Ce projet a été financé par le ministère de l&#39;Illinois de la santé publique et de la National Science Foundation (DBI-0852416).

1. Fonctionnement de l&#39;appareil <ol><li> Le dispositif d&#39;insertion hypoxiques contient 6 piliers qui nichent dans une norme de 6 puits assiette. Flux de gaz dans le pilier, à travers un réseau microfluidique à la base du pilier, et reflue hors de l&#39;appareil. A la base du pilier formant la paroi du fond du microcanal est un 100 um d&#39;épaisseur perméable aux gaz membrane de PDMS qui permet la diffusion d&#39;oxygène entre le gaz microcanaux et des médias de la culture. Ainsi, le dispositif fonctionne en créant un gradient de concentration qui anime la concentration en oxygène des médias vers une valeur souhaitée. </li><li> L&#39;appareil offre un certain nombre d&#39;avantages sur la chambre hypoxique et d&#39;autres systèmes d&#39;oxygénation cellulaire: 1) minimise le chemin diffusion de l&#39;oxygène permettant un contrôle plus rapide temporelle, 2) améliore le contrôle spatial de plus d&#39;oxygénation, comme dépendant de la conception des piliers de microcanaux, 3) possède une plus petite empreinte de laboratoire et un débit plus élevé pour augmenter l&#39;efficacité expérimentale, et 4) s&#39;adapte à des outils communs de culture cellulaire (par exemple la plaque multipuits) sans l&#39;exigence de connaissances et d&#39;équipements spécialisés. </li></ol> 2. Fabrication de dispositifs <ol><li> D&#39;abord le tableau pilier est moulé avec PDMS réplique dans un moule préalablement usinées Delran. </li><li> Suivant le gaz microcanaux au bas de chaque pilier est fabriqué en utilisant la norme SU-8 photolithographie et de moulage de PDMS réplique. </li><li> Le gaz membrane perméable est fabriqué en faisant tourner défini de PDMS sur un wafer de silicium pour obtenir l&#39;épaisseur désirée. Dans cet exemple nous utilisons une membrane 100 um d&#39;épaisseur qui a été fabriquée en faisant tourner 500 rpm pendant 10 secondes, puis 900 rpm pendant 30 secondes. </li><li> Tous les composants sont collés ensemble après le traitement par plasma d&#39;oxygène avec un appareil de poche de plasma (modèle BD-20, Produits Electro-Technic). </li></ol> 3. Configuration des périphériques <ol><li> Insérez doucement appareil dans la plaque, en veillant à éviter les bulles. Pêche du périphérique lors de l&#39;insertion aide à expulser les bulles d&#39;un côté. Pour réelles basées sur les cellules expériences, cette étape doit être fait à l&#39;intérieur d&#39;une hotte à flux laminaire stérile. Les chances de contamination sont considérablement réduits une fois que le dispositif est inséré, de sorte que le montage peut être reporté sur l&#39;incubateur dans un environnement non stérile. </li><li> Relier les tubes du réservoir de gaz source pour les ports d&#39;entrée et de sortie du dispositif. À base de cellules expériences, l&#39;incubateur de culture doit avoir un trou pour permettre l&#39;entrée des tubes et les tuyaux doivent être connectés après la réalisation de l&#39;appareil et de le placer dans l&#39;incubateur. Soyez prudent pour éviter de mettre une pression excessive sur l&#39;appareil, ce qui pourrait déformer le PDMS suffisante pour écraser les cellules sous-jacentes. </li><li> Assurez-vous que le régulateur de débit de précision est fermé avant d&#39;ouvrir le régulateur débardeur pour éviter tout débordement de l&#39;appareil. Démarrer le flux de gaz. Régulateur de débit doucement ouverte de précision pour le débit souhaité (50-100 mL / min). Regardez la valeur de près au cours de la prochaine heure et faire les ajustements nécessaires, depuis la chute de pression va changer tout le système s&#39;équilibre, en modifiant le débit. Pour éviter la formation de bulles dans les médias, de réduire le débit d&#39;entre 10-20 ml / min après une durée d&#39;équilibration initiale de 15 minutes avec le débit plus élevé. </li><li> Après une durée expérimentale voulue, arrêter le débit de gaz, enlever la plaque, et les cellules traiter en conséquence (par exemple, Lyse, teinture, compter, etc.) </li></ol> 4. Validation de périphérique <ol><li> Calibration <ol><li> Sélectionnez le nombre et l&#39;emplacement des postes de l&#39;oxygène fluorescentes Faire glisser le capteur (Foxy) (selon les exigences de validation) qui sera utilisé pour la mesure de l&#39;oxygène. La diapositive contient un revêtement ruthénium colorant fluorescent qui est trempé par l&#39;oxygène. </li><li> Exposer glisser directement à 0, 10 et 21% d&#39;oxygène du réservoir de gaz et de capturer des images après 5 minutes pour atteindre l&#39;équilibre approprié. </li><li> Exporter l&#39;intensité de l&#39;image moyenne pour chaque position et la concentration d&#39;oxygénation parcelle dépend de l&#39;intensité fluorescente. </li><li> Générer courbe d&#39;étalonnage en ajustant les courbes linéaires à la ligne de 0-10% et 10-21% en ligne. </li></ol></li><li> Hétérogénéité <ol><li> Établir des points multiples couvrant la largeur de la voie à un intervalle défini (par exemple tous les 1 mm). Notez qu&#39;il peut y avoir un chevauchement d&#39;images en fonction de l&#39;espacement. </li><li> Mesurer la concentration d&#39;oxygène à la surface du puits à travers le dispositif </li></ol></li><li> Equilibration <ol><li> Choisir trois points sur la diapositive dans laquelle FOXY pour mesurer la concentration d&#39;oxygène. </li><li> Immédiatement après la capture d&#39;une première image à des niveaux d&#39;oxygène ambiant, ouvrez le régulateur de débit de précision pour commencer écoulement du gaz dans le dispositif. Capture d&#39;images à un intervalle approprié pour évaluer la durée et l&#39;étendue de l&#39;oxygène concentréquilibration tion (par exemple toutes les 10 secondes pendant 30 