Ce protocole décrit une méthode de chimiluminescence optimisée à base de L-012 pour détecter la production de ROS en temps réel lors de l’obtention de PAMP dans les tissus de riz. Cette méthode est facile, standardisée et hautement reproductible dans des conditions fermement contrôlées. Cette procédure sera démontrée par On Ying, un doctorant de mon laboratoire.
Pour commencer, stérilisez les graines de riz décortiquées avec de l’éthanol à 70% pendant une minute, puis avec de l’hypochlorite de sodium à 40% pendant une heure. Rincez les graines cinq fois avec de l’eau stérile pour éliminer le chlore résiduel. Dans la méthode de la gaine de riz, plaquez directement les graines dans le récipient en verre stérile avec Murashige et Skoog ou MS milieu.
Pour plaquer les graines selon la méthode du disque foliaire, placez-les sur des plaques de SEP pendant cinq à sept jours, puis transplantez-les dans la matrice de croissance ou le sol. Cultivez les plants dans une salle de croissance avec une période de photo lumineuse de 12 heures et 12 heures sombre. Couper la gaine des plants de riz âgés de 10 jours en segments de trois millimètres avec une lame de rasoir tranchante ou une lame chirurgicale pour le prétraitement un jour avant le test ROS.
Placer cinq segments de gaine dans un puits individuel d’une plaque de microtitrage de 96 puits contenant 100 microlitres d’eau distillée double pendant 10 à 12 heures. Coupez les disques foliaires des plants de riz âgés de quatre à six semaines à l’aide d’un poinçon de biopsie avec un piston. Coupez toujours les disques foliaires du tiers médian de la deuxième feuille du motoculteur principal pour réduire la variation des données.
Ensuite, placez un disque de feuilles dans un puits individuel d’une plaque de microtitrage de 96 puits contenant 100 microlitres d’eau distillée double pendant 10 à 12 heures pour le prétraitement. Gardez tous les disques de feuilles flottants et orientés vers le haut dans les puits d’une plaque de microtitrage pour le prétraitement de l’eau afin d’éviter toute variation associée au côté feuille. Préparer la solution d’élicitation en combinant 9,4 millilitres de 50 micromolaires Tris Hcl, 400 microlitres de solution L012, 100 microlitres de peroxydase de raifort et 100 microlitres de Flg22.
Ajouter 200 microlitres de solution de déclenchement dans les puits. Démarrez le logiciel et cliquez sur le bouton expérimentations pour créer un nouveau protocole ou utiliser un protocole existant. Cliquez sur procédure dans la fenêtre contextuelle pour configurer la plaque et sélectionner les puits de la plaque à surveiller.
Cliquez sur Démarrer la cinétique et définissez le temps d’exécution sur 30 minutes ou plus, selon les exigences expérimentales. Sélectionnez l’intervalle minimum pour obtenir les lectures aussi souvent que possible. Et pour le temps d’intégration, choisissez une seconde ou plus en fonction de l’intensité du signal.
Cliquez sur valider, suivi de OK pour confirmer les paramètres, puis cliquez sur détecter la nouvelle plaque dans la fenêtre contextuelle et attendez que le logiciel invite la boîte de dialogue de la plaque de charge. Retirez soigneusement l’eau bidistillée des puits contenant les tissus prétraités, en évitant tout dommage tissulaire ou dessiccation. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 200 microlitres de la solution de déclenchement aux puits contenant les tissus.
Placez la plaque à tester sur le support et commencez la détection. Pour induire les ROS par Flg22, des disques foliaires et des gaines de trois millimètres de long ont été utilisés. La génération ROS est surveillée pendant 35 minutes.
Les barres indiquent les moyennes des écarts-types calculés à partir de cinq répétitions techniques. Dans le riz, l’augmentation de la production de ROS a été détectée pour la première fois en une à deux minutes, a culminé à 10 à 12 minutes et est revenue à la valeur de référence en environ 30 à 35 minutes. Le montant total des MDE a été calculé à partir de la courbe.
Pour obtenir le montant total des valeurs ROS, appliquez la formule aux ensembles de données correspondants pour calculer le ROS généré à chaque intervalle de temps, qui peut être combiné en appliquant la somme de la formule pour calculer le montant total généré. Un seul trou ou deux moitiés d’un disque de feuilles ont été placés dans les puits d’une plaque de microtitrage de 96 puits prétraitée avec 100 microlitres d’eau distillée double pendant 10 à 12 heures, puis traitée avec Flg22 pour l’induction ROS. Les valeurs de lecture des échantillons des deux demi-disques sont beaucoup plus élevées que celles des échantillons de feuilles entières.
En moyenne, les valeurs totales des deux demi-disques sont presque 1,6 fois supérieures à celles de l’ensemble du disque feuille, ce qui est proportionnel à la longueur du bord et non à la surface des échantillons. Ce résultat confirme que les ROS sont principalement générées dans les cellules du site de la plaie. Lorsque vous essayez avec cette procédure, opérez avec des mouchoirs doucement et ne faites pas de découpes supplémentaires qui pourraient être une source de variation de données.
Cette méthode peut être appliquée à tout autre processus physiologique produisant des ROS dans les tissus végétaux.
