Le travail décrit a été pris en charge par le Centre de Cornell sur le micro-environnement et métastases à travers U54CA143876 Nombre Prix du National Cancer Institute. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut national du cancer ou de la National Institutes of Health. Ce travail a été en outre financé en partie par la National Science Foundation Graduate Fellowship recherche (ADH).

Le protocole suivant est pour la production d&#39;un dispositif unique microtube. 1. Préparation de la solution de nanotubes halloysite <ol><li> Soniquer (10-13 W (RMS)) 250 uL solution de nanotubes halloysite (6,6% en poids dans l&#39;eau) 30 sec. Solution refroidir à l&#39;eau froide et sonication répéter une fois. Refroidissez à nouveau. </li><li> Dessiner solution soniqué dans une seringue, fixer un filtre de 0,45 um seringue, et la solution du filtre dans microtube propre. Vortex la solution de temps en temps pour maintenir l&#39;homogénéité. </li></ol> 2. Revêtement de surface microtube intérieur avec des nanotubes de halloysite <ol><li> Obtenir 50 cm longue section de Micro-Renathane microtubing (300 um de diamètre intérieur, 35,3 ul de volume interne). Couper une extrémité du microtube en diagonale et l&#39;insérer dans une pièce IDEX petit adaptateur. Insérez l&#39;aiguille d&#39;une seringue 3/10 cc 29G dans l&#39;autre extrémité du microtube. </li><li> Pour nettoyer le microtube, placez l&#39;extrémité ouverte du microtube (la finavec l&#39;adaptateur) dans l&#39;éthanol à 70% du tirage de l&#39;éthanol à 50 ~ ul dans la seringue pour remplir microtube. </li><li> Rincer l&#39;éthanol sur le microtube en attirant un volume généreux de l&#39;eau distillée dans la seringue. </li><li> Détacher la seringue du microtube, vider la seringue, puis la rattacher à la microtube. </li><li> Préparer une solution de 0,02% p / v de poly-L lysine dans l&#39;eau. Dessiner 50 uL dans le microtube et laisser reposer pendant 5 min à température ambiante (RT). </li><li> Dessiner une solution de 100 ul de nanotubes et filtré dans le microtube et laisser incuber pendant 3 min à température ambiante. </li><li> Dessinez 100 pi d&#39;eau à travers le microtube pour rincer la solution de nanotubes. Laisser microtube revêtu de s&#39;asseoir, rempli d&#39;eau, une nuit à TA. </li></ol> 3. Préparation de microtubes pour l&#39;isolement cellulaire <ol><li> Préparer une solution de 10 ug / ml à la protéine G dans le phosphate de Dulbecco 1X une solution saline tamponnée (PBS, pH 7,0 - 7,2). Dessiner 50 ul de PBS par microtube puis dessinez 50 pi dela solution de protéine-G et laisser incuber pendant 1,5 heure à température ambiante. </li><li> Préparer une solution contenant 5 ug / ml E-sélectine-IgG et 50 pg / ml d&#39;anticorps (anti-EpCAM pour la plupart des échantillons de cancer, anti-PSMA pour les échantillons cancer de la prostate) dans du PBS. Dessiner 50 pi de l&#39;E-sélectine et une solution d&#39;anticorps dans le microtube et laisser incuber pendant 2 h à température ambiante. </li><li> Non spécifique adhésion cellulaire est bloqué avec des protéines de lait de 5%. Préparer une solution de 5% (p / v) de protéine du lait dans du PBS. Dessiner une solution à 50 ul de protéines de lait dans le microtube et laisser incuber pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Dessiner 50 ul de PBS dans le tube et laisser à température ambiante avant que des échantillons de sang ou de buffy coat sont prêts pour le traitement. </li><li> 10 min avant d&#39;utiliser le microtube pour l&#39;isolement, dessiner 50 ul de PBS qui a été saturé avec du Ca 2 + (&quot;PBS +&quot;) pour activer les molécules de sélectine. </li></ol> 4. Préparation des échantillons pour l&#39;isolement cellulaire <ol><li> Dessinez ou obtenir 10 mL de sang du patient dans héparinéTube. </li><li> Placer 10 ml de Ficoll-Paque solution d&#39;isolation de lymphocytes dans 50 ml tube de la centrifugeuse. Doucement couche sang 10 ml ensemble au-dessus de Ficoll manière à ne pas mélanger le sang et de Ficoll. </li><li> Centrifuger à 2000x g pendant 15 min à 4 ° C avec une décélération minimale. </li><li> Retirez la couche leuco-plaquettaire et le placer dans un nouveau tube. </li><li> Laver avec du PBS couche