min.) </li></ol></li></ol> 5. Applications <ol><li> Cicatrisation <ol><li> Un jour avant l&#39;expérience, faire tremper l&#39;insert stérilisés PDMS dans un milieu sans sérum pour réduire les inhiber la formation de bulles de gaz dans le puits. </li><li> Cellules en culture à 100% de confluence dans une plaque à 6 puits. </li><li> Créer rayures droites dans les monocouches avec une pointe de pipette P200 pour simuler des blessures. </li><li> Aspirer le milieu cellulaire, rincez avec les médias de 5 ml, et aspirer à nouveau. Il est important de ne pas perturber la monocouche de cellules. </li><li> Remplir le puits avec 4 ml milieu sans sérum pour réduire la prolifération cellulaire. </li><li> Placez l&#39;insérer dans le puits et relier chaque puits à une concentration d&#39;oxygène correspondant. </li><li> Placer la plaque de 6 puits avec insert sur scène chauffée à 37 ° C. </li><li> Capture d&#39;images laps de temps des cellules à l&#39;intervalle désiré et la durée totale. T_Scratch MATLAB, un algorithme de mesure des plaies, peut être utilisé pour analyser la surface cicatrisée. </li></ol></li></ol> 6. Les résultats représentatifs <ol><li> Dispositif de validation Le dispositif d&#39;insertion hypoxiques expositions de grandes améliorations sur la chambre hypoxique en termes de temps d&#39;équilibrage de l&#39;oxygène et l&#39;étendue, nécessitant moins de 2 minutes pour se stabiliser à l&#39;oxygène de 0,5%. La membrane ainsi dispositif de taille de l&#39;espace en bas a été le facteur déterminant de l&#39;efficacité d&#39;équilibration, avec des tailles plus grandes lacunes nécessitant plus de temps pour atteindre l&#39;état stationnaire des valeurs de concentration en oxygène. Le dispositif permet également beaucoup de contrôle sur l&#39;oxygénation spatiale dans un seul puits, permettant la formation de plusieurs conditions, et même générer un profil d&#39;oxygène cycliques à travers la surface du puits. </li><li> Cicatrisation des plaies Monocouches de cellules ont été exposées à 10% ou 21% d&#39;oxygène et la surface de la plaie a été analysé au cours du temps. Scratches exposés à l&#39;oxygène 21% fermés le plus lent et 10% plus rapide. La figure 1 montre des images d&#39;une égratignure au cours des 17 heures. Les graphiques de la figure 5 montrent le pour cent de surface de la plaie ouverte pour les deux concentrations d&#39;oxygène pour la durée de l&#39;expérience. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="Figure 1" border="0" /></a> Figure 1. Schéma et diagrammes illustrant les fonctions du périphérique. Le dispositif d&#39;insertion d&#39;oxygène est fabriqué par photolithographie classique (réseau microfluidique), le moulage réplique (microfluidique réseau et insérez échafaudage), et défini filature de PDMS (perméables aux gaz par membrane). A) Le dispositif de l&#39;oxygène imbriquées dans une plaque à 6 puits. B) Exemples de 24 et de 96 puits tableaux pilier. C) Une coupe transversale schématique d&#39;un pilier. L&#39;oxygène se jette dans l&#39;appareil grâce à l&#39;entrée et se déplace à travers un réseau microfluidique au bas de la colonne. L&#39;oxygène peut diffuser librement à travers la membrane perméable aux gaz PDMS au bas de la colonne et se dissolvent dans les milieux de culture. D) Une image au microscope montrant les différentes fonctionnalités d&#39;un pilier à canal unique d&#39;en haut, avec des messages de verre collé pour les études d&#39;équilibration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="Figure 2" border="0" /></a> Figure 2. Validation de l&#39;appareil avec des capteurs d&#39;oxygène. Tension d&#39;oxygène au sein de chaque puits a été caractérisée en utilisant un capteur d&#39;oxygène planaires ruthénium. Tous les mélanges d&#39;azote oxygène contenu équilibré et 5% de CO 2 pour mise en mémoire tampon des médias. A) Terrain illustrant l&#39;effet de la hauteur de la poste, et la distance de diffusion ainsi l&#39;oxygène entre la membrane et des cellules, sur le temps d&#39;équilibrage et d&#39;efficacité. Heights ont été établis par verre taillé messages liés au fond de l&#39;appareil. Tous les trois tailles après des temps d&#39;équilibrage rendement beaucoup améliorée au cours de la chambre hypoxique. Notez que le temps est sur une échelle logarithmique. B) Terrain dépeignant le temps d&#39;équilibration rapide de l&#39;oxygène de réponse du dispositif de 0,2 mm écart. C) multi-positions linescans ont également été prises à travers le bien sous le microcanal pour assurer l&#39;homogénéité de la concentration d&#39;oxygène introduite par le dispositif. Graphique représente la concentration d&#39;oxygène mesurée après infusion de 0%, 10% et 21% d&#39;oxygène pendant 10 min. D) Dispositif maintient efficacement l&#39;oxygène de 10% sur 5 jours. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="Figure 3" border="0" /></a> Figure 3. Expérimentation avec des dessins plus complexes d&#39;oxygène microcanal. A) configuration double-condition à microcanaux rendements stables 0% et le profil de 21% d&#39;oxygène de plus de 14 jours. B) Un motif interdigitées et sinueuses de 500 um de largeur microcanaux s&#39;étendant à travers erésultats du pilier e dans un profil d&#39;oxygène cycliques. Notez que les données représente un seul essai représentatif que l&#39;alignement a été difficile à microcanaux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="Figure 4" border="0" /></a> Figure 4. Timelapse images de 0 fermeture de la plaie, 7 et 17 heures après zéro initial. Les cellules ont été livrées en oxygène de 21% pendant toute la durée de l&#39;expérience. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="Figure 5" border="0" /></a> Figure 5. Effet de la concentration en oxygène sur le taux de cicatrisation dans un essai de zéro.

