Nous remercions le Centre de développement de l&#39;imagerie biologique (BIDC) de l&#39;Université de Californie à San Francisco pour l&#39;utilisation de la Imaris, Imaris XT et Matlab. Nous remercions V. Kharazia pour l&#39;assistance technique et AT Henry, LK Floren, L. Daitch pour leur contribution à la rédaction du manuscrit. Ce travail a été soutenu par un financement de l&#39;État de Californie recherche médicale sur l&#39;abus d&#39;alcool et les substances grâce à l&#39;UCSF à SEB, le National Institutes of Health: 1R21DA029966-01 et d&#39;attribution NIH Fast Track pour cribler la collection MLSMR à SEB école, UCSF de pharmacie ( Bureau du doyen et de pharmacie clinique) et l&#39;Ecole de Médecine (Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics expérimentales) pour CLHK.

1. Tridimensionnelle analyse morphométrique de la cellule unique modifications phénotypiques <ol><li> Embryonnaires humaines de rein (HEK293), les cellules ont été transfectées avec l&#39;hémagglutinine (HA)-étiqueté corticotropin libérant du récepteur du facteur-2 (CRF-R2), un G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) comme décrit précédemment 4, 5. </li><li> Les cellules ont été laissées sans traitement (pas de traitement, NT), stimulées avec le ligand endogène CRF-R2, facteur de libération de corticotropine, CRF (1 uM, 30 min), ou prétraité avec un sélectif CRF-R2 antagoniste, anti-sauvagine 30 (AS -30, 1 pM, 30 min) avant le traitement agoniste. </li><li> Les cellules ont ensuite été fixées, perméabilisées et traités avec des anti-HA. CRF-R2 a été visualisée en utilisant Alexa 594 nm conjugué anti-souris (IgG 1) anticorps. DAPI a été utilisé pour visualiser la scène mitotique noyaux. </li><li> Pour limiter la subjectivité expérimentateur, les conditions expérimentales n&#39;étaient pas connus jusqu&#39;à ce que les images ont été acquises et analysées. </li><li> Nous avons acquis l&#39;images de cellules HEK293 fixes à l&#39;aide d&#39;un plan-apochromatique 63x/1.4 huile DIC objectif et microscope Zeiss LSM 510 META confocal relié à un système intégré de laser cohérente à deux photons comprend un laser Verdi-V5 et un système de Mira laser 900-F. </li><li> Pendant le processus d&#39;acquisition de données, les cellules ont été compartimentées à la fois par sectionnement multispectrale, 488 nm et 790 nm (~ 350 nm Ex 2ph.) Et z-partitionnement (par incréments de 0,5 um) afin d&#39;inclure les données de la membrane nucléaire externe au récepteur extracellulaire extrémités. </li><li> Les données de fluorescence ont été traitées à l&#39;aide Imaris premier, ce qui permet la visualisation et la segmentation des données microscopie 3D, et un modèle 3D composé de voxels cubiques a été créée pour l&#39;analyse morphométrique. Puis, Imaris XT module a été utilisé pour l&#39;interface avec la langue Imaris MATLAB programme d&#39;ordinateur pour déterminer l&#39;emplacement des coordonnées des extensions GPCR. Afin de prendre en compte la variabilité cellulaire, nous avons obtenu et analysé par fluorescence images takfr à partir de 22 cellules: aucun traitement (NT) (n = 7), agoniste (CRF) traitement (n = 8) et de pré-traitement avec un antagoniste (AS-30) avant le traitement agoniste (n = 7) (figure 2) . <ol><li> La région d&#39;intérêt (ROI) doit comprendre une cellule qui n&#39;est pas en phase mitotique actif et ne ferme pas à d&#39;autres cellules. De cette manière, l&#39;analyse portera sur les cellules avec un seul noyau et les extensions récepteurs ne sont pas perturbé par la proximité d&#39;autres cellules. </li><li> La structure 3D cellulaire a été reconstruite à partir des données multispectrales de fluorescence à l&#39;aide Imaris (v.7.1.1). </li><li> À la suite de l&#39;algorithme personnalisé par Imaris, la première surface de rendu est utilisé pour représenter la membrane nucléaire. Imaris détermine s&#39;il ya plus d&#39;un noyau dans la région d&#39;intérêt. </li><li> Ensuite, l&#39;algorithme de création de points a été utilisée pour localiser l&#39;extension CRF-R2. La détection des taches a été utilisé, car il compense le bruit de fond et l&#39;intensité irrégulière de laréseau complexe de cellules en forme amorphe. </li><li> Pour maximiser l&#39;intégration de chaque unité de détection de la fluorescence de CRF-R2, le diamètre des taches a été fixé à 0,2 um, ce qui est la plus petite unité au sein de l&#39;image d&#39;extrapoler des informations