leuco-plaquettaire (centrifugeuse à 230x g pendant 10 min, éliminer le surnageant). </li><li> Resuspendre doucement les cellules avec 1 ml de tampon de lyse et incuber pendant 10 min à température ambiante pour lyser les érythrocytes. </li><li> Ajouter 10 ml de PBS, mélanger doucement et centrifuger à 230x g pendant 10 min. Jeter le surnageant et doucement reprendre le culot dans 3 à 4 ml de PBS +. </li></ol> 5. Isolement cellulaire <ol><li> Fixez une extrémité du microtube fonctionnalisé à un seringue de 5 ml en utilisant des adaptateurs IDEX. </li><li> Insérez la seringue sur une pompe à seringue. </li><li> Plonger l&#39;extrémité ouverte du microtube fonctionnalisé dans la cellule de suspension. </li><li> Traiter la suspension cellulaire à travers le microtube de 1 à 4 ml / h. </li><li> Transfert à l&#39;extrémité ouverte du microtube dans un tube contenant du PBS + et d&#39;en tirer 300 + pi de PBS dans la seringue de 0,016 ml / min pour éliminer les cellules non relié et faiblement liés du microtube. </li><li> Placer l&#39;extrémité ouverte du microtube dans un tube propre. Déconnecter la seringue du microtube et joindre une seringue pré-remplie avec Accutase. Doucement perfuser Accutase assez dans le microtube à remplir (~ 50 pi) et laisser incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Fixer une seringue pré-remplie avec 1 ml de milieu de croissance (79% RPMI, SVF 20%, 1% de streptomycine à la pénicilline) et perfuser en microtube, la collecte des effluents dans la culture de tissus bien traités plaque. </li><li> Des cellules en culture à 37 ° C et 5% de CO 2 dans des conditions humidifiés. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Le but de cette technique consiste à isoler les cellules cancéreuses viables dans le sang de patients atteints de cancer. Plusieurs méthodes existent pour identifier les cellules cancéreuses en culture; une vérification nécessaire à la réussite appareil. Nous avons choisi pour colorer les cellules en culture avec des anticorps contre des fragments épithéliaux tels que EpCAM (molécule d&#39;adhésion cellulaire épithéliale) ou PSMA (antigène prostatique membranaire spécifique), en plus de DAPI à identifier les noyaux des cellules intactes (Fig. 2 et 3). Le nombre de cellules cancéreuses capturé en utilisant la technique est nécessairement une fonction du nombre de CTC dans l&#39;échantillon de départ, et à la variabilité du patient peut être élevé. Dans le traitement des échantillons prélevés sur des patients diagnostiqués avec le cancer de stade IV, nous avons l&#39;habitude de capturer entre 100 et 500 cellules cancéreuses par tube de sang, à des puretés&gt; 50%. Immédiatement après l&#39;isolement, un plus grand nombre de leucocytes contaminants peuvent être présents. Toutefois, ces chiffres seront épuisées après une incubation dans un milieu de culture pour un maximum de 5 jours. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <strong&gt; Figure 1. Schéma de microtube fonctionnalisé pour l&#39;isolement de la CCT, montrant sélectine-médiée de roulement suivie par médiée par les anticorps adhérence statique. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> Figure 2. Données représentatives de l&#39;isolement de la CCT à partir d&#39;échantillons de sang prélevés à partir d&#39;un patient atteint de cancer du sein et un patient du cancer du poumon. Le nombre de cellules viables positive identifiés comme CCT sur la base de la coloration EpCAM est représenté par des barres solides et se rapportent à l&#39;ordonnée de gauche et le pourcentage de cellules qui ont été identifiées comme CCT par rapport au nombre total de cellules capturées est représenté par les barres d&#39;ouverture et de mesurée sur la droite d&#39;ordonnée. Les résultats sont, après cinq jours de culture. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> Micrographies représentatives Figure 3. Des bailleurs de fonds distincts (A et B) de la CCT dans la culture 5 jours à la suite de isolatisur un échantillon de sang patients atteints du cancer. Les cellules ont été colorées pour fluorescence EpCAM avec AlexaFluor 488 (vert) et 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour visualiser le noyau (en bleu).

