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1. Préparation de plats ECM Culture enrobées ou Lamelles <ol><li> Préparer la solution mère en dissolvant ECM ECM substrat dans du PBS (Dulbecco saline tamponnée au phosphate, Invitrogen, 14040-133 #). Filtrer à l&#39;aide d&#39;une seringue 0,2 mm filtre (VWR, # 28145-495) et le gel en aliquotes à -80 ° C. </li><li> Diluer la solution mère ECM dans du PBS à la concentration souhaitée. Pour MaxGel, diluer dans du DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Invitrogen, 11995-065 #). </li><li> Si immunofluorescence sera effectuée, stériliser 12 lamelles de verre circulaires mm (VWR, # 89015-724) par trempage dans de l&#39;éthanol et laisser sécher à l&#39;air. Cela devrait être fait dans la hotte laminaire stérile. Si immunofluorescence ne sera pas effectuée passez à l&#39;étape 1.5. </li><li> Lieu stérilisés lamelles dans chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits (Corning, # 3526). </li><li> Ajouter 0,5 ml de solution diluée de substrat dans chaque puits de plaque à 24 puits et incuber à température ambiante pendant 3 heures. </li><li> Aspirer la solution ECM et laver three fois dans du PBS. </li><li> Aspirer PBS et l&#39;utiliser immédiatement ou enveloppés dans du parafilm et conservés à 4 ° C pendant 2 semaines. </li></ol> 2. Préparation des outils de dissection Sylgard plaques avec du charbon ajoutée sont préparés selon le protocole du fabricant. Le fond noir résistant de ces plaques fournit un support pour mettre le doigt sur l&#39;embryon et la couleur offre un bon contraste qui facilite la visualisation de l&#39;embryon translucide. <ol><li> Pour préparer les plaques pèsent directement dans un bécher de tri-versez-les sur une balance 150 Référence g Un liquide 15 g Partie B et 1 g de poudre de charbon (World Precision Instruments, # SYLG184). Mélanger à l&#39;aide d&#39;un bâton de popsicle en bois ou abaisse-langue. Verser dans un verre en plastique ou des boîtes de 100 cm. Utilisez une torche au butane petite tenue environ 10 à 12 centimètres au-dessus des plats pour brûler les bulles. Placer les couvercles sur les plaques et laisser reposer pendant au moins 24 heures à configurer. </li><li> Pour préparer les outils de dissection, insérez une goupille minuties (0,1 mm DIAMETREr) dans un porte-broche (outils fins scientifiques, # # 26002-10 et 26018-17, respectivement) aussi sur des aiguilles de calibre 26 (BD, # 309597) pliée à angle droit à l&#39;aide d&#39;une pince peut être utilisée comme instruments de dissection. Aiguisé étudiants Dumont # 5 Forceps (Outils Fine Science, # 91150-20) à l&#39;aide d&#39;une pierre à aiguiser (Beaux-outils scientifiques, # 29008-22). </li><li> Stériliser tous les outils de dissection avec de l&#39;éthanol à 70% avant l&#39;utilisation. </li></ol> 3. Collecte des embryons <ol><li> Euthanasier la souris chronométré enceinte à 8,5 coïtum jours après conformément à la réglementation des animaux usage des comités et enlever l&#39;utérus. </li><li> Utérus Placer dans un plat de Petri en plastique avec du PBS stérile. </li><li> Laver l&#39;utérus une fois avec du PBS stérile. </li><li> Sous un microscope à dissection retirez soigneusement embryon à partir deciduas en utilisant une paire de pinces. </li><li> Retirer les membranes extra-embryonnaires et d&#39;économiser pour le génotypage si nécessaire. </li><li> Embryon au stade en comptant somites. Les étapes idéales pour faire des explants d&#39;analyser cellulaire behAvior fois lors de l&#39;élévation de neurones serait entre les 6 et 10 somites stades lorsque les plis neuraux commencent tout juste à élever et avant la morphogenèse majeur du mésenchyme crânienne a lieu. </li><li> Laver embryon dans du PBS. Placer dans une plaque noire avec du DMEM Sylgard qui ne contient pas de rouge de phénol (Invitrogen, 21063-029 #). Retirer les membranes extra-embryonnaires et d&#39;économiser pour le génotypage si nécessaire. </li></ol> 4. Préparation des explants <ol><li> Recentrer le microscope au grossissement le plus haut possible sur la zone de tête de l&#39;embryon. </li><li> Faire des coupes avec une aiguille à dissection dans chaque main. Utilisez une aiguille pour maintenir