Les auteurs tiennent à souligner la contribution technique de Gloria Benavides A. Ce travail a été soutenu par l&#39;American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), les complications diabétiques NIDDK Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) DK076169 de subvention (sous-subvention sur écran), et le P30 DK079337 O&#39;Brien Center (sur écran).

Tous les protocoles décrits dans ce manuscrit pour la collecte de sang, l&#39;isolement et l&#39;analyse ont été examinés et approuvés par le comité d&#39;examen institutionnel de l&#39;Université d&#39;Alabama à Birmingham. Une. Isolement cellulaire (modification de Protocole Sigma-Aldrich Histopaque n ° 1119 et Miltenyi Biotec microbille positive et les protocoles de sélection négative) <ol><li> sang total Centrifugeuse (recueillies dans ACD ou tubes EDTA) à 500 g pendant 15 min dans une centrifugeuse avec un rotor oscillant-seau (accélération = 5-6, et pas de frein). </li><li> Enlever la couche supérieure qui contient le plasma riche en plaquettes (PRP) avec une pipette de transfert jusqu&#39;à 1 cm reste au-dessus de la couche cellulaire (manteau érythrocytes / leucocytaire). Mettez de côté le PRP à la température ambiante pour un traitement ultérieur. </li><li> Transférer la couche leuco-plaquettaire à un 50 ml tube conique stérile, diluer à 24 ml avec de base RPMI ou au moins 4x le volume de départ de la couche leuco-plaquettaire. Remarque: La moitié supérieure de la couche de RBC peuvent have être inclus, bien que cela se traduira par l&#39;augmentation du volume du milieu RPMI proportionnellement. </li><li> Préparer le gradient de densité en utilisant une faible densité de Ficoll ayant une densité de 1,077 (1,077) pour la couche supérieure et Ficoll à haute densité ayant une densité de 1,119 (1,119) pour la couche inférieure dans trois tubes de 15 ml coniques (3 ml chacune). Pour effectuer cette étape, tout d&#39;abord ajouter 1,077 à chaque tube. L&#39;utilisation d&#39;un 5 ml pipette étroite ajouter 1119 au fond du tube en plaçant la pointe de la pipette sous 1077 et relâchez lentement le réactif sans mélange avec le gradient supérieur. Un total de 6 ml de milieu à gradient de densité doit être présent à ce stade avec une phase visible de la séparation à la marque 3 ml. </li><li> Utilisation d&#39;une pipette automatique, ajouter 8 ml de sang dilué (de l&#39;étape 1.3) doucement chaque tube gradient en utilisant le réglage de faible puissance pour éviter de perturber les couches de gradient. Le volume total devrait être de 14 ml à cette étape. </li><li> Tubes à centrifuger à 700 g pendant 30 min à température ambiante (Acceleration 6, pas de frein). Note: A ce stade, les trois bandes distinctes de cellules devraient être évidents (Figure 1A). Les bandes supérieures (entre 1077 et plasma) contient des cellules mononucléaires (MNC) et les plaquettes, et la bande du milieu (entre 1007 et 1119) contient des cellules polymorphonucléaires (PMN) et la bande inférieure (ci-dessous 1119) contient des globules rouges. </li><li> Recueillir le MNC et PMN séparément à l&#39;aide de pipettes en verre stériles sans déranger les autres groupes de cellules. Combiner la population MNC de chaque tube dans un tube conique de 50 ml stérile. Répétez cette opération pour la population PMN ainsi. </li><li> Ajouter 4 volumes de RPMI à chaque tube contenant les fractions et MNC PMN respectivement pour diluer le gradient de densité. </li><li> Tubes à centrifuger à 700 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension MNC culot cellulaire et PMN culot cellulaire dans 1 ml de RPMI contenant 0,5% ultra-pure gras sans acide BSA (RPMI-BSA) et de les transférer à stériles tubes de 1,5 ml. Pellet les cellules en utilisant un picofuge de paillasse pour 30sec. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 80 ul de milieu RPMI-BSA. </li><li> Ajouter 20 ul de billes magnétiques-anticorps marqué antiCD14 dans le tube contenant la fraction MNC pour une sélection positive des monocytes. Pour le tube contenant la fraction de cellules PMN, ajouter 20 ul de billes magnétiques-anticorps marqué antiCD15 pour la sélection positive de cellules neutrophiles. Incuber chaque suspension de cellules pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Laver chaque suspension de cellules avec 1 ml de milieu RPMI-BSA et un culot comme précédemment et remettre en suspension chaque culot dans 500 ul de RPMI-BSA. </li><li> Les cellules marquées sont séparées dans le champ magnétique de la cellule activée tri magnétique (MACS) séparateur. Préparer les colonnes MACS LS (une pour chaque suspension de cellules) en plaçant la colonne de séparation MACS et lavage avec 3 ml de RPMI-BSA avant l&#39;ajout de la suspension de cellules. </li><li> Après l&#39;application de suspensions cellulaires, laver chaque colonne 3x avec 3 ml de RPMI-BSA médias (assurez-vous de laisser le drai des médiasn complètement entre les lavages). Recueillir la suspension cellulaire accréditive et lavages de colonne dans un tube stérile. </li><li> Pour isoler les monocytes et les neutrophiles, retirer la colonne du champ magnétique après le lavage final et éluer les cellules sélectionnées positivement dans un tube stérile avec 5 ml de RPMI-BSA en utilisant le piston de la colonne. </li><li> Pour isoler les lymphocytes granulés la fraction accréditives lavage des multinationales de l&#39;étape 1.15 à 300 g pendant 10 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 80 ul de milieu RPMI-BSA. Ajouter 20 ul d&#39;anticorps CD61 et CD235a et incuber la suspension de cellules pendant 15 min à 4 ° C. Répétez la séparation MACS comme avant et collecter le flux mais contenant les lymphocytes. </li><li> Pour sédimenter les monocytes, les neutrophiles et les lymphocytes fractions, centrifugeuse avant (étape 1.9) et jeter les surnageants. Les culots cellulaires devraient être remises en suspension dans 1 ml extracellulaires flux médias (XF-DMEM) pour le comptage. &lt;br /&gt; Note: 8 ml de sang entier doivent aboutir à 1-5 x 10 6 monocytes / ml et 5-20 x 10 6 lymphocytes et des neutrophiles / ml. </li><li> Pour isoler les plaquettes, centrifugeuse PRP (étape 1.2) pour les 8-10 min à 1500 xg à température ambiante. Retirez le plasma et laver culot cellulaire une fois avec 5 ml stériles PBS additionné de 1 pg / ml PGI 2, repellet et suspendre culot final dans 1 ml de tampon PBS-PGI 2. </li><li> Déterminer la numération plaquettaire par turbidimétrie une fois que les plaquettes sont mises en suspension dans du tampon PBS-PGI 2 par spectrophotomètre tel que décrit par Walkowiak et al en utilisant l&#39;équation suivante: [6,23 / (2,016 - Abs 800)] - 3,09 x facteur de dilution = # x 10 8. plaquettes / ml 12. </li></ol> 2. Placage des cellules <ol><li> Préparation de Cell-Tak (adhésif de cellule): Ajouter adhésif de cellule de 90 pi à 180 pi diH 2 0, 540 ul de 0,1 N bi de sodiumcarbonate (pH 8,0), et ajuster le pH à 7.2 à 7.8 à l&#39;aide de NaOH 1 N. Préparer plaques XF (24 puits, V7 microplaques) en revêtant chaque puits avec 30 pi de colle cellulaire préparé. Remarque: L&#39;adhésif de cellule doit être préparé pour chaque utilisation. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant 20-30 minutes, puis colle cellule d&#39;aspiration et laver les puits avec du PBS deux fois (1 ml / puits). </li><li> Effectuer un comptage de cellules sur les monocytes isolés, des lymphocytes, des neutrophiles et des plaquettes et amener au volume approprié à l&#39;aide XF-DMEM à permettre à une densité de semis de 250 k cellules / puits pour les monocytes, les lymphocytes et les neutrophiles, et 25 x 10 6 / puits pour les plaquettes. Sinon, pour mesurer la réponse de burst oxydatif, les neutrophiles peuvent être ensemencées à 125K cellules / puits. Le volume d&#39;ensemencement final de chaque suspension cellulaire doit être de 200 pl / puits. </li><li> Centrifuger la plaque à 200 g pendant 1 sec sans frein. Faites pivoter la plaque de 180 ˚ et centrifuger à nouveau sans frein à 300 x g. </li><li> Apportez ainsi finale volume à 660 pi avec XF-DMEM et incuber à 37 º C pendant 30 minutes avant l&#39;essai XF. Remarque: Des microphotographies de cellules étalées, avant et après le test peut être utilisé pour assurer le placage adéquate et écarter le détachement des cellules. </li></ol> 3. Préparation d&#39;un 24 puits extracellulaire Flux Essai Plate (XF24) <ol><li> Hydrate XF sonde avec une solution d&#39;étalonnage pour un minimum de 2 heures avant le dosage. </li><li> Préparer 10x stocks de 0,5 pg / ml, 0,6 uM oligomycine FCCP, et 10 uM antimycine A en XF-DMEM et charge 75 pi de solutions mères dans les ports d&#39;injection de la cartouche dans l&#39;ordre ci-dessus. Si les mesures d&#39;éclatement oxydation doivent être obtenus, l&#39;injection de 10x bilan de 100 ng ml de PMA / peut être injectée après antimycine-A. </li><li> Calibrer la cartouche hydratée et chargé et effectuer le test XF. Les méthodes détaillées pour l&#39;analyse et l&#39;interprétation de la consommation d&#39;oxygène et le pH des changements ont été décrits dans des publications antérieures 9,13,14 et sont non-Discussed en détail ici. </li><li> Après essai XF, aspirer tous, mais les 50 dernières ul de DMEM XF-après dosage pour éviter la perte de cellules de la plaque et ajouter ul RIPA tampon de 50 lyse cellulaire et d&#39;effectuer une analyse des protéines pour la normalisation. </li></ol>