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	<li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+for+the+capture+and+manipulation+of+circulating+tumor+cells.">Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).</li><li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtube+Device+for+Selectin-Mediated+Capture+of+Viable+Circulating+Tumor+Cells+from+Blood.">Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood.</a> Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+naturally+occurring+halloysite+nanotubes+for+enhanced+capture+of+flowing+cells.">Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells.</a> Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).</li><li>Al-Mehdi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+origin+of+metastasis+from+the+proliferation+of+endothelium-attached+tumor+cells:+a+new+model+for+metastasis.">Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis.</a> Nat. Med. 6, 100-102 (2000).</li><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+Building+a+framework.">Cancer metastasis: Building a framework.</a> Cell. 127, 679-695 (2006).</li><li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow.">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).</li><li>Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+selectin+ligands+in+extravasation+of+cancer+cells+and+organ+selectivity+of+metastasis.">Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).</li><li>Geng, Y., Marshall, J., King, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+Metastatic+Cascade:+Tumor+Cell-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Circulation.">Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 .</li><li>Stott, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip.">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).</li></ol>

MRK est un conseiller scientifique de CellTraffix, Inc (Rochester, NY).

Il est souvent le cas que les premières étapes de la découverte de nouvelles thérapies contre le cancer d&#39;utiliser des lignées de cellules cancéreuses, ce qui ne ressemblent discutable de cellules cancéreuses primaires restent encore en cours d&#39;utilisation en raison de leur facilité d&#39;utilisation dans le laboratoire. La recherche sur le développement de nouveaux traitements du cancer serait accéléré si primaires des cellules cancéreuses humaines ont été utilisées dès le début dans la recherche roman. CCT sont le type le plus facilement accessible de la cellule cancéreuse, en raison de leur présence dans le sang et la facilité d&#39;une prise de sang standard. En outre, les cellules tumorales circulantes représentent une étape nécessaire dans le processus de métastase 5,6, de sorte que leur pertinence pour la maladie et l&#39;utilité pour le ciblage de nouveaux médicaments est clair. Isolement de la CCT à partir du sang in vitro est compliquée par leurs faibles concentrations: de l&#39;ordre de un cas par million de leucocytes ou de l&#39;un par milliard érythrocytes 7. La majorité des méthodes actuelles de détection de la CCT dans le sang, y compris la Cellule technique approuvé par la FDA ne<html> Recherche (Veridex), endommager ou détruire les cellules dans le processus de détection, ce qui empêche l&#39;utilisation au-delà de l&#39;énumération. La méthode décrite ci-dessus ne compromet pas la viabilité cellulaire et ouvre ainsi la porte à la recherche clinique sur le cancer du futur. Comme la récupération des cellules intactes est le but de cette technique, il est impératif que les cellules être manipulés avec soin, en particulier lors des étapes de séparation du sang. Il ya un certain nombre de paramètres ajustables dans ce système qui pourrait être modifié de façon à obtenir un rendement amélioré en fonction des caractéristiques essentielles telles que le type de cancer. Dans les étapes décrites ci-dessus, nous avions choisi d&#39;utiliser EpCAM comme un anticorps spécifique de la CCT pour tous les types de cancer, sauf lorsque le traitement d&#39;échantillons cancer de la prostate, dans lequel anti-PSMA a été utilisé. Substitutions supplémentaires de cancer des anticorps spécifiques peut certainement être utilisée pour améliorer les performances pour les patients individuels. En outre, les concentrations d&#39;anticorps et de sélectine peuvent être modifiés pour améliorer la capture 8. &quot;&gt; Une caractéristique essentielle du dispositif est l&#39;incorporation de la E-sélectine molécules sur la surface. E-sélectine est normalement exprimé à la surface luminale des cellules endothéliales et la fonction de recruter des leucocytes mobiles rapides aux sites d&#39;inflammation. Leucocytes Flowing lier transitoirement molécules de sélectine, résultant en un rythme plus lent, le comportement de roulement qui facilite la liaison plus lente et plus forte de la cellule à l&#39;endothélium par les intégrines. convaincante des preuves expérimentales existe qui rend le cas où la CCT peut s&#39;extravaser par un mécanisme similaire 9,10. L&#39;inclusion de la sélectine aussi permet au dispositif de fonctionner à des débits supérieurs, des taux qui empêcherait, sinon, les cellules de se lier à des anticorps 11. Ainsi, notre dispositif imite physiologiquement une veinule de biomimetically capturer couler la CCT, sans infliger des lésions cellulaires. Amélioration de la performance du dispositif peut être attribuée à l&#39;ajout du revêtement de nanotubes halloysite à la surface luminaledu dispositif. Des études antérieures ont montré qu&#39;il ya trois principales composantes du revêtement de nanotubes de qui permet de fonctionnalités améliorées. Tout d&#39;abord, le revêtement de nanotubes de fournit une plus grande surface, ce qui permet une plus grande pour le dépôt de protéines sur la surface 4. Deuxièmement, à effectuer la microscopie à force atomique sur le revêtement de nanotubes on a déterminé que les nanotubes individuels saillie sur la surface dans le flux. Cela permet molécules de sélectine qui sera présenté autant que l&#39;ordre du micron au-dessus de la surface de sorte que les cellules peuvent être capturés et recruté à la surface plus tôt dans leur trajectoire à travers le tube 4. Enfin, le revêtement de nanotubes de halloysite est capable d&#39;empêcher l&#39;adhérence des leucocytes et la propagation à la surface, permettant une réduction du nombre de leucocytes capturés le long de la CCT et donc plus ultérieures puretés de la CCT 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> 300 tubes ID um </td><td> Braintree scientifique </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> Des tuyaux plus gros pour le raccordement à la seringue </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> Seringue de 5 ml pour la pompe </td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Petit connecteur à gros tube </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> Tube connecteur grande à la seringue </td><td> IDEX Health &amp; Science </td><td> F-120 et P-659 </td></tr><tr><td> Seringue pour microtube (seringue à insuline U-100 3/10cc 29G 1/2 &quot;) </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MP Biomedicals LLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque Plus </td><td> GE Soinsthcare Bio-Sciences AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC Lysis Buffer (Tampon EL, 1000ml) </td><td> Qiagen </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> Protéine G, 5 mg </td><td> CalBiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> Anticorps humain EpCAM/TROP-1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> LMFP Anticorps (GCP-04) </td><td> Abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> Plaques à 96 puits (Microtest 96) </td><td> BD Falcon </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Buvard Blocker année non-lait écrémé en poudre, 300g </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Nanotubes halloysite </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> Carbonate de calcium, 5g </td><td> Aldrich Chimie </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc Chimera, UG 100 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> Milieu RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> La poly-L lysine 0,1% p / v dans l&#39;eau </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td> Sonic Dismembrator </td><td> Fisher Scientific </td><td> Modèle 100 </td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin </td><td> Biochimiques Atlanta </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> Streptomycine Pénicilline </td><td> Sigma vie Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