le tissu en place et l&#39;autre pour faire des coupes. </li><li> Couper la tête de l&#39;embryon avant des rhombomères. </li><li> Couper le long de la ligne médiane de la tête coupent en deux moitiés égales. </li><li> Couper autour des confins de la tête et la ligne médiane. Ces réductions vont retirer la crête premigratory et de l&#39;ectoderme de surface à la frontière extérieure etla plaque préchordale sur la ligne médiane. Le reste du tissu sera l&#39;explant et contiendra la migration neuronale crête crânienne, mésoderme paraxial et de l&#39;ectoderme de surface. </li><li> Comme le tissu est coupé, retirer les débris disséqué de l&#39;antenne à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur stérile. Cela évite la confusion de l&#39;explant avec les débris disséqués. </li><li> Lavez délicatement l&#39;explant par pipetage de haut en bas avec une pointe de pipette 20 ul et pipetman. Cela permettra d&#39;éliminer les cellules faiblement attachées et prévenir les bords dentelés sur les explants. </li><li> Prenez soigneusement chaque explant dans environ 10 ul de liquide à l&#39;aide d&#39;une pipette 20 ul et pipetman et place au centre de la culture puits enduit. </li><li> Ajouter 20 ul de milieu de culture supplémenté avec 15% de FBS pour couvrir l&#39;explant. </li><li> Plaque lieu dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (5% de CO 2, 37 ° C) pendant 1-2 heures pour permettre l&#39;explant à fixer au fond de la boîte. Afficher périodiquement afin de s&#39;assurer que l&#39;explant ne sècheDépart. </li><li> Lorsque l&#39;explant a attaché, ajouter prudemment dans chaque puits 250 ul DMEM supplémenté avec 10% de FBS qui a été chauffé à 37 ° C dans un bain-marie. Une fois les explants ont attaché ils ne bougeront pas lorsque la plaque est agitée doucement sous le microscope. </li><li> Retour plat pour culture de tissu incubateur. </li><li> Après 24 h, les explants seront solidement attachées et les cellules commencent à émigrer. À ce moment agents pharmacologiques peut être ajouté au milieu. </li><li> 48 heures après l&#39;étalement, les cellules ont migré à partir des explants. La distance migré peuvent être visualisées et imagée. En général, nous arrêter la culture à ce point depuis explants commencent à montrer des signes de viabilité a diminué de plus longues incubations. Un colorant vital comme l&#39;acridine orange ou bleu trypan peuvent également être utilisés pour vérifier la viabilité de l&#39;explant. </li><li> À ce stade, les images peuvent être acquises à documenter la distance et le nombre de cellules qui migrent à partir de l&#39;explant. Alternativement, si explants ont été étalées sur des lamelles,ils peuvent être fixés et analyses immunohistochimiques réalisées pour visualiser les protéines d&#39;intérêt. </li></ol> Les étapes critiques dans le protocole <ol><li> Couper explants d&#39;environ la même taille. </li><li> Enlever tous les débris de la plaque de dissection disséquer comme vous dissection afin d&#39;éviter la confusion avec les débris du tissu désiré explantée. </li><li> Lorsque des explants de placage dans les puits ou sur des lamelles être sûr de placer des gouttelettes de médias avec explant dans le centre de bien. </li><li> Laissez suffisamment de temps pour explantation attacher avant d&#39;inonder le puits avec les médias. </li><li> Les conditions de traitement doivent être normalisées pour chaque substrat d&#39;essai et un agent pharmacologique utilisé. </li><li> Deux explants peuvent être fabriqués à partir de chaque embryon (un à gauche et un à droite du tube neural). </li><li> Lors du test de migration de cellules de lignées de souris mutantes dans différentes conditions expérimentales, mettre un explant mutant dans le groupe témoin et l&#39;autre dans le groupe traité. </li></ol> Dépannage <ol><li> Si explants ne parviennent pas à fixer, augmenter le temps alloué pour la fixation. Dans notre expérience, environ la moitié des explants de ne pas attacher et plus explants respecter plus efficacement. </li><li> Si explants joindre à la périphérie du puits, ils seront difficiles à l&#39;image. Veillez à placer dans des explants centre du puits. </li><li> Idéalement explants