<ol>
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Gerontol. 43, 589-594 (2008).</li><li>Avila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+mitochondrial+dysfunction+is+evident+in+type+2+diabetes+in+association+with+modifications+of+mitochondrial+anti-oxidant+stress+proteins.">Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120, 248-251 (2012).</li><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab. Invest. 93, 690-700 (2013).</li><li>Hill, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cellular+bioenergetics+with+mitochondrial+quality+control+and+autophagy.">Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy.</a> Biol. Chem. 393, 1485-1512 (2012).</li><li>Hultqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+autoimmunity,+arthritis,+and+encephalomyelitis+in+mice+with+a+reduced+oxidative+burst+due+to+a+mutation+in+the+Ncf1+gene.">Enhanced autoimmunity, arthritis, and encephalomyelitis in mice with a reduced oxidative burst due to a mutation in the Ncf1 gene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12646-12651 (2004).</li><li>Rosa-Borges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency+with+recurrent+infections:+case+report.">Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency with recurrent infections: case report.</a> J. Ped. 77, 331-336 (2001).</li><li>Walkowiak, B., Kesy, A., Michalec, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+reader--a+convenient+tool+in+studies+of+blood+coagulation.">Microplate reader--a convenient tool in studies of blood coagulation.</a> Thromb. Res. 87, 95-103 (1997).</li><li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling.">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radic. Biol. Med. 51, 1621-1635 (2011).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp.. (46), e2511 (2010).</li></ol>

