Nous tenons à remercier les personnes suivantes sans l&#39;aide desquels la collecte de tissus de pin n&#39;aurait pas été possible: le Dr Joe Nairn, Matt Bryman, Michael Bordeaux, Ujwal Bagal, Huizhe Jin, et Amanda Bouffier.

Partie 1: Récolte d&#39;arbres Après que l&#39;arbre est sélectionné et abattu, il est important de travailler avec autant de soin et aussi rapidement que possible. Comme chaque type de tissu différent est récolté, ils doivent être placés immédiatement dans leurs propres vaisseaux azote liquide pour éviter toute contamination croisée du matériel d&#39;échantillonnage. Ce protocole d&#39;isolement d&#39;ARN est évolutive. <ol><li> Couper les boulons en longueurs d&#39;environ 0,5 à 0,75 m et avec un score de tronçonneuse de l&#39;écorce de deux ou trois places suivant l&#39;axe longitudinal du boulon. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un ciseau à bois, le travail du bord de la région a marqué jusqu&#39;à l&#39;écorce commence à se séparer du bois et de continuer à travailler au ciseau tout en tirant sur la section de l&#39;écorce jusqu&#39;à ce qu&#39;elle se sépare complètement de la tige. </li><li> Xylème secondaire est récolté avec un bord, droit de rasoir simple face en grattant le long de l&#39;axe longitudinal de la culasse qui a été débarrassé de son écorce. Porter des gants en latex pour minimiser la contamination des tissus. </li><li> Phloème, qui est situé sur le côté intérieur des sections écorce, est facilement récoltés par pelage manuel. </li><li> Bois de réaction sont collectées à partir du dessous de membres après leur marquage avec la peinture en aérosol pour indiquer leur orientation d&#39;origine par rapport au sol. </li><li> Les membres sont coupés en des boulons de 1-2 m et a marqué sur les côtés opposés sur l&#39;axe longitudinal selon les emplacements approximatifs des deux types de bois de réaction: le bois en face (sur le côté haut de la jambe) et le bois de compression (sur le fond côté de la jambe). L&#39;écorce est séparée de la branche comme décrit ci-dessus, sauf que seule l&#39;écorce qui couvre chaque type de bois de réaction est enlevée en même temps. Xylème secondaire ou phloème est alors recueilli comme décrit ci-dessus et placés dans l&#39;azote liquide. </li><li> D&#39;autres échantillons, comme des aiguilles, des pousses et des cônes de jeunes, peuvent être récoltées à la main ou en utilisant un sécateur, au besoin. </li><li> Échantillons prélevés congelés dans l&#39;azote liquide doivent être placés dans des sacs marqués ou des conteneurs appropriés et emballés dans de la glace sèche pour le transfert vers le laboratoire. </li></ol> Partie 2: Traitement des échantillons Mill Congélateur <ol><li> Remplir le réservoir de moulin à Spex 6850 congélateur avec l&#39;azote liquide et placer la barre d&#39;impact dans l&#39;un des flacons de rectification et de remplir avec de l&#39;azote liquide à pré-refroidir. Décanter l&#39;azote liquide et ajouter de l&#39;échantillon au flacon. </li><li> Assurez-vous qu&#39;aucun excès d&#39;azote liquide dans la chambre de broyage et de gaz excès d&#39;azote est complètement purgée avant que le bouchon est assis pour sceller la chambre. </li><li> Insérer le tube dans le support de meulage et de fermer. </li><li> Échantillons boisée Mill pour deux cycles de 1 minute / cycle à une fixation des taux de 14. </li><li> Utilisez une spatule azote liquide réfrigéré à retirer l&#39;échantillon broyé (farine de bois) dans un bécher qui a été pré-réfrigérés et contient une petite quantité d&#39;azote liquide. </li><li> Verser le liquide d&#39;azote / échantillon bouillie dans un récipient de stockage et le lieu à -80 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol> Partie 3: RNA, Jour 1 <ol><li> Placer 20 ml de tampon d&#39;isolement d&#39;ARN dans un tube Falcon de 50 ml et ajouter plafonné 400 ul β-mercaptoéthanol, vortex brièvement, puis la chaleur dans un bain d&#39;eau à 60 ° C. </li><li> Ajouter 4 g de tissus congelés dans chaque tube. Cap et agiter vigoureusement à la main suivie par vortex pendant 10 secondes. </li><li> Ajouter un volume égal de chloroforme sur le tube et inverser doucement pour mélanger. Placer le tube sur une roue tournante et permettre bout en bout au cours de mélange pendant 5 