sera approximativement la même taille. Cependant, les différences dans la taille explant peut être corrigée à l&#39;aide d&#39;au diamètre des explants comme un facteur de correction lorsque quanitating migrations de cellules à partir d&#39;explants. </li><li> En cas de contamination être sûr stériles conditions de travail sont utilisés. Tous les outils et les surfaces de travail doivent être stérilisés avec de l&#39;éthanol à 70%. Pipettes et des boîtes de Petri doivent être nouveaux et stérile. </li><li> Si explants se perdent lors de la dissection, de supprimer régulièrement les débris pour éviter de perdre explant. </li><li> Maîtriser la dissection prend du temps et demande de la pratique. Optimal grossissement, outils de dissection tranchants et aiguilles d&#39;aide. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode appliquée ici permet un test puissant pour étudier le comportement des cellules mésenchymateuses crâniens. En plus des analyses statiques présentées ici, de vivre des expériences d&#39;imagerie en fond clair ou en combinaison avec l&#39;expression des protéines GFP-marqués peuvent être utilisées pour étudier le comportement des cellules en temps réel lors de leur migration à partir de l&#39;explant. Pour les expériences d&#39;imagerie en direct, des explants peuvent être étiquetés avec Dil ou de différencier la migration des crêtes neurales à partir du mésoderme paraxial, ROSA-YFP; Mesp1-cre ou ROSA-YFP; Wnt1-cre ou d&#39;autres lignées transgéniques pourraient être utilisés. Crâniens mésenchyme-ECM interactions peuvent aussi être examinées en utilisant ce test explant. Ici on explants de plaque sur des substrats ECM différents qui sont présents dans le mésenchyme crânienne de montrer que les cellules migrent sur les différents degrés et en ce que le ECM influe sur la morphologie des cellules. En outre, les explants sont noyées dans une matrice à trois dimensions pour ouvrir les comportements des cells dans ce contexte. Ce test explant est modifiable à l&#39;analyse de l&#39;effet des manipulations génétiques et pharmacologiques sur les comportements mésenchyme crâniens pour analyser des signaux intrinsèques et extrinsèques qui peuvent réguler et modifier la migration. Par exemple, nous avons utilisé ce test dans nos études de discerner le rôle de l&#39;excès de sécrétion de la protéine Hsp90 dans les comportements anormaux cellulaires dans Hectd1 mésenchyme crânienne mutant 15. Dans ces expériences, nous avons traité avec des explants de Hsp90 anticorps anti-Hsp90, protéines, geldanamycine et DMA (amelioride diméthyl) pour bloquer la sécrétion de la protéine Hsp90 de démontrer que le comportement anormal de cellules mutantes Hectd1 est due à l&#39;excès extracellulaire de Hsp90 15. Des approches similaires pourraient être utilisées pour pharmacologiquement disséquer les voies supplémentaires qui sous-tendent la morphogenèse normale ou anormale du mésenchyme crânienne. Une fois que le test est terminé, les explants et des cellules migratrices peuvent être analysés par une multitude de méthodes. Par exemple, c immunohistochimique des analysesun être utilisées pour examiner la localisation des protéines essentielles pour les mouvements cellulaires. Analyses du transcriptome pourrait également être utilisée pour déterminer la façon dont les traitements affectent l&#39;expression des gènes. Une limite importante de cette technique est que ce n&#39;est pas le comportement du modèle en trois dimensions comme ils se produisent in vivo. Modification du protocole où explants sont noyées dans une matrice tridimensionnelle (par exemple matrigel) ainsi que l&#39;expression de protéines fluorescentes marquées compartiments cellulaires pourraient être employées nécessaire d&#39;aborder cette question. Même si ces modifications ont été effectuées, d&#39;autres expériences de corréler les comportements observés dans cet essai ex vivo avec celles in vivo serait nécessaire. D&#39;autres limitations comprennent le nombre d&#39;embryons requis pour générer des nombres suffisants pour générer des données statistiquement significative. Plus important encore, la dissection est relativement simple, elle exige la pratique à maîtriser.

