Ce travail a été financé par le NIH octroi # DA15169 à HEM

Présentation de la procédure: En utilisant cette approche, protéines de surface cellulaire sont marqués à la biotine de façon covalente sur les résidus lysine disponibles extracellulaire en utilisant une membrane imperméants, réactif biotinylation disulfure couplé (sulfo-NHS-SS-biotine) sous des conditions restrictives du trafic (c&#39;est à dire à basse température) (voir Fig 1. pour l&#39;illustration). Un ensemble de cellules est déplacé à la traite des conditions permissives (37 ° C) et des protéines biotinylées intérioriser. L&#39;autre série de cellules sont maintenus à basse température que les contrôles pour 1) la protéine de surface totale au temps = 0, et 2) le contrôle de décapage. Après une courte période d&#39;internalisation, les cellules sont décalées de retour à basse température pour arrêter l&#39;internalisation, et tout biotine résiduelle de surface est enlevé en traitant les cellules avec un agent réducteur, qui clive la biotine couplée disulfure. Protéines biotinylées qui découlent de la surface cellulaire et ont été intériorisées sont protégés de l&#39;étape d&#39;extraction, et seront les seules protéines biotinylées qui restent. Après la lyse des cellules, des protéines biotinylées sont isolés par chromatographie d&#39;affinité et la streptavidine la protéine d&#39;intérêt est détectée par immunoblot quantitatif. Pour déterminer le taux d&#39;endocytose, la quantité de protéines intériorisées est comparée à la surface totale de contrôle étiquetés au temps = 0. Nous avons utilisé avec succès cette approche pour mesurer le taux d&#39;internalisation de la noradrénaline et la dopamine neuronale 1 1-4 transporteurs. Protocole détaillé: Jour 1: <ol><li> Cellules de la plaque en plaque de 6 puits de telle sorte qu&#39;ils seront confluentes à 80% le jour 2. Alternativement, si les cellules transfectées sont utilisées, transfecter à une densité telle qu&#39;ils seront confluentes ~ 80% à la fois le taux d&#39;internalisation seront mesurés. Si les cellules ne sont pas fortement adhérente, articles de culture de tissus doivent être traitées avec un substrat d&#39;adhésion cellulaire (par exemple, la poly-D-lysine) pour prévenir la perte cellulaire durant les étapes de lavage extensif. </li><li> Pour chaque protéine testée, plaque 2 puits sur une plaque à être utilisé comme la protéine de surface totale (t = 0) et les commandes de décapage. Sur une seconde plaque, la plaque d&#39;un puits pour chaque condition de l&#39;internalisation testé (ie taux basal endocytose vs traités par le médicament). </li><li> Préparer les solutions suivantes et conserver à la température indiquée pour une utilisation sur Jour 2: <ul><li> PBS 2 +: tampon phosphate salin (pH 7,4) additionné de 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM CaCl 2, (4 ° C) </li><li> Biotinylation Quench Solution: 2 + PBS supplémenté avec 100 mM de glycine, (4 ° C) </li><li> NT tampon: NaCl 150 mM, 1,0 mM EDTA, 0,2% de BSA, Tris 20 mM, pH 8,6, (4 ° C) </li><li> Tampon RIPA: Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1,0 mM EDTA, 0,1% SDS, 1,0% de Triton X 100, le désoxycholate de sodium 1,0%, (4 ° C) </li><li> Solution stock sulfo-NHS-SS-biotine: Dissoudre dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 200 mg / ml, (-20 ° C) </li><li> Tris (2-carboxyéthyl) phosphine Hydrochloride solution mère (PTCE): 500 mm H 2 O, (-20 ° C, couvert de