Cet essai a été développé pour répondre aux questions clés dans le domaine de la biologie de membrane de plasma et pour établir comment les cellules efficacement endommagées peuvent réséaliser leur membrane plasmatique. Cette technique peut être utilisée pour mesurer l’efficacité de la membrane plasmatique resealing dans une capacité de haut débit et pour identifier les protéines spécifiques et les voies correspondantes qui médiation de la membrane plasmatique resealing. Commencez par ajouter 20 millilitres d’un 2,5 fois 10 à la cinquième cellules HeLa par millilitre de suspension moyenne de croissance dans un bassin stérile pipette et utiliser une pipette sérologique de 10 millilitres pour bien mélanger les cellules.
Ensuite, utilisez une micropipette multicanal pour ensemencer 100 microlitres de cellules par puits en triplicate dans une plaque traitée à fond plat et clair de 96 puits. Rappelez-vous qu’une distribution homogène de cellules est la clé d’une expérience réussie car les comparaisons entre toutes les conditions expérimentales nécessitent des nombres de cellules équivalents. Après 24 heures dans l’incubateur humidifié de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de CO2, préchauffer le lecteur de plaque à 37 degrés Celsius et définir la configuration optique au monochromateur, le mode de lecture à la fluorescence, et le type de lecture à cinétique.
Dans les réglages de longueur d’onde, sélectionnez une excitation de neuf nanomètres et un bandpass d’émission de 15 nanomètres. Pour les analyses utilisant l’iodure de propidium, réglez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission à 535 nanomètres et 617 nanomètres, respectivement. Sous le type de plaque, sélectionnez 96 puits pour le format de plaque, et sélectionnez une configuration prédéfini de plaque correspondant à une plaque inférieure claire de mur noir.
Sous la zone de lecture, mettre en évidence les puits qui seront analysés tout au long de l’analyse cinétique. Sous PMT et optique, prédéfinis les flashs par lecture à six et cochez la case pour lire en bas. Dans le cadre du chronométrage, entrez zéro heure 30 minutes et zéro seconde dans le temps de course total pour un test cinétique de 30 minutes et entrez zéro heure cinq minutes et zéro seconde pour l’intervalle.
Confirmez les paramètres spécifiés dans les informations de paramètres et cliquez sur OK. Cliquez ensuite sur lire pour lancer la course cinétique. Pour définir les paramètres d’imagerie dans le mode paramètres, définissez MiniMax pour la configuration optique, l’imagerie pour le mode lecture et le point de terminaison pour le type de lecture. Sous les longueurs d’onde, sélectionnez la lumière transmise et les boîtes de fluorescence appropriées correspondant aux longueurs d’onde expérimentales d’excitation et d’émission.
Définissez le type de plaque et la zone de lecture comme vous venez de le démontrer et sous le réglage de la zone du puits, définissez le nombre de sites à l’intérieur d’un puits à imager. Dans les paramètres d’acquisition d’images de GFP, réglez l’appareil pour l’image de l’ensemble du puits avec un temps d’exposition de 20 millisecondes par image. Pour la lumière transmise, acquérir une seule image du centre de chaque puits avec un temps d’exposition de huit millisecondes.
Pour l’iodure de propidium, acquérir une seule image au centre de chaque puits avec un temps d’exposition de 20 millisecondes. Ensuite, confirmez les paramètres dans les paramètres d’information et cliquez sur OK et lire pour lancer l’imagerie. Pour configurer un essai à base de fluorescence à haut débit pour les conditions permissives de réparation, lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres de 37 degrés Celsius M1 moyen par puits et ajoutez 100 microlitres de milieu M1 frais de 37 degrés Celsius complété par 30 iodure de propidium micromolaire après avoir jeté le deuxième lavage.
Pour des conditions restrictives de réparation, lavez les cellules une fois avec 200 microlitres de 37 degrés Celsius M2 moyen complété par egta millimolar par puits suivi d’un lavage avec 200 microlitres de M2 seul moyen. Après avoir jeté le deuxième lavage, ajouter 100 microlitres de milieu M2 frais de 37 degrés Celsius complété par 30 iodure de propidium micromolaire par puits. Puis l’image de la plaque sous la lumière transmise, GFP, et PI comme vient de le démontrer.