Écran de visualisation est un membre du Conseil consultatif scientifique Bioscience hippocampe.

Ce protocole représente la compilation de plusieurs techniques couramment utilisées pour l&#39;isolement de cellules de sang, d&#39;une manière adaptée à l&#39;analyse de la bioénergétique. Les techniques présentées contigus sont avantageux à d&#39;autres méthodes d&#39;isolement (analyse FACS) pour leur capacité à isoler un grand nombre de cellules dans des conditions contrôlées de médias avec un minimum de contraintes placées sur des cellules isolées. Il présente l&#39;inconvénient de longs isolements même avec un minimum d&#39;interruptions. Ce protocole sert de base pour l&#39;isolement de cellules du sang de sujets humains primaires, qui peuvent être extrapolés à des paramètres cliniques et de recherche de translation. MACS séparation est une technique d&#39;isolement des cellules fiable qui offre la possibilité d&#39;isoler les cellules directement à partir du sang total, mais ce procédé nécessite de plus grandes quantités d&#39;anticorps et n&#39;est pas optimale pour l&#39;isolement de l&#39;ensemble des quatre types distincts de cellules telles que décrites dans la présente méthode. Il a been aucune preuve pour montrer que la sélection positive des leucocytes par les résultats de séparation MACS dans l&#39;activation en utilisant notre protocole d&#39;isolement. Colonnes MACS fonctionnent par la séquestration de cellules marquées dans un champ magnétique en utilisant des anticorps conjugués à des particules superparamagnétiques 50 nm. Les cellules marquées sont ensuite élues de la colonne. Sélections positives et négatives sont mises en œuvre dans ce protocole afin d&#39;assurer l&#39;isolement rapide et la pureté. Si le nombre de cellules sont obtenues à partir de l&#39;insuffisance isolement ou la pureté en question est, plusieurs anticorps peuvent être ajoutés à l&#39;échantillon selon les instructions du fournisseur et le second passage à travers la colonne de LS peut se traduire par une plus grande pureté (tableau 2). Notre laboratoire a trouvé une grande pureté et l&#39;efficacité de placage à l&#39;aide du protocole existant en analysant suspensions cellulaires finales par analyse FACS 8. Analyseurs de flux extracellulaires ont la possibilité de surveiller à la fois la consommation d&#39;oxygène et l&#39;acidification des médias en temps réel sur celle de otses électrodes. La consommation d&#39;oxygène telle qu&#39;elle est observée par la réaction oxydative dans les monocytes et les neutrophiles est la NADPH oxydase dépendante comme indiqué par l&#39;inhibition avec le DPI 8. Nous avons constaté une perte dépendant du temps de la capacité de salve oxydative avec isolements prolongés ou des dosages de XF étendues. Ce protocole a été conçu et mis au point pour une utilisation sur le XF24 mais est également compatible avec le XF96 à environ un tiers à une moitié de la cellule XF24 densités d&#39;ensemencement (Figure 3). Dans la conception de ce protocole, l&#39;adhésion aux protocoles existants pour chaque technique était nécessaire pour des performances optimales avec des modifications apportées uniquement à contrôler les conditions de médias pour l&#39;analyse bioénergétique. Après la maîtrise des techniques, un tel protocole peut être utilisé dans un large éventail d&#39;applications de translation et de recherche pour mesurer la toxicité ou l&#39;efficacité des stratégies de traitement, d&#39;explorer les caractéristiques métaboliques de la maladie, et la production d&#39;oxydants par des monocytes et neutrophils dans des conditions inflammatoires.