minutes. </li><li> Décanter le mélange dans un tube de 50 ml d&#39;Oak Ridge et centrifuger à 12 000 (17 200 xg) tpm dans un SS34 rotor angulaire pendant 5 minutes. </li><li> Transférer la phase aqueuse dans un tube à Oak Ridge fraîche et ajouter un demi-volume de chloroforme. </li><li> Vortex pendant 1 minute et continuer à mélanger sur une roue en rotation pendant 5 minutes. Centrifuger à 12000 rpm (17 200 xg) dans un rotor SS34 angle fixe pendant 5 minutes. </li><li> Transférer la phase aqueuse au tube Ridge frais de chêne et d&#39;ajouter un demi-volume de chloroforme. Vortex pendant 1 minute. Centrifuger à 12000 rpm (17 200 xg) dans un rotor SS34 angle fixe pendant 10 minutes. </li><li> Transférer la phase aqueuse à une vitesse de 50 ml tube en polypropylène haute. Centrifuger à 10000 rpm (11 900 xg) dans un rotor SS34 angle fixe pendant 20 minutes. </li><li> Décanter le surnageant dans 50 mL Falcon tube et ajouter un quart de volume de 10 M LiCl solution surnageante. Brièvement au vortex et placer à 4 ° C pour les précipitations durant la nuit. </li></ol> Partie 4: RNA, Jour 2 <ol><li> Buffer SSTE Chauffer au bain à 65 ° C l&#39;eau avant de commencer. </li><li> Verser l&#39;échantillon LiCl-précipité dans un tube en polypropylène et un culot d&#39;ARN par centrifugation à 11000 rpm dans un rotor SS34 angle fixe (14 450 xg) pendant 30 minutes à 4 ° C. </li><li> Après centrifugation,égoutter et jeter le liquide, et inverser les tubes sur Kimwipes pendant environ 1 minute. Pipeter hors tout surnageant restant. </li><li> Resuspendre chaque pastille dans 800 ul de SSTE chauffée à l&#39;aide d&#39;une pipette pour bien mélanger les échantillons. Transférer l&#39;échantillon remis en suspension à 2 mL tubes Ambion microcentrifugeuse RNAse free. </li><li> Échantillons de chaleur à 65 ° C pendant 2 minutes, suivi par vortex vigoureuses pour assurer la remise en suspension complète. </li><li> Ajouter un volume égal de phénol-chloroforme, pH8, dans chaque tube échantillon. Vortex chaque échantillon pendant 30 secondes puis de spin dans une microcentrifugeuse à 14 000 rpm pendant 3 minutes </li><li> Transférer la phase aqueuse à un nouveaux tubes de 2mL Ambion microcentrifugeuse RNAse free, et ajouter un volume égal de chloroforme. Vortex chaque échantillon pendant 30 secondes et de spin dans la microcentrifugeuse à 14 000 rpm pendant 3 minutes. </li><li> Transfert phase aqueuse pour des tubes de gel de verrouillage de phase qui ont été préalablement préparé par microfuging à 11.000 tours par minute pendant 2 minutes. Ajouter un demi-volume de chloroforme et doucement la pipette pour mélanger. </li><li> Centrifuger à 11000 rpm pendant 5 minutes et le transfert de la phase aqueuse pour frais 2mL tubes Ambion microcentrifugeuse RNAse free. </li></ol> Partie 5: ARN précipitation et lavage à l&#39;éthanol <ol><li> Ajouter 50 uL d&#39;acétate de sodium 3,0 M, pH 4,8, et 1 ml d&#39;éthanol à 100% à la phase aqueuse. Vortex et précipité dans -80 ° C pendant 30 minutes ou toute la nuit à -20 ° C. </li><li> Échantillons microcentrifugeuse à 14000 rpm pendant 30 minutes à 4 ° C, et aspirer délicatement le surnageant. Ne pas perturber le culot. </li><li> Laver les culots d&#39;ARN avec 1 ml à -20 ° C à 70% (v / v) d&#39;éthanol. Microcentrifugeuse à 14000 rpm pendant 1 minute et aspirer de l&#39;éthanol. </li><li> Répétez l&#39;étape 5.3. </li><li> Débouchez les tubes et les sécher à l&#39;air boulettes sur le banc pendant 3-5 minutes. </li></ol> Partie 6: remise en suspension définitive et quantification <ol><li> Resuspendre chaque pastille dans 100 ul DEPC eau traitée. Mélanger au vortex et incuber les tubes à 65 ° C pendant 2 minutes avant de placer sur la glace. Répétez si nécessaire pour assurer la remise en suspension de l&#39;échantillon. </li><li> Piscine comme des échantillons si désiré et faire 50 uL d&#39;une dilution 1:10 dans 10 mM Tris, pH 7,5, pour la quantification par spectrophotométrie. Ratios d&#39;absorbance pour 260/280 et 260/230 sont généralement supérieures à 2,1 et 2,2, respectivement. Isolement d&#39;ARN rendements varient de 60-120μg / g de tissu congelé. </li><li> Analyser les échantillons en exécutant 1.5 à 2.5 ug d&#39;ARN sur un gel d&#39;agarose 1% en tampon TAE. Pour des échantillons plus critique, d&#39;analyser