Pendant que la plaque est en cours d’image, placez une microplaque de polypropylène fond rond de 96 puits sur la glace et configurez la plaque comme cela vient d’être démontré pour la plaque précédente. Pour réparer les conditions permissives, ajouter 100 microlitres de glace froide M1 moyenne complétée par 60 iodure propidium micromolaire par puits suivie de l’ajout de 100 microlitres de glace froide M1 avec ou sans 4X listeriolysin O par puits. Pour les conditions restrictives de réparation, ajouter 100 microlitres de glace froide M2 moyenne complétée par 60 iodure propidium micromolaire par puits suivie de l’ajout de 100 microlitres de glace froide M2 avec ou sans 4X listeriolysin O par puits.
Il est impératif de préparer la listeriolysine O à la concentration expérimentale appropriée sur la glace environ cinq minutes avant le début de l’analyse cinétique lorsque la plaque 1 est sur la glace et que la plaque deux est en préparation. Lorsque la première plaque est terminée imagerie, transférer immédiatement la plaque sur une feuille de papier d’aluminium sur la glace. Après cinq minutes, transférer 100 microlitres de chaque puits de la deuxième plaque au puits correspondant approprié dans la première plaque refroidie, en insérant les pointes de pipette sous le ménisque de la solution dans chaque puits avant d’éjecter le volume sans mélanger pour une bonne distribution de la toxine.
Laissez la toxine se lier aux cellules hôtes pendant une minute et transférez immédiatement la première plaque au lecteur de plaque pour l’analyse post-cinétique à l’aide du mode spectrofluoromètre. À la fin de l’essai cinétique, acquérir immédiatement une image post-cinétique de l’image de plaque telle que démontrée pour l’imagerie précinétique. Pour déterminer le nombre de cellules en fonction de la fluorescence nucléaire, dans le logiciel de énumération des cellules microplaquées dans les paramètres, sélectionnez la ré-analyse et, dans les paramètres d’analyse d’images, sélectionnez l’analyse discrète des objets en utilisant 541 comme longueur d’onde pour trouver des objets.
Dans l’option trouver des objets, utilisez le tirage au sort sur la méthode de recherche d’images, sélectionnez les noyaux, et cliquez sur appliquer, puis cliquez sur OK et lire pour lancer l’algorithme de comptage cellulaire. L’expression de GFP n’interfère pas avec des mesures d’intensité d’iodure de propidium en présence ou en absence du traitement de listeriolysine O. L’expression de l’iodure de propidium peut saigner par fluorescence de GFP comme démontré par une augmentation de l’intensité de fluorescence de GFP dans les cellules de H2B-GFP d’HeLA dans l’essai post-cinétique de formation image comparée à l’analyse précinétique.
Fait important cependant, ce croisement n’affecte pas le comptage cellulaire, car le processus de segmentation impliqué dans l’énumération des noyaux n’est pas affecté par une augmentation de la fluorescence GFP. En l’absence de listeriolysine O, l’intégrité de la membrane plasmatique reste constante en présence ou en l’absence de calcium extracellulaire, tandis que le traitement de listeriolysine O en présence de calcium complété moyen entraîne une augmentation constante de l’intensité de fluorescence iodée propidium. En l’absence de calcium extracellulaire cependant, il y a une augmentation sensiblement plus raide de fluorescence d’iodure de propidium, reflétant l’absence de résealing de membrane.
Alternativement, un colorant liant d’acide nucléique de carbocyanine avec la fluorescence dans le rouge lointain peut être substitué à l’iodure de propidium pour réduire au minimum le chevauchement spectral avec GFP. En outre, le coefficient d’excitation plus élevé pour le colorant rouge lointain présente un rapport signal/bruit plus élevé et une meilleure résolution entre les conditions de réparation permissives et restrictives de réparation. Lors de la tentative de cette procédure, il est recommandé d’étiqueter tous les tubes un jour avant l’expérience, car cela vous préparera à toute la préparation du réaccente le jour de l’expérience.
Après cette procédure, d’autres méthodes comme la cytométrie d’image peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, telles qu’un pore formant la toxine endommage toutes les cellules uniformément ou certaines cellules sont plus sensibles que d’autres. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans les domaines des maladies infectieuses et de la réparation des membranes plasmatiques afin d’explorer les effets de la taille des pores sur l’efficacité de réparation des différents types de cellules.