Surveillance de la santé métabolique de cellules immunitaires (monocytes, lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes) du sang a été reconnu depuis un certain temps comme un outil de diagnostic potentiellement utile pour évaluer la santé bioénergétique globale d&#39;un individu. Il existe un corps émergeant de la littérature attribuer un certain nombre de maladies telles que le cancer, les maladies cardiovasculaires et les maladies neurodégénératives à un dysfonctionnement mitochondrial 1,2. Ceci est d&#39;importance clinique depuis un dysfonctionnement mitochondrial peut initier une série d&#39;événements cellulaires qui favorisent les voies de signalisation pro-inflammatoires, ou conduisent à la mort cellulaire. Plusieurs études ont caractérisé la fonction mitochondriale des cellules et les plaquettes sanguines mononucléaires périphériques dans des conditions telles que la fibromyalgie, le diabète, un choc septique, et la maladie d&#39;Alzheimer 7.3. Par exemple, une étude récente a évalué les bioénergétique des plaquettes comme un marqueur de la fonction mitochondriale et a constaté que les plaquettes de type 2 diabetic patients avaient diminué la consommation d&#39;oxygène des mitochondries 7,8. A partir de ces conclusions et d&#39;autres, il est clair que les monocytes, les lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes peuvent servir de marqueurs de substitution de l&#39;évolution de la bioénergétique dans des conditions pathologiques puisqu&#39;ils enquête la circulation systémique et peuvent refléter des changements métaboliques locaux et mondiaux. Pour déterminer si cette approche a une valeur pronostique ou diagnostique une méthode à haut débit d&#39;analyse et une méthode cohérente pour la préparation de cellules est nécessaire. Les méthodes pour mesurer la fonction mitochondriale dans les leucocytes et les plaquettes ont déjà participé isolement des mitochondries ou l&#39;évaluation de bioénergétique cellulaire dans des cellules intactes 4,9. L&#39;avantage de l&#39;évaluation bioénergétique cellulaire en utilisant un flux extracellulaire (XF) d&#39;analyseur est que la fonction mitochondriale dans les cellules peut être établie avec des substrats endogènes et des paramètres respiratoires tels que fuite de protons et respiratoire maximalecapacité peut être déterminée. Nous et d&#39;autres avons utilisé cette technologie pour montrer que les profils bioénergétiques dans les plaquettes, les monocytes et les lymphocytes isolés à partir de sang humain peuvent être établis et comparés entre les différents types de cellules 8. En outre, deux des neutrophiles et des monocytes possèdent une capacité oxydative dans laquelle oxydases NADPH sont activés et consomment de l&#39;oxygène pour former la superoxyde. Surtout, cette voie est un élément clé de l&#39;immunité innée et est modulée par l&#39;inflammation systémique. Par exemple, il a été montré que les variations de la capacité oxydante de salve sont associés à diverses maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques, l&#39;arthrite, et des infections récurrentes 10,11. Actuellement, il n&#39;y a pas de tests quantitatifs à haut débit disponibles pour mesurer la poussée oxydative dans des échantillons cliniques. Ceci est important étant donné que la caractérisation de la capacité oxydative des neutrophiles et des monocytes peut également servir d&#39;outil de diagnostic important pour plusieurs pathologies. Les principaux défis techniques ont été peu sensible pour la mesure de la consommation d&#39;oxygène en utilisant des techniques polarographiques classiques et la nécessité d&#39;utiliser des cellules fixées lors de l&#39;utilisation des techniques de microplaque fluorométriques plus sensibles. Dans cette vidéo pratique, nous décrivons la solution à ces problèmes techniques. Nous détaillons les méthodes pour l&#39;isolement, le placage et la mesure de la bioénergétique de monocytes, les lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes et la poussée oxydative des monocytes et des neutrophiles du sang humain. Cette méthode est appropriée pour l&#39;évaluation clinique de la bioénergétique et oxydatif pour les enquêteurs qui ont l&#39;accès à une population de patients, et la capacité d&#39;obtenir des échantillons de sang frais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-094-833</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"><a name="RANGE!A3">CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human</a></td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-501</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD61 MicroBeads, human&#160; for platelets</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-051-101</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD14 MicroBeads, human&#160; for monocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-201</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD15 MicroBeads, human&#160; for granulocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-046-601</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">LS Columns</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-042-401</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">BD Vacutainer ACD Blood collection tubes</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">02-684-26</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">11835-030</td>
			<td style="width:215px;">with L-glutamine and without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Prostaglandin I2, sodium salt</td>
			<td style="width:215px;">Cayman</td>
			<td style="width:215px;">18220</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">1.5 ml semi-micro cuvettes</td>
			<td style="width:215px;">Phenix Research Products</td>
			<td style="width:215px;">SC-2410</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.077</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">10771</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.119</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">11191</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td style="width:215px;">Roche</td>
			<td style="width:215px;">3117405001</td>
			<td style="width:215px;">fatty-acid ultra-free</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8139</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">100850-001</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DMEM</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">MT90113PB</td>
			<td style="width:215px;">w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">L-Glutamine, 200mM (100x)</td>
			<td style="width:215px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:215px;">25030-081</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">G7528</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8574</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Cell-Tak (cell adhesive)</td>
			<td style="width:215px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">CB-40242</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">O4876</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A8674</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C-2920</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent A</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0113</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent S</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0015</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent B</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0114</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Vendor</td>
			<td style="width:215px;">Product #</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Seahorse</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-090-976 and 24039</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets

Dysfonctionnement mitochondrial est connue pour jouer un rôle important dans un certain nombre de conditions pathologiques telles que l&#39;athérosclérose, le diabète, le choc septique, et les maladies neurodégénératives, mais l&#39;évaluation des changements dans la fonction bioénergétique chez les patients est un défi. Bien que les maladies telles que le diabète ou l&#39;athérosclérose présente cliniquement atteints d&#39;insuffisance d&#39;organe spécifique, les composantes systémiques de la pathologie, tels que l&#39;hyperglycémie ou l&#39;inflammation, peuvent altérer la fonction bioénergétique dans les leucocytes ou les plaquettes de circulation. Ce concept a été reconnu depuis un certain temps, mais son application généralisée a été entravée par le grand nombre de cellules primaires nécessaires à l&#39;analyse bioénergétique. Cette limitation technique a été résolu par la combinaison de la spécificité des techniques d&#39;isolement de billes magnétiques, des techniques d&#39;adhérence cellulaire, qui permettent aux cellules d&#39;être fixés sans activation de microplaques, et la sensibilité des nouvelles technologies conçue pour un débit élevé micrespirométrie ROPLATE. Un exemple de cet appareil est un analyseur de flux extracellulaire. Cette instrumentation utilise généralement l&#39;oxygène et le pH sondes sensibles pour mesurer les taux de variation de ces paramètres dans les cellules adhérentes, qui peuvent ensuite être liés au métabolisme. Ici, nous détaillons les méthodes d&#39;isolement et de placage de monocytes, les lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes, sans activation, à partir de sang humain et de l&#39;analyse de la fonction mitochondriale bioénergétique dans ces cellules. En outre, nous montrons comment la poussée oxydative dans les monocytes et les neutrophiles peut aussi être mesurée dans les mêmes échantillons. Puisque ces méthodes utilisent seulement 8-20 ml de sang humain, ils ont le potentiel pour le suivi réactif génération et la bioénergétique des espèces d&#39;oxygène dans un cadre clinique.