l&#39;ARN en utilisant une bioanalyseur Agilent 2100 selon les instructions du fabricant. </li></ol> Les résultats représentatifs: Rendements d&#39;isolement d&#39;ARN à partir de conifères tissus gamme différente de 60 à 120 g / g de tissu congelé des échantillons boisée typique rendement autour de 70-80g / g de tissu congelé. Diagnostic des ratios 260/280 et 260/230 sont à la fois typiquement supérieur à 2,1, et sont de bons indicateurs que l&#39;échantillon d&#39;ARN est libre de toute contamination importante ou phénoliques glucides, respectivement. Les échantillons analysés par électrophorèse sur gel agarose suivie d&#39;une coloration EtBr doit montrer trois bandes distinctes pour les 25S, 18S et 5S ARN (figure 1). Détermination de la stoechiométrie de la 28S à 18S sur gels d&#39;agarose est quelque peu subjective, et des facteurs tels que la course des conditions pour le gel, la coloration, et de charger tous les échantillons peuvent avoir un effet. En général, la 28S: 18S rapport apparaîtra à&gt; 1,5. Cependant, certains échantillons de conifères ont des ratios plus faibles. Par exemple, après 2100 d&#39;Agilent analyse, nous avons vu plusieurs cas d&#39;échantillons de conifère de différents types de tissus où la stoechiométrie est plus proche de 1,2:1. Ainsi, une apparente 28S faible: 18S stoechiométrie par électrophorèse sur gel n&#39;indique pas nécessairement un échantillon de mauvaise qualité. Leaf, tirer, et des échantillons de cône sera souvent d&#39;autres bandes distinctes présentes en raison de chloroplastiques ARN ribosomal. EtBr tachés de matériaux qui ne migrent pas à partir de l&#39;échantillon bien ou haute des bandes de masse moléculaire (&gt; 8-10 ko) indiquent généralement la contamination d&#39;ADN génomique (figure 2). Faible frottis masse moléculaire dans le voisinage ou au-dessous la bande 5S et réduit la bande coloration ribosomal 18S ou une apparente&gt; 28S stoechiométrie est un bon indicateur que la dégradation des ARN s&#39;est produite (figure 3). Dans l&#39;analyse Agilent électrophérogramme 2100, la ligne de base doit être faible et relativement lisse avec des pics importants correspondant aux ARN 18S et 28S ribosomal 28S avoir: ratios 18S allant partout de 1,2 à 2,0. Le numéro d&#39;Agilent intégrité de l&#39;ARN (RIN) de valeur peut être un meilleur prédicteur de la qualité de l&#39;ARN et devrait être d&#39;au moins 7 ou plus pour les ARN qui doit être utilisé pour la préparation des cibles de biopuces. La figure 4 montre un typique Agilent 2100 électrophérogramme pour l&#39;ARN 28S du xylème avec un: rapport 18S égal à 1,4 et une valeur du RIN de 8,6 tandis que la figure 5 montre un xylème mauvaise préparation de l&#39;ARN ayant une base de référence très élevée et la dégradation notable révélée par le 28S: 18S raégal à 0,65 et une valeur du RIN de 3,4 TiO. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Analyse sur gel d&#39;agarose de l&#39;ARN de pin de haute qualité. Voie 1, l&#39;ONE 1 kb standard, Lane 2 montre un typique isolement total d&#39;ARN à partir du xylème secondaire, pin blanc avec une caractéristique ribosomal 28S, 18S et 5S bandes et apparente 28S: 18S Ratio&gt; 1. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Analyse sur gel d&#39;agarose des pins échantillon d&#39;ARN contaminés avec de l&#39;ADN génomique. Voie 1, l&#39;ONE 1 kb standard, la voie 2, le xylème échantillon d&#39;ARN montrant la contamination d&#39;ADN génomique. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Analyses gel d&#39;agarose des échantillons de pin montrant la dégradation de l&#39;ARN et la contamination par l&#39;ADN génomique. Voie 1, l&#39;ONE 1 kb standard, Lane2, xylème échantillon d&#39;ARN montrant la contamination d&#39;ADN génomique et une grave dégradation de l&#39;ARN. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Agilent 2100 électrophérogramme de l&#39;ARN total isolé à l&#39;aide du xylème de la méthode décrite sur le xylème de pin à encens. 28S: 18S taux est égal à 1,4, la valeur est égale à 8,6 RIN <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Agilent 2100 électrophérogramme d&#39;ARN pointe apicale totale montrant sévère dégradation et la contamination génomique. 28S: 18S taux est égal à 0,65, la valeur du RIN représente 3,4