papier d&#39;aluminium pour bloquer la lumière) </li></ul></li></ol> Jour 2: <ol><li> Préparer PBS 2 + supplémenté en glucose 0.18g/ml, 0,2% d&#39;IgG / protéase sans sérum albumine bovine (PBS + 2 / g / BSA). Préchauffer cette solution à 37 ° C au bain-marie. </li><li> Dégeler la solution stock sulfo-NHS-SS-biotine sur la paillasse pour faire fondre le DMSO. Immédiatement avant utilisation, préparer fraîche sulfo-NHS-SS-biotine solution (2,5 mg / ml dans PBS glacé 2 +, suffisante pour 0,75 ml / puits). Vortex la solution vigoureusement pour solubiliser le DMSO. Notez que le réactif NHS-biotine est facilement hydrolysé en solution aqueuse. Par conséquent, toutes les solutions doivent être préparées immédiatement avant leur utilisation. </li><li> Biotinylation: plaques Placer sur un bain de glace dans la chambre froide et rincez 3 x 2 ml avec PBS glacé 2 +. Soyez certains que les plaques sont légèrement inclinés pour permettre le drainage et l&#39;enlèvement de la solution tampon. Ajouter 0,75 ml / puits de la fraîcheur sulfo-NHS-SS-biotine solution à chaque puits. Incuber x 15 &#39;, 4 ° C sur le bain de glace avec une agitation vigoureuse. Après l&#39;incubation est terminée, préparer une autre frais sulfo-NHS-SS-biotine solution. Remplacer l&#39;ancienne solution avec la solution douce et incuber x 15 &#39;, 4 ° C. </li><li> Trempe: Il est essentiel que tous les non-réagir NHS-biotine molécules sont trempés, de sorte qu&#39;ils ne réagissent pas avec et biotinyler protéines intracellulaires fois que les cellules sont lysées. Laver les cellules de 3 x 2 ml avec une solution de trempe et incuber deux fois dans une solution à 2 ml étancher x 15 &#39;, 4 ° C en agitant doucement. </li><li> Internalisation: Si les traitements médicamenteux sont à l&#39;essai, ajoutez la concentration du médicament approprié pour PBS 2 + / g / BSA. Gardez plaque de contrôle à 4 ° C et mettre la plaque d&#39;internalisation de la chambre froide. Laver 3 x 2 ml avec du PBS préchauffé 2 + / g / BSA (+ / - drUGS) et laisser dans les mêmes solutions (2 ml / puits). Remplir les puits vides avec préchauffé solution pour assurer une température uniforme dans toute la plaque. Transférer les cellules à un incubateur à 37 ° C pendant 10 &#39;. Immédiatement avant la fin de l&#39;incubation à 37 ° C, de préparer une nouvelle solution PTCE 50 mM dans un tampon de NT à être utilisé pour l&#39;étape de décapage et de stocker sur la glace. Préparer une quantité suffisante pour 1,0 ml / puits. </li><li> Décapage: plaque de transfert Immédiatement (s) au bain de glace et revenir à une chambre froide. Rapidement laver les cellules avec du tampon glacée NT, 3 x 2 ml pour arrêter l&#39;endocytose. Lavez aussi bande de contrôle des puits 3 x 2 ml avec du tampon NT. Ajouter 1,0 ml de solution fraîche de décapage à chaque puits. Incuber dans la glace, 15 &#39;, 4 ° C avec agitation douce. Remplacer les puits avec la solution de décapage frais et incuber un supplément de 15 &#39;, 4 ° C sur la glace. </li><li> Lysis: Laver tous les puits qui ont été exposés à la solution de décapage, 3 x 2 ml de tampon NT. Puis, lavez tous les puits (y compris les contrôles au total) avec 3 x 2 ml de PBS 2 +. Lyse de 300μl/well tampon RIPA (ou un tampon de lyse d&#39;autres compatibles pour la protéine d&#39;intérêt) contenant des inhibiteurs de protéase frais (1,0 mM PMSF, 1,0 ug / ml chacun leupeptine, aprotinine et pepstatine). Lyse en secouant x 20 &#39;, 4 ° C. Transfert à microtubes de clair et de débris cellulaires par centrifugation 18 000 xg, 10 &#39;, 4 ° C. </li><li> Détermination de la concentration de protéines: Utiliser un dosage de protéines compatible avec vos conditions de lyse (dosage de la protéine par exemple, DC, Bio-Rad) pour déterminer la concentration en protéines des lysats par rapport à une courbe standard de BSA. </li><li> Streptavidine chromatographie d&#39;affinité: Préparer avec les microtubes de quantités équivalentes de protéines pour chaque échantillon. Ajouter un tampon de lyse pour apporter volume final de chaque échantillon à 200 pl. Vortex la streptavidine billes d&#39;agarose vigoureusement à apporter à une suspension uniforme. Aide d&#39;une pipette 200 pl avec le bout coupé, perles pipette dans chaque tube. Recommandée 20 pi beads/50 lysat ug. Incuber une nuit à 4 ° C sur un agitateur de tube. </li></ol> Jour 3: <ol><li> Laver perle: Centrifuger les échantillons, 18000 xg, 2 &#39;pour collecter des perles. Aspirer lysat, en faisant attention de ne pas s&#39;approcher perles culot avec un aspirateur. Utiliser un embout de pipette en plastique à l&#39;extrémité de l&#39;aspirateur pour un meilleur contrôle. Ajouter 0,75 ml de tampon de lyse dans chaque tube, et le vortex de se laver les perles. Centrifuger les échantillons, 18000 xg, 2 &#39;pour collecter des perles et des aspirations de répétition et laver deux fois (trois lavages au total). Après le lavage final, aspirer autant de la mémoire tampon que possible, sans perturber le culot de billes. Tipping the tube vers l&#39;aspirateur aide à cette étape. </li><li> Élution de l&#39;échantillon: 20-Ajouter 25 pi de tampon d&#39;échantillon de Laemmli 2x (réduction) à chaque tube. L&#39;agent réducteur sera cliver la liaison disulfure NHS-SS-biotine, libérant les protéines isolées en solution. La plupart des protéines membranaires sont très vulnérables à l&#39;agrégation une fois bouillie, et ne doit pas être chauffé avant le chargement sur des gels pour SDS-PAGE. Déterminer la sensibilité thermique de votre protéine d&#39;intérêt avant de procéder à ces expériences. Si la protéine ne peut pas tolérer de chauffage bouillante /, incuber sur un agitateur, 30 &#39;, la température ambiante avant l&#39;analyse par SDS-PAGE. Cela est suffisant pour cliver la liaison disulfure et éluer les protéines. </li><li> SDS-PAGE et immunoblot: séparer les protéines par SDS-PAGE. Pour chaque échantillon, il est plus facile d&#39;exécuter les échantillons dans l&#39;ordre suivant: la surface totale (temps = 0), la bande, l&#39;état de l&#39;internalisation # 1, # 2 Condition, etc Transfert à membrane pour immunoblot et épongez avec un anticorps approprié pour votre protéine d&#39;intérêt. Capturez des bandes immunoréactives à l&#39;aide d&#39;un système de caméra CCD gel de la documentation, étant certain qu&#39;il n&#39;ya pas de pixels saturés. Quantifier chacun densité de la bande en utilisant un gel d&#39;analyse / densitométrie logiciel. </li></ol> Les résultats représentatifs: Un résultat immunoblot représentatif est montré dans la figure 2A. Le signal le plus fort est dans le «total» Lane (T), qui est le montant total de la protéine de surface avant de l&#39;internalisation. La &quot;bande&quot; de contrôle (S) devrait idéalement être proche de vide, ce qui démontre que la bande a été efficace pour l&#39;expérience. L&#39;efficacité de bande est calculée en comparant la