Fermeture du tube neural dans la région crânienne se produit entre embryonnaire jour 8,5 (E8.5) et de 9,5 chez l&#39;embryon de souris. Le défaut de bien fermer le tube neural dans les résultats de la tête dans l&#39;anencéphalie, une malformation congénitale structurelle commune chez l&#39;homme et est incompatible avec la vie. Les forces qui animent céphalique fermeture du tube neural sont générés à la fois du tissu nerveux lui-même et l&#39;épiderme environnant et le mésenchyme 3. En particulier, l&#39;expansion du mésenchyme crânienne est considérée comme essentielle pour l&#39;élévation de l&#39;1,2 crânienne plis de neurones. Le mésenchyme crânienne est riche en protéines de la MEC en particulier des protéines glycosylées comme protéoglycanes de sulfate de chondroïtine sulfates d&#39;héparine, et 4-8 hyaluronate. Contrairement à l&#39;embryon de poulet, où les cellules de la crête neurale émigrer dans le tube neural dorsal après la fermeture du tube neural, la crête neurale dans l&#39;embryon de souris migre en même temps que les plis de neurones commencent à rise (après le stade de 5 somites). Ainsi, pendant la neurulation chez l&#39;embryon de souris, le mésenchyme crânienne est composée de cellules dérivées de la crête neurale et le mésoderme paraxial. De la crête neurale et les populations mésoderme paraxial sont induits à différents moments dans le développement; localisés dans des positions différentes dans l&#39;embryon et se développer en différentes structures 9,10. Le mésoderme paraxial provient de la ligne primitive et migre vers la région antérieure de l&#39;embryon à la base de la plaque neurale présomptive. La crête neurale est induite au niveau de la jonction de la plaque neurale et l&#39;ectoderme épidermique, subit une transition épithélio mésenchyme et délamine juste avant l&#39;élévation de pliage neural chez l&#39;embryon rongeur. Les cellules de la crête neurale migrent le long des chemins stéréotypés dans le mésoderme paraxial subectodermal à l&#39;arc branchial, frontonasal et le mésenchyme péri-oculaire. Le mésoderme paraxial contribuera à certains des os de la voûte du crâne et des muscles du visage, tandis que ee de la crête neurale contribuera à d&#39;autres os du crâne et du visage, en plus de nerfs crâniens 9-11. Le mésoderme paraxial et les lignages de la crête neurale peut être différemment marqué par la Mesp1-cre et Wnt1-cre lignées de souris transgéniques, respectivement 9. Le rôle essentiel du mésenchyme crânienne en fermeture du tube neural a été déduite à partir d&#39;expériences où le traitement des embryons de rongeurs avec ECM agents de rupture telles que l&#39;hyaluronidase, chondroïtinase ABC, héparitinase ou diazo-oxo-norleucine (DON) au cours de la neurulation tube de fermeture atteinte neuronale 7, 12-14. Dans ces expériences, l&#39;analyse histologique de sections statiques après la neurulation révélé dysmorphogeneis associés au crânienne mésenchyme 7,12-14. Toutefois, étant donné que l&#39;agent tératogène eu accès à de multiples tissus, il reste à déterminer si le mésenchyme crânienne est vraiment le tissu cible. À l&#39;appui de la conclusion que ce tissuest essentielle pour la neurulation, le mésenchyme crânienne semble anormale sur des analyses histologiques dans certains mutants de souris avec une exencéphalie 15-17. Pourtant, dans la plupart des cas, l&#39;effet de la mutation sur le comportement cellulaire du mésenchyme crânienne n&#39;a pas été abordée. Nous avons mis au point un test ex vivo des explants d&#39;examiner directement la conséquence d&#39;une mutation génétique ou manipulation pharmacologique sur le comportement des cellules mésenchymateuses du crâne 15. Ce test est similaire à celle publiée par Tzahor et al 2003 pour accéder au potentiel de différenciation du mésenchyme crânienne qui sous-tend les 18 rhombomères sauf que nous avons modifié la dissection explant d&#39;étudier les propriétés migratoires des populations plus antérieures du mésenchyme crânienne qui sous-tendent l&#39;neurale antérieure plaque. Notre méthode est également une variante de tests effectués dans des explants l&#39;embryon de poulet pour analyser le comportement migratoire de la crête neurale avec kedifférences y. Préparations précédentes ont explanté la crête neurale ou le mésoderme paraxial plus postérieure 19,20. En outre, lors de l&#39;élévation fois neural chez l&#39;embryon de poulet, de la crête neurale n&#39;a pas encore émigré du tube neural dorsal et donc explants du mésoderme paraxial antérieure n&#39;aurait pas contenir des cellules de la crête neurale. Dans notre essai, des explants de mésenchyme crâniens constitués de mésoderme paraxial, de la crête neurale et l&#39;ectoderme de surface sont préparés et plaqué sur un substrat. La manipulation expérimentale y compris l&#39;isolement des explants de mutants génétiques, plaquant sur des explants ECM différent ou traitements pharmacologiques peuvent être effectuées. Les cellules migrent de l&#39;explant et la distance, le nombre et le comportement peuvent être analysés et comparés entre les groupes de traitement. En outre, cette préparation est modifiable à l&#39;analyse de la migration cellulaire par des techniques d&#39;imagerie en direct. Après l&#39;expérience des migrations, des explants peuvent être fixes et soumis à des analyses immunohistochimiques de la fourrurether élucider l&#39;effet des traitements. Dans l&#39;ensemble, le protocole présenté ici est un test ex vivo simples pour étudier le comportement du mésenchyme crânienne. Comme une expérience représentative, nous utilisons ce test d&#39;étudier la migration du mésenchyme crânienne sur différents substrats extracellulaires.