L&#39;appareil est fabriqué par la norme SU-8 photolithographie, moulage par réplique, et a défini la filature et fait entièrement de polydiméthylsiloxane. Le gaz est introduit dans le dispositif pour établir un gradient de concentration entre le pilier microcanaux et les milieux de culture, la conduite du système vers un équilibre de la concentration d&#39;oxygène désirée. Le dispositif a montré sa capacité à moduler l&#39;oxygénation temporelles et spatiales à l&#39;intérieur d&#39;un puits, ainsi que de moduler le comportement cellulaire appropriée. La structuration spatiale de l&#39;oxygénation est défini par le microcanal à la base du pilier, donc une variété de modèles pourraient être mis en œuvre dans l&#39;élaboration du photomasque. De plus, la perfusion du gaz désiré dans la phase gazeuse du puits est prévu pour améliorer le temps d&#39;équilibration et l&#39;étendue de l&#39;hypoxie. Un réseau microfluidique mélange pourrait être adapté à l&#39;appareil pour fournir un moyen de produire des mélanges de gaz roman de seulement quelques réservoirs de gaz de stock. Enfin, un mécanisme d&#39;échange de médias qui éliminerait la nécessité pour l&#39;enlèvement de l&#39;appareil de la plaque multipuits, dont les cellules peuvent réagir. L&#39;appareil a des applications dans toute expérimentation in vitro ou ex vivo nécessitant un contrôle plus la concentration en oxygène. Comme l&#39;oxygène est une variable importante physiologiques affectant une grande majorité des voies de signalisation, les domaines de recherche qui pourraient profiter est limitée par la créativité du chercheur. Certains champs qui pourraient bénéficier d&#39;un meilleur contrôle de la concentration en oxygène temporelle de comprendre les métastases du cancer, l&#39;apnée du sommeil, et les lésions de reperfusion cardiaques ischémie, parmi beaucoup d&#39;autres. Par exemple, l&#39;hypoxie intermittente a été corrélée avec des cancers plus envahissantes, upregulating un certain nombre de gènes associés à metastastis par rapport à l&#39;hypoxie continue et normoxie. Contrôle spatial est également important, comme les gradients d&#39;oxygène sont essentielles dans le développement, la zonation du foie, la toxicité des médicaments, et la niche de cellules souches. Le dispositif présenté dans cet article va bénéficier d&#39;un certain nombre de domaines de recherche en fournissant un système avec une plus petite empreinte de laboratoire, relativement simples exigences opérationnelles et de contrôle beaucoup plus grand sur l&#39;exposition d&#39;oxygène aux cellules.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PDMS-Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Planar FOXY sensor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ocean Optics</td>
<td>FOXY-SGS-M</td>
<td>Coated microscope slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega</td>
<td>FL-1472-G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gas</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>Custom mixes</td>
<td>All have 5% CO2</td>
</tr>
<tr>
<td>SU-8 2150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microchem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SAFC Biosciences</td>
<td>M3803</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>30-2020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication and operation of an oxygen insert for adherent cellular cultures 