densité de la &quot;bande&quot; voie à celle de la &quot;totale&quot; Lane (protéines par exemple qui a été biotinylé en parallèle avec la bande, mais ne fut ni chauffé à 37 ° C, ni exposés à la solution de décapage). La formule suivante est utilisée: [1 - (bande / total)] * 100% En utilisant cette formule, la bande à la figure 2 était de 99,8% d&#39;efficacité. Enfin, vous pourrez voir des bandes de moindre intensité que le total dans la voie de l&#39;internalisation (s) (I). Dans l&#39;exemple (figure 2), les cellules traitées ont été traités soit avec un véhicule ou d&#39;acétate de phorbol myristate 1 uM (PMA) au cours d&#39;un 10 &#39;taux d&#39;internalisation et de la dopamine internalisation du transporteur ont été mesurés pour un 10&#39; période d&#39;intériorisation initiale. Le taux est calculé comme intériorisationsuit: intériorisé / total * 100 Comme le montre la figure 2B, la surface de 10,4% DAT intériorisé plus de 10 &#39;sous le véhicule traités conditions. PMA un traitement a augmenté les taux d&#39;internalisation DAT à 23,2% de la surface totale DAT. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Cellules illustration Protocole. Biotinylés sont à 4 ° C à l&#39;étiquette exclusivement la population de surface, et sont décalés à 37 ° C pour initier l&#39;internalisation. Après internalisation, les cellules sont rapidement refroidis pour arrêter les processus d&#39;endocytose et la biotine de surface résiduelle est dépouillé en traitant les cellules avec un agent réducteur. Les seules protéines biotinylées qui restent sont ceux qui découlent de la surface à l&#39;instant t = 0 et ont été intériorisées, les protégeant ainsi du traitement de décapage. Protéines biotinylées sont isolés par chromatographie d&#39;affinité par lots avec des perles de streptavidine et la protéine d&#39;intérêt est détectée par immunoblot. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Activation des PKC augmente la DAT taux d&#39;endocytose. Dosage de l&#39;internalisation. Les cellules PC12 exprimant de façon stable DAT ont été biotinylées, 4 ° C comme décrit dans &quot;Protocole détaillé». Les cellules ont été rapidement chauffé à 37 ° C ± 1 uM PMA et incubés 10 &#39;, 37 ° C Biotine résiduel a été dépouillé par la réduction, les cellules ont été lysées et les protéines biotinylées ont été isolés par chromatographie d&#39;affinité streptavidine. (A) immunoblot montrant Représentant DAT surface totale à l&#39;instant t = 0 (T), bande de contrôle (S), et internalisée DAT (I) dans les conditions indiquées. (B) bandes ont été capturées avec une caméra CCD et quantifiés avec quantité de données du logiciel (Bio-Rad). Les données sont exprimées en% total DAT min internalized/10. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Exemple illustrant immunoblot une bande mauvaise biotine. Internalisation dosage. Les cellules PC12 exprimant de façon stable DAT ont été biotinylées, 4 ° C comme décrit dans &quot;Protocole détaillé». Les cellules ont été rapidement chauffé à 37 ° C et incubés 10 &#39;, 37 ° C Biotine résiduel a été dépouillé par la réduction, les cellules ont été lysées et les protéines biotinylées ont été isolés par chromatographie d&#39;affinité streptavidine. L&#39;immunoblot montre DAT surface totale à l&#39;instant t = 0 (T), bande de contrôle (S), et internalisée DAT (I). Notez la bande visible dans la voie de bande de contrôle, indicative de l&#39;efficacité de bande pauvres.