rapid isolation of viable circulating tumor cells from patient blood samples

Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont des cellules qui diffusent à partir d&#39;une tumeur primaire dans tout le système circulatoire et qui peuvent finir par former des tumeurs secondaires à des sites distants. CCT de comptage peut être utilisé pour suivre la progression des maladies basée sur la corrélation entre la concentration de la CCT dans le sang et 1 sévérité de la maladie. Comme un outil de traitement, la CCT pourraient être étudiées dans le laboratoire pour développer des thérapies personnalisées. À cette fin, l&#39;isolement de la CCT doit pas causer de dommages cellulaires, et la contamination par d&#39;autres types cellulaires, notamment les leucocytes, doit être évité autant que possible 2. La plupart des techniques actuelles, y compris la semelle approuvé par la FDA pour le dénombrement dispositif CTC, de détruire la CCT dans le cadre du processus d&#39;isolement (pour plus d&#39;informations, voir Réf. 2). Dispositif microfluidique pour capturer viables CCT est décrit, consistant en une surface fonctionnalisée avec la sélectine E en plus de la glycoprotéine d&#39;anticorps contre des marqueurs 3 épithéliales. Pour améliorer la performance dispositifperformance d&#39;un revêtement de nanoparticules a été appliqué consistant en nanotubes halloysite, une nanoparticule d&#39;aluminosilicate récolté à partir d&#39;argile 4. Les molécules E-sélectine fournir un moyen de capturer en mouvement rapide de la CCT qui sont pompés à travers le dispositif, donnant un avantage sur d&#39;autres dispositifs microfluidiques dans lequel fois plus de temps de traitement sont nécessaires pour fournir des cellules cibles avec suffisamment de temps pour interagir avec une surface. Les anticorps dirigés contre des cibles épithéliales fournir CTC-spécificité de l&#39;appareil, ainsi que de fournir un paramètre facilement réglable pour régler l&#39;isolement. Enfin, le revêtement de nanotubes de halloysite permet d&#39;isoler considérablement améliorée par rapport à d&#39;autres techniques en les aidant à capturer rapidement les cellules en mouvement, en fournissant plus grande surface pour l&#39;adsorption des protéines, et de repousser les leucocytes contaminants 3,4. Ce dispositif est réalisé par une technique simple en utilisant off-the-plateau matériaux, et a été utilisée avec succès pour capturer les cellules cancéreuses dans le sang du cancer métastatiquepatients atteints de cancer. Les cellules capturées sont maintenus jusqu&#39;à 15 jours de culture après isolement, et ces échantillons se composent généralement de&gt; 50% des cellules cancéreuses viables primaires de chaque patient. Ce dispositif a été utilisé pour capturer à la fois viable CCT sang total dilué et échantillons couche leuco-plaquettaire. En fin de compte, nous présentons une technique avec des fonctionnalités dans un environnement clinique pour développer des thérapies du cancer personnalisés.