L&#39;oxygène est un modulateur clé de nombreuses voies de signalisation cellulaire, mais les dispositifs actuels permettant<em&gt; In vitro</emModulation de l&#39;oxygène&gt; ne répondent pas aux besoins de la recherche biomédicale. La chambre hypoxique propose un système simple de contrôler l&#39;oxygénation dans des récipients de culture standard, mais manque de précision de contrôle temporel et spatial au cours de la concentration d&#39;oxygène à la surface des cellules, empêchant son application dans l&#39;étude d&#39;une variété de phénomènes physiologiques. D&#39;autres systèmes ont amélioré la chambre hypoxique, mais exigent des connaissances spécialisées et d&#39;équipements pour leur fonctionnement, ce qui les rend intimidant pour le chercheur en moyenne. Un insert microfabriqué des plaques multipuits a été développé pour contrôler plus efficacement la concentration en oxygène temporelle et spatiale des phénomènes physiologiques meilleur modèle trouvé<em&gt; In vivo</em&gt;. La plateforme se compose d&#39;un insert de polydiméthylsiloxane qui niche dans une plaque multipuits standards et sert de réseau de gaz microfluidique passive avec une membrane perméable au gaz visant à moduler l&#39;apport d&#39;oxygène aux cellules adhérentes. L&#39;appareil est simple à utiliser et est relié aux bouteilles de gaz qui fournissent la pression pour introduire la concentration d&#39;oxygène désirée dans la plate-forme. Fabrication implique une combinaison de standards SU-8 photolithographie, moulage par réplique, et défini PDMS filer sur une plaquette de silicium. Les composants de l&#39;appareil sont collés après un traitement de surface en utilisant un système de plasma à main. La validation est réalisée avec un capteur d&#39;oxygène fluorescentes planes. Temps d&#39;équilibrage est de l&#39;ordre de quelques minutes et une grande variété de profils d&#39;oxygène peuvent être atteints sur la base la conception de dispositifs, tels que le profil cyclique atteint dans cette étude, et même des gradients d&#39;oxygène pour imiter ceux trouvés<em&gt; In vivo</em&gt;. L&#39;appareil peut être stérilisés pour la culture cellulaire en utilisant des méthodes communes, sans perte de fonction. Le dispositif d&#39;application à l&#39;étude des<em&gt; In vitro</em&gt; Réponse de cicatrisation sera démontrée.