distinctes sous la forme d&#39;une intensité mesurée en utilisant un filtre gaussien. Filtrage place a été incorporée dans le processus de création automatisée des taches. Le logiciel, cependant, donne à l&#39;utilisateur la possibilité d&#39;utiliser des filtres pour définir les paramètres. </li><li> Pour éviter la troncature des données, l&#39;ensemble de données a été converti en 8-bits (non signé) point fixe, à 32-bit virgule. </li><li> Les données de voxels intensités ont été échangés à repérer à l&#39;aide des données de coordonnées Imaris XT Module interfacé avec MATLAB et l&#39;emplacement exact de chaque point de l&#39;espace a été déterminée en effectuant une transformation de distance à l&#39;aide de la membrane nucléaire comme point de référence (figure 3). </li></ol></li><li> Les données résultantes peuvent être quantifiés et présentés sous forme de graphique pour sSTATISTIQUES analyse. Les comparaisons entre les groupes ont été effectuées à l&#39;aide de deux ANOVA et Bonferroni post-test. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. Les différences sont considérées comme significatives à * p &lt;0,05. Les calculs ont été réalisés avec GraphPad Prism 5,02 (figure 4). </li></ol> 2. Les résultats représentatifs Pour démontrer la puissance de notre approche, nous avons quantifié les modifications cellulaires qui résultent de l&#39;interaction de G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) et du facteur de libération de corticotropine récepteur-2 (CRF-R2) avec son ligand CRF endogène dans les cellules HEK293 transfectées. Nous montrons que le CRF-R2 récepteurs sont localisés dans la membrane plasmique et le projet de régions finies de la membrane des cellules (figure 2A et Movie 1). En utilisant l&#39;analyse 2D classique, il est possible de détecter ce sous-ensemble de extracellulaires des récepteurs CRF-R2 seulement si nous analysons l&#39;adhésion récepteur points sur la vitre couvre. Par conséquent, nous perdons toute autre information provenant de z empilés données multispectrales (figure 5). Lorsque les cellules sont traitées avec le CRF, les récepteurs extracellulaires sont considérablement réduits, comme indiqué par la diminution de la distance des points de la membrane plasmique. Ils sont également redistribués à partir d&#39;emplacements principalement finis en un certain nombre d&#39;endroits discrets (figure 2B et Movie 2). L&#39;effet du CRF sur la distribution récepteur membranaire est empêchée par un prétraitement avec l&#39;antagoniste du CRF-R2 spécifique, antisavagine 30 (AS-30) et nous constatons que les extensions CRF-R2 ne changent pas (figure 2C et Movie 3). La répartition des taches distale, tracées dans les 5 um spectre de couleurs intervalles codés, est utilisée pour visualiser la distance des voxels à partir de la membrane nucléaire. Aucun traitement et antagoniste pretreatment (AS-30, 1 uM, 30 min) avant le traitement agoniste (CRF, 1 uM, 30 min) montrent aucune différence significative (ns) différence de contraction GPCR. Le traitement des cellules avec l&#39;agoniste (CRF, 1 uM, 30 min) réduit progressivement le nombre de CRF-R2 contenant des voxels par rapport à l&#39;absence de traitement, 0-5 um (ns), 6-15 um (** p &lt; 0,01) et&gt; 15 um (*** p &lt;0,005), ou par rapport à AS-30 traitement, 0-10 um (ns), 11-15 um (** p &lt;0,01) et&gt; 15 um (*** p &lt;0,005) (figure 4). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma des techniques actuellement disponibles et leur limitation à analyser les images de fluorescence. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig2.jpg" /> <strong&gt; Figure 2. 3D multispectral images de fluorescence des cellules HEK293 transfectées avec HA-CRF-R2 avant et après le traitement agoniste et antagoniste. Images fusionnées montrant HA-CRF-R2-sondé utilisant des anticorps anti-HA et visualisées en utilisant Alexa 488 anticorps conjugué anti-souris (IgG 1) secondaire; DAPI a été utilisé pour visualiser les noyaux. Les images ont été acquises à balayage laser confocal (CLS) microscope. Barre d&#39;échelle 5 microns. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig3.jpg" /> Figure 3. Modèle 3D de cellules HEK293 transfectées avec HA-CRF-R2 reconstitué à partir des images en utilisant le logiciel CLS Imaris. Rendu de la surface du noyau et de la création taches décrivant des RCPG convertis en de petites vésicules. Les données de fluorescence ont été traitées à l&#39;aide Imaris première qui permet la visualisation et la segmentation de l&#39;ensemble de données 3D microscopie. Puis, Imaris XT a été utilisé pour Imaris d&#39;interface avec MATLAB. Les intensités de voxels ont été échangées contrecoordonne place. Les points du spectre codé en couleur (bleu, vert 0-5 um, 6-10 um, jaunes et rouges um 11-15&gt; 15 um) représentent la forme à distance de la membrane nucléaire. Échelle de 5 um. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig4.jpg" /> La figure 4. Représentation graphique de la distribution distale de points tracés dans le spectre de couleur codées dans des intervalles de 5 um est utilisée pour visualiser la distance des voxels à partir de la membrane nucléaire. Pas de traitement et de prétraitement avec un antagoniste (AS-30, 1 uM, 30 min) avant le traitement agoniste (CRF, 1 uM, 30 min) montrent aucune différence significative (ns) différence de contraction GPCR. Le traitement des cellules avec un agoniste (CRF, 1 uM, 30 min) réduit progressivement la distance du nombre de CRF-R2 contenant des voxels par rapport à l&#39;absence de traitement 0-5 um (ns), 6-15 um (** p &lt;0,01) et&gt; 15 um (*** p &lt;0,005), ou AS-30 de traitement 0-10 um (ns), 11-15<html> um (** p &lt;0,01) et&gt; 15 um (*** p &lt;0,005). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig5.jpg" /> Figure 5. Limitation de l&#39;analyse morphométrique 2D de cellules HEK 293 transfectées avec HA-CRF-R2. L&#39;article plan médian de cellules (3-4μm-dessus de la lamelle de verre) indiquant le centre des noyaux visualisées au DAPI et HA-CRF-R2 sondé avec anti-HA et visualisées à l&#39;aide Alexa 488 nm conjugué anti-souris (IgG 1) secondaire anticorps et acquis avec CLS montre pas de différence entre (A) aucun traitement (NT) et (B) agoniste (CRF, 1 uM, 30 min), tandis que les points d&#39;adhérence récepteurs sont radicalement différentes. Film 1. Tourner librement dans le modèle 3D &quot;Surpass&quot; Mode de cellules HEK 293 transfectées avec HA-CRF-R2, aucun traitement, pour évaluer les différences phénotypiques cellulaires entre les protéines réceptrices. La barre d&#39;échelle de 5 à 20 um./ Files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour voir le film. Movie 2. Tourner librement dans le modèle 3D &quot;Surpass&quot; Mode de cellules HEK 293 transfectées avec HA-CRF-R2, traitement par agoniste, CRF (CRF, 1 uM, 30 min) pour évaluer les différences phénotypiques cellulaires entre les protéines réceptrices. La barre d&#39;échelle de 5 à 20 um. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie2.avi" target="_blank">Cliquez ici pour voir le film.</a> Movie 3. Librement 3D en rotation dans le &quot;Surpass&quot; Mode de cellules HEK 293 transfectées avec HA-CRF-R2, un prétraitement avec un antagoniste (AS-30, 1 uM, 30 min) avant le traitement agoniste (CRF, 1 uM, 30 min ) pour évaluer les différences phénotypiques cellulaires entre les protéines réceptrices. La barre d&#39;échelle de 5 à 20 um. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie3.avi" target="_blank">Cliquez ici pour voir le film.</a>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons montré que le traitement CRF induit un changement important dans la morphologie et la localisation de CRF-R2. Le changement de CRF-R2 a été inhibée par le traitement antagoniste sélectif. Nous avons montré que des modifications des récepteurs n&#39;ont pas été détectés et ne peut pas être mesurée en utilisant les standards techniques 2D multispectrale. La possibilité d&#39;étudier des images 3D complexes est essentiel d&#39;intégrer la complexité des paramètres biologiques pour l&#39;analyse...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> De rein embryonnaire humain (HEK293) </td><td> American Type Culture Collection </td><td> CRL-1573 </td><td></td></tr><tr><td> Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965118 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum foetal bovin (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor-488 (IgG2b) </td><td> Invitrogen </td><td> A-11001 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps monoclonal anti-HA.11 (IgG 1) </td><td> Covance </td><td> 16B12 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1200 </td><td>; </td></tr><tr><td> CRF </td><td> Sigma </td><td> C2917 </td><td></td></tr><tr><td> Antisauvagine-30 (AS-30) </td><td> Sigma </td><td> A4727 </td><td></td></tr></tbody></table>