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Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Cellules tumorales circulantes sont isolés du sang de patients atteints de cancer sans infliger des dommages cellulaires. Isolement des cellules tumorales est accomplie en utilisant une surface bimoléculaire de E-sélectine en plus d&#39;anticorps contre des marqueurs épithéliales. Un revêtement de nanotubes de promouvoir spécifiquement l&#39;adhésion cellulaire du cancer résultant en des puretés de capture élevés.

Isolement rapide des cellules tumorales circulantes viables partir d&#39;échantillons sanguins des patients

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

26.5K vues.  Cornell University. Cellules tumorales circulantes sont isolés du sang de patients atteints de cancer sans infliger des dommages cellulaires. Isolement des cellules tumorales est accomplie en utilisant une surface bimoléculaire de E-sélectine en plus d'anticorps contre des marqueurs épithéliales. Un revêtement de nanotubes de promouvoir spécifiquement l'adhésion cellulaire du cancer résultant en des puretés de capture élevés.

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Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

Détection et isolement des cellules du mélanome de circulation à l&#39;aide Débitmétrie photoacoustique

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Recherche

Bio-ingénierie

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Amélioration de la méthode pour la préparation d&#39;une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Isolation des gouttelettes lipidiques cellulaires: deux techniques de purification partir de cellules de levure et placentas humains

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Isolation des droits de cellules primaires de tumeurs du côlon à partir de tissus chirurgicaux et les cultivant directement sur élastique souple substrats pour Traction cytométrie

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Isolement des cellules souches mésenchymateuses du périoste alvéolaire humaine et les effets de la vitamine D sur activité ostéogène du périoste dérivées des cellules

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

L’acide hyaluronique basée Hydrogels pour 3-Dimensional Culture de cellules de glioblastome dérivé de Patient

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create anatomically accurate head phantoms with realistic brain imaging properties because standard fabrication methods are not optimized to replicate any patient-specific anatomical detail and 3D printing materials are not optimized for imaging properties. In order to test and validate a novel navigation system for use during brain tumor surgery, an anatomically accurate phantom with realistic imaging and mechanical properties was required. Therefore, a phantom was developed using real patient data as input and 3D printing of molds to fabricate a patient-specific head phantom comprising the skull, brain and tumor with both ultrasound and X-ray contrast. The phantom also had mechanical properties that allowed the phantom tissue to be manipulated in a similar manner to how human brain tissue is handled during surgery. The phantom was successfully tested during a surgical simulation in a virtual operating room.
The phantom fabrication method uses commercially available materials and is easy to reproduce. The 3D printing files can be readily shared, and the technique can be adapted to encompass many different types of tumor.

This protocol describes the fabrication of a patient specific skull, brain and tumor phantom. It uses 3D printing to create molds, and polyvinyl alcohol (PVA-c) is used as the tissue mimicking material.

Fabrication fantôme d’alcool de polyvinyle patient-spécifique avec l’ultrason et le contraste de rayon X pour la planification de chirurgie de tumeur de cerveau

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Tissu conjonctif humain dérivé de fibroblastes pour les applications de dépistage

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.