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Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabrication et validation d&#39;une plate-forme de add-on qui offre un meilleur contrôle sur l&#39;oxygénation spatiale et temporelle dans une plaque à 6 puits. Le dispositif est adaptable à un certain nombre de systèmes de culture et peut être utilisé pour étudier les effets de l&#39;oxygène sur la cicatrisation des plaies.

Fabrication et fonctionnement d&#39;un insert d&#39;oxygène pour les adhérents des cultures cellulaires

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

9.6K vues.  University of Illinois. Fabrication et validation d'une plate-forme de add-on qui offre un meilleur contrôle sur l'oxygénation spatiale et temporelle dans une plaque à 6 puits. Le dispositif est adaptable à un certain nombre de systèmes de culture et peut être utilisé pour étudier les effets de l'oxygène sur la cicatrisation des plaies.

Vidéo: Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

En fractionnement subcellulaire situ des adhérentes et non-adhérents des cellules de mammifères

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Recherche

Biologie

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Test clonogénique: cellules adhérentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Un outil analytique qui quantifie les changements de morphologie cellulaire en trois dimensions des images de fluorescence

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Un test pour évaluer le comportement des explants cellulaires du mésenchyme crânienne

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Détection, visualisation et la quantification de la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène dans un système modèle Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Développement d&#39;un système d&#39;insertion Co-culture de deux types cellulaires en l&#39;absence de Cell-Cell Contactez

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

Un modèle In Vitro pour étudier la Transformation cellulaire par Herpesvirus sarcome de Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

La microscopie vidéo sans lentille pour la dynamique et l’analyse Quantitative de la Culture de cellules adhérentes

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

Détection en temps réel de la production d’espèces réactives de l’oxygène dans la réponse immunitaire dans le riz avec un test de chimiluminescence

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of conditioned media remains time-consuming and far from physiological and pathological conditions. Although a few models of co-culture are commercially available, they remain restricted to specific assays and are mostly for two types of cells. 
Here, 3D-printed inserts are used that are compatible with numerous functional assays. The insert allows the separation of one well of a 6-well plate into four compartments. A wide range of combinations can be set. Moreover, windows are designed in each wall of the compartments so that potential intercellular communication between every compartment is possible in the culture medium in a volume-dependent manner. For example, paracrine intercellular communication can be studied between four cell types in monolayer, in 3D (spheroids), or by combining both. In addition, a mix of different cell types can be seeded in the same compartment in 2D or 3D (organoids) format. The absence of a bottom in the 3D-printed inserts allows the usual culture conditions on the plate, possible coating on the plate containing the insert, and direct visualization by optical microscopy. The multiple compartments provide the possibility to collect different cell types independently or to use, in each compartment, different reagents for RNA or protein extraction. In this study, a detailed methodology is provided to use the new 3D-printed insert as a co-culture system. To demonstrate several capacities of this flexible and simple model, previously published functional assays of cell communication were performed in the new 3D-printed inserts and were demonstrated to be reproducible. The 3D-printed inserts and the conventional cell culture using conditioned media led to similar results. In conclusion, the 3D-printed insert is a simple device that can be adapted to numerous models of co-cultures with adherent cell types.

In this paper, a newly designed 3D-printed insert is presented as a model of co-culture and validated through the study of the paracrine intercellular communication between endothelial cells and keratinocytes.

Un insert innovant imprimé en 3D conçu pour permettre des cultures cellulaires 2D et 3D simples

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...