an analytical tool that quantifies cellular morphology changes from three-dimensional fluorescence images

Les outils les plus courants de logiciels d&#39;analyse disponibles pour mesurer images de fluorescence sont des données en deux dimensions (2D) qui s&#39;appuient sur des réglages manuels pour l&#39;inclusion et l&#39;exclusion des points de données, et la reconnaissance des formes assistée par ordinateur pour appuyer l&#39;interprétation et les conclusions de l&#39;analyse. Il est devenu de plus en plus important de pouvoir mesurer images de fluorescence construits à partir d&#39;ensembles de données tridimensionnelles (3D) afin d&#39;être en mesure de saisir la complexité de la dynamique cellulaire et comprendre les bases de la plasticité cellulaire dans les systèmes biologiques. Instruments de microscopie sophistiquées ont permis la visualisation des images 3D de fluorescence grâce à l&#39;acquisition d&#39;images multispectrales de fluorescence et puissant logiciel d&#39;analyse qui reconstitue les images des cheminées à foyer commun qui fournissent ensuite une représentation en 3D des images collectées en 2D. Méthodes avancées de conception basée sur stéréologie ont progressé de l&#39;approximation et hypothèses de l&#39;original à base de modèle stéréologie 1, même dans des coupes tissulaires complexes 2. En dépit de ces avancées scientifiques en microscopie, il reste un besoin pour une méthode automatisée d&#39;analyse qui exploite pleinement les données intrinsèques 3D pour permettre l&#39;analyse et la quantification des changements complexes de la morphologie cellulaire, la localisation des protéines et le trafic des récepteurs. Les techniques actuelles pour quantifier les images de fluorescence sont méta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) et Image J (NIH), qui fournissent une analyse manuelle. Imaris (Andor Technology, Belfast, Irlande du Nord) logiciel fournit la fonctionnalité, MeasurementPro qui permet la création manuelle de points de mesure qui peuvent être placés dans une image de volume ou tiré sur une série de coupes 2D pour créer un objet 3D. Cette méthode est utile pour des mesures ponctuelles seul clic pour mesurer une distance en ligne entre deux objets ou pour créer un polygone qui entoure une région d&#39;intérêt, mais il est difficile d&#39;appliquer à complex structures du réseau cellulaire. Tracer filament (Andor) permet la détection automatique de la 3D neuronale de type filament cependant, ce module a été développé pour mesurer les structures définies comme les neurones, qui sont constitués de dendrites, axones et des épines (structure arborescente). Ce module a été ingénieusement utilisé pour effectuer des mesures morphologiques de cellules non-neuronales 3, cependant, les données de sortie de fournir des informations d&#39;un réseau étendu cellulaire en utilisant un logiciel qui dépend d&#39;une forme de la cellule définie plutôt que d&#39;être un modèle en forme amorphe cellulaire. Pour surmonter le problème de l&#39;analyse de cellules en forme amorphe et de rendre le logiciel plus adapté à une application biologique, Imaris développé cellulaire Imaris. Il s&#39;agissait d&#39;un projet scientifique avec l&#39;Eidgenössische Technische Hochschule, qui a été développé pour calculer la relation entre les cellules et organites. Bien que le logiciel permet la détection des contraintes biologiques, en forçant un noyau par celluleet l&#39;utilisation de membranes cellulaires pour les cellules du segment, il ne peut pas être utilisé pour analyser les données de fluorescence qui ne sont pas continu, car, idéalement, il construit la surface des cellules sans les espaces vides. À notre connaissance, à l&#39;heure actuelle aucune approche modifiable par l&#39;utilisateur automatisé qui fournit des informations morphométriques à partir d&#39;images de fluorescence 3D a été développé qui permet d&#39;obtenir des informations spatiales cellulaire d&#39;une forme non définie (Figure 1). Nous avons développé une plate-forme d&#39;analyse en utilisant le module de base Imaris logiciels et Imaris XT interfacé à MATLAB (Mat Works, Inc.) Ces outils permettent la mesure 3D de cellules sans une forme prédéfinie et avec incohérentes composants du réseau de fluorescence. En outre, cette méthode permettra aux chercheurs qui ont étendu l&#39;expertise dans les systèmes biologiques, mais pas la connaissance des applications informatiques, d&#39;effectuer la quantification des changements morphologiques dans la dynamique cellulaire.