an explant assay for assessing cellular behavior of the cranial mesenchyme

Le système nerveux central est dérivé de la plaque neurale qui subit une série de mouvements morphogénétiques complexes résultant dans la formation du tube neural dans un processus connu sous le nom neurulation. Au cours de la neurulation, la morphogenèse du mésenchyme qui sous-tend la plaque neurale est censé conduire neurones élévation fois. Le mésenchyme crânienne est composée du mésoderme paraxial et les cellules de la crête neurale. Les cellules du mésenchyme sous la forme du crâne un maillage pourous composée de cellules étoilées en forme et le brassage de la matrice extracellulaire (ECM) brins qui soutiennent les plis neuraux. Au cours de la neurulation, le mésenchyme crânienne subit des réarrangements stéréotypes résultant de leur expansion et ces mouvements sont censés fournir une force motrice pour l&#39;élévation fois neural. Cependant, les voies et les comportements cellulaires qui sous-tendent la morphogenèse mésenchyme crânienne restent mal étudiées. Les interactions entre l&#39;ECM et les cellules des crâniens mésenchyme sous-tendent thescomportements cellulaires e. Nous décrivons ici un test ex vivo simples explant mis au point pour caractériser les comportements de ces cellules. Ce test est modifiable à des manipulations pharmacologiques pour disséquer les voies de signalisation impliquées et les analyses d&#39;imagerie en direct pour mieux caractériser le comportement de ces cellules. Nous présentons une expérience représentative démontrer l&#39;utilité de cet essai pour caractériser les propriétés migratoires du mésenchyme crânienne sur une variété de composants de la MEC.

L&#39;apparition de cellules qui migrent à partir d&#39;explants mésenchyme crâniens est montré dans la figure 2. Nous avons testé de migration sur des substrats ECM différents qui sont présents dans le mésenchyme crânienne pendant neurulation y compris la fibronectine (100 mg / ml, Sigma # F1141), la laminine (100 mg / ml, Sigma # L2020), MaxGel ECM (1:500 dilution dans du DMEM , Sigma # e0282) et l&#39;acide hyaluronique (1 mg / ml, Sigma, # 53747). Les cellules ne parviennent pas à migrer de l&#39;explantation si aucun ECM est présent (données non présentées) et tous les substrats testés charge la migration des cellules. À la fois la forme et les dimensions des cellules qui migrent à partir des explants dépend du substrat. Cela devrait que des études antérieures démontrent que les forces mécaniques générées par l&#39;interaction des cellules avec ECM différents affectent à la fois la forme et les propriétés migratoires des cellules 21. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig1.jpg" fo:content-width = &quot;5.5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4245/4245fig1highres.jpg&quot; /&gt; Figure 1. Préparation des explants. (A) Pour préparer les explants, E8.5 embryons sont disséqués à partir deciduas et les tissus extra-embryonnaires. (B) les chefs d&#39;embryons sont disséqués à partir de la partie antérieure du corps aux rhombomères. Explants sont préparés en éliminant les tissus à partir de la ligne médiane et les bords extérieurs de la tête pour retirer la plaque préchordale à la ligne médiane et de la crête neurale et l&#39;ectoderme premigratory surface à la frontière, respectivement. (C) Les explants sont préparés en coupant le tissu à partir de la ligne médiane et les bords extérieurs de la tête pour retirer la plaque préchordale à la ligne médiane et de la crête neurale et l&#39;ectoderme premigratory surface aux frontières. (D) Les explants sont placés dans un petit volume de médias sur des plats revêtus ECM / lamelles et a permis de fixer, avant l&#39;ajout de médias. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig2.jpg" /> Figure 2. Les explants de migration des cellules mésenchymateuses du crâne à partir d&#39;explants étalées sur des substrats différents. Ont été étalées sur la fibronectine, laminine, MaxGel ECM ou acide hyaluronique et photographiées après 48 heures de culture. Taille bar = 200 mm.

