La seringue de 1 ml contient maintenant un volume final de 0,55 ml de sang et 1X tampon PBS.) Remarque: Conserver la seringue verticale pendant le remplissage pour éviter de mélanger du PBS 0,05 ml avec le sang. </li><li> Connectez la seringue contenant le sang à l&#39;entrée 1 et monter la seringue avec précaution (éviter de pousser le sang à travers le tube dans l&#39;appareil) sur la pompe à Harvard petite seringue (la seringue est monté verticale dans la pompe). </li><li> Retirez le tube de sortie du tube de déchets et de mettre un tube à centrifuger de 50 ml propres à sa place et le mettre sur un seau de glace. </li><li> Mettez la pompe Harvard grosse seringue premier et le laisser fonctionner pendant 1 minute. Commencer à recueillir l&#39;échantillon de la sortie dans le tube à centrifuger de 50 ml. </li><li> Mettez la pompe Harvard petite seringue. </li><li> Une fois l&#39;échantillon de sang dans la seringue de 1 ml a complètement traversé le périphérique, arrêter les deux pompes. Cela devrait prendre environ 20 minutes. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon recueilli pendant 5 minutes à 350 xg à température ambiante avec l&#39;arrêt de frein. </li><li> Retirer le surnageant en plaçant la pointe de pipette sur le côté opposé de la pastille blanche. Retirer le surnageant que possible, les débris cellulaires surtout le rouge, sans perturber le culot blanc. </li><li> Resuspendre l&#39;échantillon dans 1 ml de tampon de flux (PBS 1X, 1% de BSA [albumine sérique bovine], 2% PFA) par aspiration et refoulement. Transférer l&#39;échantillon à un tube Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Microcentrifugeuse l&#39;échantillon recueilli pendant 5 minutes à 4 xg à température ambiante. Utilisez même précision que, avant d&#39;enlever le surnageant. </li><li> Resuspendre l&#39;échantillon dans 1 ml de tampon de flux par vortex. </li></ol> 2.5 Préparation pour l&#39;analyse par cytométrie en flux <ol><li> Pour l&#39;analyse de l&#39;échantillon en utilisant la cytométrie de flux, ajouter 100 ul d&#39;échantillon dans un tube de cytométrie en flux. </li><li> Pour l&#39;ul 100 de l&#39;échantillon ajouter des anticorps spécifiés (veiller à la bonne concentration). </li><li> Laisser l&#39;échantillon à incuber pendant 30 minutes à 40 ° C. </li><li> Laver deux fois avec le tampon de flux avant de la cytométrie de flux. Étape de lavage comprend l&#39;ajout de 250 ul de tampon de flux, vortex, centrifuger pendant 5 minutes à 350 xg, et enlever le surnageant avec un tour du fluide du tube de cytométrie en flux. </li><li> Reprendre le culot dans 250 ul de tampon de flux. L&#39;échantillon est prêt pour l&#39;analyse par cytométrie en flux. </li></ol> Les résultats représentatifs Le sang entier a été exécuté à travers le dispositif microfluidique lyse et de post-traitement de protocole, débarrassant des érythrocytes et enrichissante circulant cellules nucléées (CNC). Idéal résultats donneront une parcelle de débit propres cytométrie de dispersion avec les populations CNC séparée. Affiché en dessous dans les figures 2 et 3 sont des comparaisons diagramme de dispersion d&#39;un échantillon de sang total, sans lyse des érythrocytes et avec lyse des globules rouges par le protocole microfluidiques avec des haches en diffusion vers l&#39;avant (FSC) par rapport à diffusion latérale (SSC) de lumière. On peut voir que le protocole d&#39;enrichissement microfluidique est nécessaire d&#39;obtenir une parcelle de débit propres cytométrie de dispersion. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Nuage de cytométrie en flux d&#39;échantillon de sang total, sans lyse des globules rouges avec le FSC et les axes de la SSC. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Nuage de cytométrie en flux de circulation de cellules nucléées avec une lyse des érythrocytes microfluidique étiquetés par les populations avec le FSC et les axes de la SSC. Région 1 (rouge) représente les lymphocytes, la Région 2 (vert) représente les monocytes, la Région 3 (bleu) représente les granulocytes, et de la Région 4 (violet) n&#39;a pas encore été caractérisés. Enlèvement de débris de globules rouges à la pipette dans le protocole est également important lorsque cela est nécessaire. Ci-dessous à la figure 4 est un diagramme de dispersion montrant un excédent de débris de globules rouges. Bien que non opacification le nuage de points comme dans la figure 2, on doit tenir compte des événements ajoutée due aux débris érythrocytaires pendant l&#39;analyse des données. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Nuage de cytométrie en flux montrant les débris de globules rouges, considéré comme un pôledes événements dans la région 5 (cyan). Cellules de coloration pour certains marqueurs phénotype d&#39;anticorps seront également de générer des résultats caractéristique. Dans les figures suivantes sont des taches phénotype anticorps pour trois populations leucocytaires distincts: les lymphocytes, des monocytes et des granulocytes. La figure 5 montre populations lymphocytaires comploté avec les axes CD3 et CD4. Les monocytes et les granulocytes sont présentés aux figures 6-7 avec axes comme le FSC par rapport CD14 et CD66b, respectivement. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Nuage de points représentant la cytométrie de flux avec des lymphocytes CD3 et CD4 axes. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6. Nuage de la cytométrie de flux illustrant les monocytes avec le FSC et CD14 axes. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig7.jpg" alt="Figure 7" /> Figure 7. Nuage de la cytométrie de flux illustrant les granulocytes avec le FSC et les axes CD66b.