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An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Nous avons développé une plate-forme logicielle qui utilise Imaris Neuroscience, ImarisXT et MATLAB pour mesurer les changements dans la morphologie d&#39;une forme indéfinie pris trois dimensions fluorescence confocale de cellules individuelles. Cette nouvelle approche peut être utilisée pour quantifier les changements dans la forme des cellules qui suivent l&#39;activation du récepteur et représente donc un outil possible supplémentaire pour la découverte de médicaments.

Un outil analytique qui quantifie les changements de morphologie cellulaire en trois dimensions des images de fluorescence

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

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14.5K vues.  University of California, San Francisco. Nous avons développé une plate-forme logicielle qui utilise Imaris Neuroscience, ImarisXT et MATLAB pour mesurer les changements dans la morphologie d'une forme indéfinie pris trois dimensions fluorescence confocale de cellules individuelles. Cette nouvelle approche peut être utilisée pour quantifier les changements dans la forme des cellules qui suivent l'activation du récepteur et représente donc un outil possible supplémentaire pour la découverte de m?...

Vidéo: An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Chip à base de culture cellulaire tridimensionnelle dans perfusé micro-bioréacteurs

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Recherche

Biologie

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

La microfabrication de Chip entreprises Échafaudages pour la culture cellulaire en trois dimensions

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Assemblée, de chargement, et l&#39;alignement d&#39;une cellule échantillon ultracentrifugation analytique

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Changements dans la morphologie glande mammaire et le risque de cancer du sein chez les rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

Isolement des cellules épithéliales mammaires à partir de trois dimensions de cellules mixtes Sphéroïde Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Analyse rapide et exploration de microscopie par fluorescence Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging en hydrogels en trois dimensions

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear : Un tissu méthode de compensation pour l’imagerie en trois dimensions du tissu adipeux

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Approches quantitatives pour l'étude des structures cellulaires et de la morphologie d'organite à Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...