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An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Le mésenchyme crânienne subit des mouvements morphogénétiques dramatiques qui fournit sans doute une force motrice pour l&#39;élévation des plis neuraux<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Nous décrivons ici un simple<em&gt; Ex vivo</em&gt; Explantation d&#39;essai pour caractériser les comportements cellulaires du mésenchyme crânienne pendant la neurulation. Ce test a de nombreuses applications, y compris se prêter à des manipulations pharmacologiques et des analyses d&#39;imagerie en direct.

Un test pour évaluer le comportement des explants cellulaires du mésenchyme crânienne

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

an-explant-assay-for-assessing-cellular-behavior-cranial

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K vues.  Children's National Medical Center. Le mésenchyme crânienne subit des mouvements morphogénétiques dramatiques qui fournit sans doute une force motrice pour l'élévation des plis neuraux 1,2. Nous décrivons ici un simple Ex vivo Explantation d'essai pour caractériser les comportements cellulaires du mésenchyme crânienne pendant la neurulation. Ce test a de nombreuses applications, y compris se prêter à des manipulations pharmacologiques et des analyses d&#39...

Vidéo: An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositif microfluidique avec des modèles Groove pour étudier le comportement cellulaire

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Recherche

Biologie

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

Toxicité cellulaire des Nanogenomedicine dans la lignée cellulaire MCF-7: test MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical research. The hypoxic chamber offers a simple system to control oxygenation in standard culture vessels, but lacks precise temporal and spatial control over the oxygen concentration at the cell surface, preventing its application in studying a variety of physiological phenomena. Other systems have improved upon the hypoxic chamber, but require specialized knowledge and equipment for their operation, making them intimidating for the average researcher. A microfabricated insert for multiwell plates has been developed to more effectively control the temporal and spatial oxygen concentration to better model physiological phenomena found in vivo. The platform consists of a polydimethylsiloxane insert that nests into a standard multiwell plate and serves as a passive microfluidic gas network with a gas-permeable membrane aimed to modulate oxygen delivery to adherent cells. The device is simple to use and is connected to gas cylinders that provide the pressure to introduce the desired oxygen concentration into the platform. Fabrication involves a combination of standard SU-8 photolithography, replica molding, and defined PDMS spinning on a silicon wafer. The components of the device are bonded after surface treatment using a hand-held plasma system. Validation is accomplished with a planar fluorescent oxygen sensor. Equilibration time is on the order of minutes and a wide variety of oxygen profiles can be attained based on the device design, such as the cyclic profile achieved in this study, and even oxygen gradients to mimic those found in vivo. The device can be sterilized for cell culture using common methods without loss of function. The device's applicability to studying the in vitro wound healing response will be demonstrated.

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabrication and validation of an add-on platform that offers enhanced control over the spatial and temporal oxygenation in a 6-well plate. The device is adaptable to a number of culture systems and can be used to investigate the effects of oxygen on wound healing.

Fabrication et fonctionnement d&#39;un insert d&#39;oxygène pour les adhérents des cultures cellulaires

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Test clonogénique: cellules adhérentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Electroporation de Mesenchyme craniofaciale

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Un outil analytique qui quantifie les changements de morphologie cellulaire en trois dimensions des images de fluorescence

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Vivre Imaging test pour évaluer les rôles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Et Sphingomyélinase dans la réparation des pores formant blessures à toxines

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Mesurer les effets des bactéries sur<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportement aide d&#39;un test de rétention d&#39;oeufs

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

Exemple de Durotaxis à cellule unique pour évaluer le contrôle mécanique du mouvement cellulaire et les événements de signalisation connexes

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Évaluation de la capacité phagocytique spécifique à l’âge des hémocytes adultes de Drosophila melanogaster à l’aide d’un test de phagocytose in vivo

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...