<ol>
	<li>Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+extracting+RNA+from+pine+trees.">A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).</li><li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Sim&#369;es, M., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+the+Loblolly+Pine+PtGen2+cDNA+Microarray.">Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray.</a> Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).</li></ol>

Obtention de haute qualité d&#39;ARN à partir des espèces de conifères peut être une tâche difficile étant donné les niveaux élevés de composés phénoliques et des polysaccharides présents dans les tissus ligneux. En commençant par le protocole développé par Chang et al. (1), nous avons constaté que l&#39;extraction de plus de rigueur et de nettoyer marches mènent à l&#39;isolement cohérente de très haute qualité d&#39;ARN total de Woody diverses et non ligneuses des tissus prélevés sur une grande...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RNA Isolation Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>C298-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15509-037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10M LiCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>SSTE Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>Phenol-chloroform (pH8.0)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Oak Ridge High Speed Teflon Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-16B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polypropylene 50mL High Speed Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-10K</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>#21008-939</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Heavy, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#2302830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion, Inc.</td>
<td>#AM12425</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an improved method of rna isolation from loblolly pine (p. taeda l.) and other conifer species

Tissus isolés à partir d&#39;espèces de conifères, en particulier celles appartenant à la famille des Pinacées, comme le pin taeda (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), contiennent des concentrations élevées de composés phénoliques et des polysaccharides qui interfèrent avec la purification d&#39;ARN. Isolation de haute qualité de l&#39;ARN à partir de ces espèces nécessite des procédures rigoureuses de collecte de tissus dans le domaine et l&#39;emploi d&#39;un protocole d&#39;isolement d&#39;ARN composée de plusieurs étapes d&#39;extraction organique afin d&#39;isoler l&#39;ARN de qualité suffisante pour biopuces et d&#39;autres analyses génomiques. L&#39;isolement de la haute qualité d&#39;ARN à partir d&#39;échantillons prélevés sur le terrain pin blanc peut être difficile, mais plusieurs modifications des tissus et des procédures standard d&#39;isolement d&#39;ARN grandement améliorer les résultats. L&#39;étendue de la dégradation de l&#39;ARN en général augmente si les échantillons ne sont pas correctement collectés et transportés sur le terrain, notamment lors des récoltes de grande envergure. Total des rendements d&#39;ARN peut être augmenté de manière significative par des échantillons de pulvérisation dans un moulin congélateur à azote liquide avant d&#39;isolement de l&#39;ARN, en particulier lorsque les échantillons proviennent de tissus ligneux. Cela est principalement dû à la présence d&#39;agents oxydants, tels que les composés phénoliques et des polysaccharides qui sont tous deux présents à des niveaux élevés dans les extraits des tissus ligneux des espèces les plus conifères. S&#39;il n&#39;est pas retiré, ces contaminants peuvent mener au cours conduisant à des problèmes tels que la dégradation de l&#39;ARN, qui se traduisent par de faibles rendements et une mauvaise qualité de l&#39;échantillon d&#39;ARN. Report des composés phénoliques, ainsi que des polysaccharides, peuvent également réduire ou même éliminer complètement l&#39;activité de la transcriptase inverse ou les autres polymérases couramment utilisé pour la synthèse de l&#39;ADNc. En particulier, l&#39;ARN destiné à être utilisé comme modèle pour double-brin de synthèse d&#39;ADNc dans la génération de banques d&#39;ADNc simple brin synthèse de l&#39;ADNc pour la PCR ou PCR quantitative, ou pour la synthèse de matériaux cibles biopuces doivent être de la meilleure qualité si les chercheurs s&#39;attendent à d&#39;obtenir des résultats optimaux. Techniques d&#39;isolement d&#39;ARN couramment employée pour de nombreuses autres espèces végétales sont souvent insuffisants dans leur capacité à éliminer ces contaminants à partir d&#39;échantillons de conifères et n&#39;ont donc pas le rendement total d&#39;échantillons d&#39;ARN adapté à des manipulations en aval. Dans cette vidéo, nous démontrent les méthodes de collecte domaine des tissus de conifères, en commençant par l&#39;abattage d&#39;une quarantaine d&#39;année vieil arbre, à la récolte de phloème, xylème secondaire, et le xylème bois de réaction. Nous démontrons également un protocole d&#39;isolement d&#39;ARN qui a constamment donné de haute qualité pour les ARN ultérieures manipulations enzymatique.