Afin d&#39;évaluer les bioénergétique des cellules du sang, le sang total est recueilli à partir de sujets humains par ponction veineuse dans un tube de collecte de Vacutainer EDTA ou ACD. L&#39;isolement des leucocytes et des plaquettes suivants collecte de sang est visualisée sur la figure 1A comme décrit dans le protocole. Des échantillons de sang total sont traités dans les 8 heures de collecte pour éviter la mort des cellules et l&#39;activation. Temps de stockage prolongé de plus de 8 heures n&#39;ont pas été testés, mais peuvent entraîner bioénergétique altérées et moins représentatif des conditions physiologiques. Tubes acide citrate dextrose (ACD-8 ml) et de l&#39;EDTA Vacutainer ont été utilisés pour les isolements cellulaires sans effet observé sur la fonction métabolique de cellules isolées. Les anticoagulants sont nécessaires comme des caillots de réduire le nombre de cellules obtenues, interfèrent avec la formation de la phase correcte au cours de la centrifugation en gradient de Ficoll, et entraînent peu ou pas de plaquettes obtenues dans le sérum centrifugé. Tout le sang représente un biolodanger ical et équipement de protection individuelle doivent être mises en œuvre tout au long de la procédure, même après populations de cellules sont isolées ou lysats cellulaires sont générés. Les échantillons doivent être éliminés conformément aux normes d&#39;élimination des déchets humains de l&#39;institution. Le sang total est centrifugé pour séparer le plasma riche en plaquettes à partir de la couche leucocytaire, la couche blanche juste au-dessus des globules rouges concentrés qui contient les leucocytes. La couche leucocytaire est appliquée sur des gradients de densité et centrifugé pour obtenir les cellules mononucléaires du sang périphérique (monocytes et lymphocytes) et des cellules polynucléaires (granulocytes). Contamination RBC des phases individuelles de cellules MNC et PMN est commun à ce stade et devrait être résolu lors de la purification de MACS. Les divers types de cellules sont ensuite obtenues par incubation avec des anticorps magnétiques pour obtenir des fractions pures. Les monocytes sont collectées par incubation de la fraction des CMSP avec le CD14, le flux continu à partir de til contient des lymphocytes, des monocytes, qui sont ensuite épuisés de globules rouges et des plaquettes. Les neutrophiles sont obtenues par incubation de la couche de cellules polymorphonucléaires avec l&#39;anticorps CD15 (Figure 1A). Par la suite, les plaquettes peuvent être rassemblées en un culot par centrifugation du plasma riche en plaquettes et on les lave pour éliminer d&#39;autres composants du plasma. Après ces sélections les plaquettes, les monocytes CD14 +, les lymphocytes, les neutrophiles CD15 + peuvent être comptées et étalées sur un support revêtu XF plaque d&#39;analyseur de l&#39;adhésion cellulaire et l&#39;analyse de la bioénergétique oxydative. Chaque étape de la procédure doit être effectuée dans des conditions stériles et est encouragé à empêcher l&#39;activation prématurée de la réaction oxydative dans les monocytes et les neutrophiles. Un indicateur de moins de conditions stériles pendant l&#39;isolement est évident lorsque les neutrophiles, qui ont peu ou pas de consommation d&#39;oxygène dans des conditions basales, commencent le dosage flux extracellulaire avec des mesures OCR élevées queprogressivement augmenter ou diminuer tout au long de l&#39;essai. Nous soulignons l&#39;importance de l&#39;imagerie des cellules par microscopie optique à 200X ou plus pour s&#39;assurer que pas de signes morphologiques d&#39;activation ont eu lieu avant le dosage. Par exemple, les neutrophiles affichent normalement un arrondi à la forme irrégulière avec des limites de cellules marquées comme on le voit sur ​​la figure 1B. Cependant, ces cellules vont aplatir contre la surface de la plaque lorsqu&#39;elle est activée et perdent leur morphologie cellulaire distinct. Nous avons déjà signalé les changements morphologiques des leucocytes et des plaquettes activées en utilisant ce protocole et des mesures supplémentaires doivent être prises pour garantir des conditions stériles si l&#39;activation 8 rencontrer. Un schéma simplifié du protocole est vu sur la figure 2 en tant que table de temps dans lequel les étapes principales de l&#39;isolement des cellules, XF préparation de la plaque, et le dosage XF sont détaillées. L&#39;isolement consiste en la séparation par gradient de densité de types de cellules etest suivi par une séparation magnétique. Parallèlement au processus d&#39;isolement cellulaire, XF plaque préparation est nécessaire pour éviter les retards dans le placage de cellule ou de commencer l&#39;essai XF. Ceci est important car des retards importants peuvent conduire à l&#39;activation de la cellule et les paramètres bioénergétiques diminué. Concentrations cellulaires inadéquats après l&#39;isolement sont un problème et l&#39;optimisation de chaque processus de centrifugation commun est nécessaire pour éviter la perte de cellules. Isolations réussies ont été réalisées sur aussi peu que six ml de sang, mais des modifications peuvent être faites en fonction de la concentration de type cellulaire souhaité circulant. Si le gradient de densité est mal préparé, les phases de cellulaires distincts pourraient ne pas être visible et la perte de cellules peuvent se produire (voir JoVE vidéo d&#39;instruction pour une démonstration visuelle). Plaquettaire insuffisante isolé du PRP est rare, mais a eu lieu si le tampon de lavage ne ​​contient pas de PGI 2 ou si l&#39;isolement a lieu en dessous de la température ambiante. Le risque d&#39;une plaquettairectivation est souvent empêchée si les plaquettes sont les dernières cellules à isoler, mais si les plaquettes restent dans le tampon de lavage pendant de longues périodes les bioénergétique seront affectés. Il ya eu des cas de populations de plaquettes plus petites qui n&#39;ont pas Pellet lors de la centrifugation de 1500 xg et la bioénergétique de ces cellules n&#39;a pas été largement caractérisés. Voir le tableau 2 pour un guide plus complet de dépannage. Les profils bioénergétique de leucocytes et les plaquettes peuvent être déterminées en utilisant l&#39;analyseur XF, qui mesure en temps réel consommation d&#39;O 2 dans les cellules de façon non invasive. Chaque type de cellules est étalée sur la plaque de XF24 avec cinq répétitions comme représenté sur la figure 3A. Tableau 1 indique l&#39; oxydatif basales et les valeurs attendues par type de cellule au cours de l&#39;essai, les concentrations moyennes de protéine par puits. Technologies de débit plus élevé sont disponibles, tels que le XF96, ce qui permet dequatre donateurs à évaluer simultanément comme le montre la figure 3B. Après l&#39;essai, les données sont exportées vers un ordinateur poste de travail pour l&#39;analyse à l&#39;aide du logiciel approprié XF et Microsoft Excel. Les valeurs ont été normalisées à l&#39;OCR teneur totale en protéine dans les puits correspondants et sont exprimés en pmol / min / mg de protéine. Les profils de rafale bioénergétiques-oxydant représentatives de chaque type de cellule ont été signalés récemment par notre groupe 8. Une analyse plus poussée des paramètres de l&#39;analyse bio-énergétiques (basal, ATP-lié, proton fuite, maximal, et nonmitochondrial poussée oxydative) peut être calculé pour des puits individuels comme précédemment illustré et décrit ci-dessous 8. Le taux de consommation d&#39;oxygène de base (OCR) est établie par les trois premières mesures, comme indiqué sur la figure 4A. Oligomycine (0,5 pg / ml), un inhibiteur de la synthase mitochondriale d&#39;ATP est injecté dans le moyen pour estimer la XF OCR couplé à la synthèse d&#39;ATP et repré<html> ted que l&#39;ATP-lié. L&#39;OCR résiduelle moins l&#39;OCR nonmitochondrial peuvent être attribués à fuite de protons. Puis FCCP un découpleur est ajoutée afin de déterminer la reconnaissance optique de caractères maximal, suivi par l&#39;antimycine A, un inhibiteur de la respiration mitochondriale, pour déterminer les sources nonmitochondrial de consommation d&#39;oxygène. La capacité de réserve