<ol>
	<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent.">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+transporter+endocytic+determinants:+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization.">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li></ol>

Les problèmes courants: Le problème le plus fréquent qui se pose dans ces expériences est l&#39;efficacité de bande pauvres. L&#39;efficacité de la bande est essentiel d&#39;être capable d&#39;interpréter les résultats. Sauf si la bande a été très efficace, il n&#39;est pas possible de conclure que toutes les protéines biotinylées dans les ruelles internalisation ont été, en fait, intériorisé de la surface. Bandes d&#39;efficacité ≥ 90% sont optimales, et nous jetez aucun résultat, si la ban...

measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation

Protéines membranaires sont d&#39;un grand groupe diversifié de protéines composé de récepteurs, canaux ioniques, les transporteurs et les pompes. Activité de ces protéines est responsable d&#39;une variété de clés des événements cellulaires, y compris la livraison des nutriments, l&#39;excitabilité cellulaire, et la signalisation chimique. Beaucoup de protéines membranaires sont réglementés de façon dynamique par le trafic endocytaire, qui module la fonction des protéines en modifiant l&#39;expression des protéines de surface. Les mécanismes qui facilitent l&#39;endocytose des protéines sont complexes et ne sont pas pleinement compris pour des protéines membranaires nombreuses. Afin de bien comprendre les mécanismes qui contrôlent le trafic endocytaire d&#39;une protéine donnée, il est essentiel que le taux de la protéine S endocytose être mesurés avec précision. Pour de nombreux récepteurs, des mesures directes de taux d&#39;endocytose sont souvent obtenus en utilisant des ligands de récepteurs marqués. Cependant, pour plusieurs classes de protéines membranaires, comme les transporteurs, les pompes et les canaux ioniques, il n&#39;ya pas de ligand pratique qui peut être utilisé pour mesurer le taux d&#39;endocytose. Dans le présent rapport, nous décrivons une méthode biotinylation réversibles que nous utilisons pour mesurer le transporteur de la dopamine (DAT) Taux endocytose. Cette méthode offre une approche simple pour mesurer les taux d&#39;internalisation, et peut facilement être employée pour des études de trafic plupart des protéines membranaires.

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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Endocytose régulée régit les niveaux de surface des cellules d&#39;expression de la majorité des protéines membranaires. Ici, nous utilisons réductible, réactifs à membrane biotinylation imperméants pour mesurer le taux d&#39;endocytose du transporteur de la dopamine (DAT), une protéine membranaire polytopique. La méthode facilite une approche simple pour mesurer le taux d&#39;endocytose de la plupart des protéines de la membrane plasmique.

Mesure du taux plasmatique des protéines membranaires par endocytique Biotinylation réversible

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.9K vues.  University of Massachusetts Medical School. Endocytose régulée régit les niveaux de surface des cellules d'expression de la majorité des protéines membranaires. Ici, nous utilisons réductible, réactifs à membrane biotinylation imperméants pour mesurer le taux d'endocytose du transporteur de la dopamine (DAT), une protéine membranaire polytopique. La méthode facilite une approche simple pour mesurer le taux d'endocytose de la plupart des protéines de la membrane plasmique.

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Mesure Proche membrane plasmique et mondiale dynamique du calcium intracellulaire dans les astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Recherche

Biologie

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell membrane, resulting in a voltage across the membrane. This voltage, termed the induced membrane voltage (also induced transmembrane voltage, or induced transmembrane potential difference) and denoted by &Delta;&Phi;, exists only as long as the external field is present. If the resting voltage is present on the membrane, the induced voltage superimposes (adds) onto it. By using one of the potentiometric fluorescent dyes, such as di-8-ANEPPS, it is possible to observe the variations of &Delta;&Phi; on the cell membrane and to measure its value noninvasively. di-8-ANEPPS becomes strongly fluorescent when bound to the lipid bilayer of the cell membrane, with the change of the fluorescence intensity proportional to the change of &Delta;&Phi;. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS and also demonstrates the influence of cell shape on the amplitude and spatial distribution of &Delta;&Phi;.

External electric field induces a voltage on the membrane of a cell, termed the induced membrane voltage (&Delta;&Phi;). By using the potentiometric dye di-8-ANEPPS, it is possible to measure the &Delta;&Phi; noninvasively. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS.

Mesurer la tension de membrane induite avec Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Mesure quantitative de GLUT4 Translocation à la membrane plasmique par cytométrie en flux

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Cartographie Diffusion moléculaire dans la membrane plasmique par multiple-cible de Recherches (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Cristaux de récolte et de Cryo-refroidissement de protéines membranaires cultivées dans des mésophases lipidiques pour la détermination de la structure par cristallographie macromoléculaire

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Les analyses en temps réel des Transports rétinol par le récepteur membranaire de plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasma Membrane déformations Avec pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

Membrane Transport processus analysés par un système hautement parallèle Nanopore Chip à protéine unique Résolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Détermination de la Membrane plasmique partitionnement pour les protéines associées à la périphérie

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...