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species at JoVE.com

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Beaucoup de tissus végétaux, y compris le phloème et le xylème de pin à encens (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), contiennent des niveaux élevés de composés phénoliques et des polysaccharides qui interfèrent avec la purification d&#39;ARN. Cette présentation aborde les techniques pour la récolte du champ cultivé des tissus et l&#39;isolement de l&#39;ARN d&#39;une qualité suffisante pour les microarrays et les analyses génomiques d&#39;autres.

Une méthode améliorée d&#39;isolement d&#39;ARN à partir de pin taeda ( P. taeda L.) et d&#39;autres conifères

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

an-improved-method-rna-isolation-from-loblolly-pine-p-taeda-l-other

Research

JoVE Journal

Biology

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

13.7K vues.  University of Georgia (UGA). Beaucoup de tissus végétaux, y compris le phloème et le xylème de pin à encens ( Pinus taeda L.), contiennent des niveaux élevés de composés phénoliques et des polysaccharides qui interfèrent avec la purification d'ARN. Cette présentation aborde les techniques pour la récolte du champ cultivé des tissus et l'isolement de l'ARN d'une qualité suffisante pour les microarrays et les analyses génomiques d'autres.

Vidéo: An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

Traitement du pin taeda PtGen2 cDNA microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Recherche

Biologie

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Isolement d&#39;ARN à partir de synthèse d&#39;ADNc embryonnaires Zebrafish et pour analyser l&#39;expression génique

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profilage de la méthyltransférase et autres S-Adénosyl- L-Homocystéine protéines liant par spectrométrie de masse de captation composé (CDSM)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolement et purification de la kinésine de Drosophila Embryons

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ease of growth and small size. This small size, though, has disallowed a number of technical approaches found in other model systems. For example, blood transfusions in mammalian systems and grafting techniques in plants enable asking questions of circulatory system composition and signaling. The circulatory system of the worm, the pseudocoelom, has until recently been impossible to assay directly. To answer questions of intercellular signaling and circulatory system composition C. elegans researchers have traditionally turned to genetic analysis, cell/tissue specific rescue, and mosaic analysis. These techniques provide a means to infer what is happening between cells, but are not universally applicable in identification and characterization of extracellular molecules. Here we present a newly developed technique to directly assay the pseudocoelomic fluid of C. elegans. The technique begins with either genetic or physical manipulation to increase the volume of extracellular fluid. Afterward the animals are subjected to a vampiric reverse microinjection technique using a microinjection rig that allows fine balance pressure control. After isolation of extracellular fluid, the collected fluid can be assayed by transfer into other animals or by molecular means. To demonstrate the effectiveness of this technique we present a detailed approach to assay a specific example of extracellular signaling molecules, long dsRNA during a systemic RNAi response. Although characterization of systemic RNAi is a proof of principle example, we see this technique as being adaptable to answer a variety of questions of circulatory system composition and signaling.

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The model organism C. elegans uses pseudocoelomic fluid as a passive circulatory system. Direct assay of this fluid has not been previously possible. Here we present a novel technique to directly assay the extracellular space, and use systemic silencing signals during an RNAi response as a proof of principle example.

Isolation vampirique de fluide extracellulaire d&#39;<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Une méthode améliorée pour la mesure précise et rapide des performances de vol en<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Isolement de l&#39;ARN de souris Pancréas: un tissu de Ribonuclease riche

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Une méthode Sectionnement améliorée pour les échantillons de tissus végétaux récalcitrantes

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Stomates Tape-Peel : Une méthode améliorée pour la préparation d’échantillons de cellules de garde

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

Un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...