est une mesure de la quantité d&#39;ATP qui peut être produite sous la demande d&#39;énergie et peut être calculée comme la différence entre le taux maximum de la respiration et de la base. Afin de déterminer la capacité oxydante de salve, le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), un agoniste de la PKC est injecté pour augmenter l&#39;activité de la NADPH oxydase, et l&#39;augmentation de la vitesse de consommation d&#39;oxygène après stimulation par PMA peut être mesurée en utilisant l&#39;analyseur XF. Figure 4B montrer comment calculer les différents paramètres de la fonction mitochondriale et oxydatif. <html> 1301/51301fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Isolement des leucocytes et des plaquettes de sang total. A) des échantillons fraîchement recueillis sont séparés en leur plasma et les composants cellulaires par centrifugation et purifiés par gradient de Ficoll et magnétique tri cellulaire activé (MACS) en positif (monocytes et neutrophiles) ou de la sélection négative (lymphocytes), tandis que les plaquettes sont isolées par une grande vitesse de centrifugation plasma riche en plaquettes. B) Images des populations cellulaires isolées fois remises en suspension dans du DMEM XF et étalées à des densités cellulaires indiqués. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51301/51301fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> ghres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Préparation des plaques pour les études XF24 bioénergétique de leucocytes et des plaquettes. Chronologie détaillées pour la préparation d&#39;une plaque d&#39;essai de XF24 par isolement des cellules et le placage et la cartouche d&#39;hydratation et d&#39;injection orifice de chargement. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig3.jpg" /> Figure 3. Disposition des leucocytes et des plaquettes sur XF24 et XF96 plaques d&#39;analyse. A) Les leucocytes (cellules 125-250k / puits) et les plaquettes (25 x 10 6 cellules / puits) à partir d&#39;un seul donneur sont plaqués sur la plaque d&#39;essai de XF24 parmi fond contrôles. 75 ul de stocks de 10x (oligomycine 0,5 pg / ml), FCCP (0,6 uM), l&#39;antimycine A (10 pM) et du PMA (100 ng / ml) dilué dans XF médias sont chargées dansaux ports d&#39;injection indiqués. B) Les leucocytes (cellules de 75 150k / puits) et les plaquettes (10 x10 6 cellules / puits) de moins de quatre donateurs peuvent être plaqués sur le XF96 dans un volume total de 180 pl XF-DMEM. 20 ul de stocks de 10x oligomycine (1,0 pg / ml), FCCP (0,6 uM), l&#39;antimycine A (10 pM) et du PMA (100 ng / ml) dilué dans du DMEM-XF sont chargés dans les orifices d&#39;injection indiqués. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig4.jpg" /> Figure 4. Analyse des indices bioénergétique. A) trace Représentant du taux de consommation d&#39;oxygène (OCR) par les mitochondries et burst oxydatif dans les monocytes. Basale OCR est établi (3 premiers taux indiqués par des numéros dans les cercles). Puis additions séquentielles d&#39;oligomycine (O; 0,5 pg / ml), FCCP (F; 0,6 uM) et anticine-A (A; 10 M) sont injectés pour déterminer mitochondriale et la respiration des cellules non activées nonmitochondrial. Enfin, PMA (100 ng / ml) est ajouté à mesurer oxydatif. B) analyse modulaire de la fonction mitochondriale et du métabolisme oxydatif sont calculées par les différences dans les taux selon les indications. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:215px;"></td><td style="width:215px;"> Optimale de semis Densité </td><td style="width:215px;"> Moy. Basale OCR (pmol O 2 / min) </td><td style="width:215px;"> Moy. Oxydatif OCR (pmol O 2 / min) </td><td style="width:215px;"> Moy. protéines (g) / puits </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;"> Monocytes </td><td> 250k cellules / puits </td><td> 83,9 (± 13,0) </td><td> 300,3 (± 58,8) </td><td> 19,0 (± 2,4) </td></tr><tr height="40"><td height="40"style = &quot;height: 40px;&quot;&gt; neutrophiles </td><td> 250k cellules / puits </td><td> 6,1 (± 2,2) </td><td> 1411,8 (± 233,3) </td><td> 20,6 (± 2,7) </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;"> Lymphocytes </td><td> 250k cellules / puits </td><td> 52,9 (± 7,7) </td><td> 15 (± 4,1) </td><td> 13.2 (± 2.1) </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;"> Plaquettes </td><td> 25 x 10 6 cellules / puits </td><td> 199,4 (± 20,3) </td><td> 24 (± 2,7) </td><td> 47,5 (± 3,1) </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Paramètres normaux pour le dosage XF24: La basales moyenne (Tarif 3) et burst oxydatif (Taux 7) OCR pas corrigé vers OCR nonmitochondrial ou protéines sont présentés par type de cellule plaqué aux densités cellulaires indiqués. La teneur moyenne en protéines par puits est représenté comme effectuée par un dosage DC Lowry. Ces données représentent les valeurs moyennes des6-8 donneurs sains avec parenthèses contenant ± SEM. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="4" /></colgroup><tbody><tr height="66"><td> Étape </td><td> Problème </td><td> Raison possible </td><td> Solution </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.2 </td><td style="width:199px;"> plasma clair </td><td style="width:199px;"> plaquettes granulés lors de la centrifugation </td><td style="width:199px;"> diminuer le temps de centrifugation de 10 min ou lente à 400 xg </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;"> plasma laiteux </td><td style="width:199px;"> excès de lipides </td><td style="width:199px;"> éviter collection postprandiale </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.6 </td><td style="width:199px;"> bandes de cellules incomplètes formées </td><td style="width:199px;"> lutinpréparation de gradient cordier, réactif froid </td><td style="width:199px;"> éviter de perturber gradient pendant le pipetage, l&#39;utilisation de la température ambiante réactif </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;"> touffes dans les bandes cellulaires </td><td style="width:199px;"> coagulation du sang peut avoir eu lieu </td><td style="width:199px;"> Prélever le sang des anticoagulants tels que ACD ou EDTA </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.10 </td><td style="width:199px;"> aucun culot cellulaire </td><td style="width:199px;"> voir l&#39;étape 1.6 </td><td style="width:199px;"> Si brumeux surnageant voir ci-dessous </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;"> surnageant trouble </td><td style="width:199px;"> Contamination de gradient de Ficoll lourd, la contamination des plaquettes </td><td style="width:199px;"> Augmenter la vitesse de centrifugation à 900 xg, diluth avec plus RPMI </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.16, 1.17 </td><td style="width:199px;"> faible rendement de leucocytes </td><td style="width:199px;"> contamination RBC lourd, pas assez de sang total, de la coagulation </td><td style="width:199px;"> Double anticorps et RPMI-BSA volumes, de recueillir plus de sang, ajouter anticoagulant </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.19 </td><td style="width:199px;"> l&#39;agrégation plaquettaire </td><td style="width:199px;"> PGI 2 omis, l&#39;exposition aux médias froid, stockage prolongé dans le plasma </td><td style="width:199px;"> ajouter PGI 2 à tampon de lavage des plaquettes, des réactifs de température utilisation de la chambre </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.20 </td><td style="width:199px;"> faible numération plaquettaire </td><td style="width:199px;"> pertes lors de la centrifugation primaire, l&#39;agrégation plaquettaire </td><td style="width:199px;"> Voirétapes 1.2 et 1.19 </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 2.3 </td><td style="width:199px;"> Contamination RBC </td><td style="width:199px;"></td><td style="width:199px;"> Répétez MACS séparation </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Leucocytes et plaquettes isolement dépannage. Le tableau répertorie les problèmes courants rencontrés lors de leucocytes et plaquettes isolement des cellules du sang et des solutions qui peuvent guider les utilisateurs à travers le processus de dépannage ensemble.