<ol>
	<li>White, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+microfluidic+leukocyte+enrichment+protocol+in+mild+phenotype+sickle+cell+disease+(SCD.">Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD.</a> Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).</li><li>Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Flow+Microfluidic+Device+for+Rapid+Erythrocyte+Lysis.">Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis.</a> Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).</li></ol>

Un protocole de microfluidique automatisée lyse de sang n&#39;a été rapporté. Dans le protocole sont des étapes importantes à noter. Dans la section P.2.1, il est important de jeter le flacon de sang recueillies pour la première que l&#39;échantillon contient des cellules endothéliales matures délogé agissant comme de faux positifs. De plus, assurez-vous d&#39;exécuter l&#39;échantillon de sang dans l&#39;heure de la collecte. Amorçage du dispositif microfluidique dans la section P.2.2, il est important de...

automated microfluidic blood lysis protocol for enrichment of circulating nucleated cells

Dans ce rapport, le protocole d&#39;un dispositif automatisé de sang microfluidique lyse est détaillée. Circulants des cellules nucléées (CNC), y compris les leucocytes et les cellules endothéliales, de fournir une plateforme idéale pour une mise à jour le statut de la condition immunitaire d&#39;un individu. Le protocole permet microfluidique pour l&#39;enrichissement de CNC, sans perte de cellules sélectives et de la variabilité due à la préparation d&#39;échantillons par l&#39;utilisateur médiation étapes. Brièvement, le protocole comprend la fabrication de dispositifs, de la collecte de l&#39;échantillon, configuration de l&#39;appareil, et courir le sang dans la chambre microfluidique. Dans le dispositif de sang total est rapidement mélangé avec de l&#39;eau déminéralisée pendant environ 10 secondes dans un canal de 50 microns x 150 microns microfluidique. En ce moment érythrocytes sont lysés durée en raison des conditions hypotoniques. Structures chevrons sur le fond du canal d&#39;assurer un mélange complet et l&#39;exposition des cellules à un environnement constant. Cellules restantes sont retournés aux conditions isotoniques à la sortie de l&#39;appareil, fixe à l&#39;aide de paraformaldéhyde à 2%, centrifugé pour séparer les débris érythrocytaires du CNC, et en suspension dans du tampon de flux pour la coloration et l&#39;analyse par cytométrie en flux. Les résultats montrent propres parcelles de cytométrie en flux de dispersion avec les populations CNC sauvé. Signification de ce dispositif et le protocole vient à l&#39;étude et la compréhension de la pathogenèse de la maladie par l&#39;analyse des populations de CNC. Ainsi, l&#39;automatisation, l&#39;efficacité et la simplicité du protocole de microfluidique sont démontrés.

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Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Un dispositif automatisé microfluidique a été développé pour faire circuler l&#39;enrichissement de cellules nucléées du sang périphérique via lyse des globules rouges qui assure l&#39;isolement de l&#39;échantillon de haute qualité sans perte de cellules.

Automated Protocole microfluidiques lyse du sang pour l&#39;enrichissement de cellules circulantes nucléées

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

automated-microfluidic-blood-lysis-protocol-for-enrichment

Research

JoVE Journal

Biology

12.3K vues.  University of Louisville. Un dispositif automatisé microfluidique a été développé pour faire circuler l'enrichissement de cellules nucléées du sang périphérique via lyse des globules rouges qui assure l'isolement de l'échantillon de haute qualité sans perte de cellules.

Vidéo: Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Enrichissement des cellules NK du sang humain avec le Kit de RosetteSep StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Recherche

Biologie

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidiques Co-culture de cellules épithéliales et des bactéries d&#39;enquête sur les Soluble signal médiée par des interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Protéines immunofluorescence Analyse des endogènes et exogènes Centromere-kinétochoriens

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

L&#39;utilisation des dispositifs microfluidiques pour mesurer et cellulaire Lifespan dans Phenotypes simples cellules de levure de bourgeonnement

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocole pour l’utilisation de gènes série d’analyses d’enrichissement pour identifier le modèle Animal approprié de recherche translationnelle

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

Isolement des CD4+ T-cellules et analyse de circulation folliculaire T Helper (cTfh) des sous-ensembles de cellules de sang périphérique à l’aide 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Isolement et enrichissement des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires humaines pour la culture organoïde

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a problem for physicians and researchers. This manuscript describes a simple and effective method to monitor immune rejection in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. Circulating DNA is a potentially non-invasive biomarker for organ damage. In this study, circulating pig-specific DNA (cpsDNA) was monitored during xenograft rejection by quantitative real-time PCR (qPCR). In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Species-specific primers were then used to quantify cpsDNA by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. The value of this method suggests that it can be used as a simple, convenient, low cost, and less invasive method to monitor the immune rejection of xenotransplantation.

In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Using species-specific primers, cpsDNA was quantified by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models.

Quantification de l’ADN spécifique du porc circulant dans le sang d’un modèle de xénotransplantation

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...