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Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

leucocytes du sang et de plaquettes peuvent être utilisé comme un marqueur de la santé bioénergétique globale d&#39;un individu et ainsi avoir la possibilité de surveiller les processus pathologiques et l&#39;impact des traitements. Nous décrivons ici un procédé pour isoler et mesurer la fonction mitochondriale et de la poussée oxydative dans ces cellules.

Bioénergétique et les oxydatif: Protocoles pour l&#39;isolement et l&#39;évaluation des leucocytes humains et plaquettes

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

bioenergetics-oxidative-burst-protocols-for-isolation-evaluation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.9K vues.  University of Alabama at Birmingham.  leucocytes du sang et de plaquettes peuvent être utilisé comme un marqueur de la santé bioénergétique globale d'un individu et ainsi avoir la possibilité de surveiller les processus pathologiques et l'impact des traitements. Nous décrivons ici un procédé pour isoler et mesurer la fonction mitochondriale et de la poussée oxydative dans ces cellules. 

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Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Isolement du cerveau infiltrant Leucocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolement et analyse de Brain-séquestrés de leucocytes<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-souris infectées

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Analyser les effets des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes de débit

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Isolement des leucocytes à partir de l&#39;interface humaine materno-fœtale

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Isolement de leucocytes des tissus murins à l&#39;interface materno-foetale

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolement de leucocytes infiltrant de la peau de souris Utilisation de digestion enzymatique et séparation par gradient

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Mesure de granulocytes et de monocytes phagocytose et oxydative Activité Burst dans le sang humain

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure the strength of immune activation in Arabidopsis thaliana following treatment with elicitor molecules. Presented first is a method for capturing the rapidly-induced and dynamic oxidative burst, which can be monitored using a luminol-based assay. Presented second is a method describing how to measure immune-induced inhibition of seedling growth. These protocols are fast and reliable, do not require specialized training or equipment, and are widely used to understand the genetic basis of plant immunity.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

This paper describes two methods for quantifying defense responses in Arabidopsis thaliana following exposure to immune elicitors: the transient oxidative burst, and the inhibition of seedling growth.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect of breast milk (BM). Unless access to clean water and appropriate infant formula is reliable, the WHO does not recommend cessation of breastfeeding for HIV-infected mothers. Numerous factors likely work in tandem to reduce BM transmission. Breastfed infants ingest ~105&#8722;108 maternal leukocytes daily, though what remains largely unclear is the contribution of these cells to the antiviral qualities of BM. Presently we aimed to isolate cells from human BM in order to measure antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), one of the most essential and pervasive innate immune responses, by BM phagocytes against HIV targets. Cells were isolated from 5 human BM samples obtained at various stages of lactation. Isolation was carried out via gentle centrifugation followed by careful removal of milk fat and repeated washing of the cell pellet. Fluorescent beads coated with HIV envelope (Env) epitope were used as targets for analysis of ADCP. Cells were stained with the CD45 surface marker to identify leukocytes. It was found that ADCP activity was significant above control experiments and reproducibly measurable using an HIV-specific antibody 830A.

Breast milk transmits human immunodeficiency virus (HIV), though only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected. Breastfed infants ingest ~105&#8722;108 maternal leukocytes daily, though these cells are understudied. Here we describe the isolation of breast milk leukocytes and an analysis of their phagocytic capacity.

Isolement des leucocytes du lait maternel humain pour une utilisation dans une essai de phagocytose cellulaire dépendante des anticorps des cibles de VIH

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...