L&#39;étiquetage, l&#39;hybridation et protocoles de lavage ici contiennent des modifications à celles développées antérieurement par le Dr J. Quackenbush tout à l&#39;Institute for Genomic Research (TIGR), le Dr Shawn Levy à la ressource partagée Microarray Vanderbilt (VMSR), et le Dr Rob Alba alors à l&#39;Institut Boyce Thompson, (RTC) Université Cornell.

(Remarque Sections 1 - 4 Non démontrée dans la vidéo) Préparation Cy-Étiqueté cible d&#39;ADNc Ce qui suit est le protocole que nous utilisons pour la synthèse d&#39;ADNc à partir d&#39;ARN total de pins taeda et indirects étiquetage ADNc avant biopuces hybridations. Bien que quelques non-triviales modifications ont été apportées, le protocole ci-dessous est similaire à celle dans le manuel d&#39;instructions fourni avec le kit Invitrogen SuperScript marquage indirect d&#39;ADNc. Partie 1: premier brin réaction de synthèse d&#39;ADNc <ol><li> Mélanger et Centrifuger brièvement chaque composante kit avant utilisation. </li><li> Préparer des réactions comme suit: <ul><li> Xμl DEPC-H 2 O </li><li> Xμl ARN total, 20 ug / réaction (prétraitées avec de la DNase Turbo Ambion a) </li><li> Ancré 2μl Oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl) </li><li> 1 microlitre Primer hexamères aléatoires </li><li style="list-style:none;"> Volume total = 18μl </li></ul></li><li> Incuber les tubes à 70 ° C pendant 5 minutes, puis placer sur la glace pendant 1-2 minutes. </li><li> Ajoutez le code suivant à chaque tube de réaction sur la glace: <ul><li> 6μl 5X premier brin de tampon </li><li> 1.5μl DTT 0,1 M </li><li> 1.5μl mélange dNTP 10 mM </li><li> 1 microlitre RNaseOUT (40U/μl) </li><li> 2μl SuperScript III RT (400U/μl) </li></ul></li><li> Mélanger doucement et centrifuger brièvement. Incuber le tube pendant la nuit à 45 ° C. </li><li> Ajouter 15μl de NaOH 1M dans chaque tube de réaction et bien mélanger. </li><li> Incuber le tube à 70 ° C pendant 10 minutes. </li><li> Ajouter 15μl d&#39;HCl 1M, mélanger délicatement. </li><li> Ajouter l&#39;acétate de sodium 3M 20 pi (pH 5,2), mélanger délicatement. </li></ol> Partie 2: Purifiant premier brin d&#39;ADNc. <ol><li> Ajouter 500μl de tampon de chargement à l&#39;ADNc (de l&#39;étape 1.9) et bien mélanger. </li><li> Placer une colonne de purification SNAP (fourni avec le kit de marquage indirect) sur un tube de collecte et de charger votre ADNc sur la colonne. </li><li> Centrifuger à 14000 g à température ambiante pendant 1 minute; jeter le accréditives. </li><li> Placer la colonne sur le tube de SNAP même collection et ajouter 500μl de tampon de lavage. </li><li> Centrifuger à 14000 g à température ambiante pendant 1 minute; jeter le accréditives. </li><li> Répétez les étapes 2.4 et 2.5 à trois reprises, pour un total de trois lavages 500μl. </li><li> Spin une fois de plus à 14000 g à température ambiante pendant 1 sec minute; jeter le accréditives. </li><li> Placer la colonne sur un tube SNAP nouvelle 1.5ml. </li><li> Ajouter 50 pl de DEPC-eau tiède (50 ° C) à la colonne et la colonne SNAP incuber à température ambiante pendant 1 minute. Éluer l&#39;ADNc via un spin à 14000 g à température ambiante pendant 1 minute. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.9, en utilisant 100 pi de chaudes DEPC-eau et le même tube de 1.5ml pour l&#39;éluant. </li><li> Ajouter 20 pi d&#39;acétate de sodium 3M (pH 5,2) à l&#39;éluant à partir des étapes 2.9 et 2.10. </li><li> Ajouter 3μl de glycogène (20mg/ml) dans le tube et mélanger. </li><li> Ajouter 500μl d&#39;glacée EtOH à 100%, bien mélanger et incuber le tube pendant 1 heure à -80 ° C. </li><li> Spin le tube à 14000 g à 4 ° C pendant 20 minutes. Retirer délicatement le surnageant. </li><li> Ajouter 500μl d&#39;glacée EtOH à 70% et de spin le tube à 14000 g à 4 ° C pendant 5 minutes. Retirer délicatement le surnageant. </li><li> Sécher à l&#39;air de l&#39;échantillon pendant 5 minutes; s&#39;assurer que tous les EtOH est enlevé. </li><li> Chauffer le tampon de couplage 2X à 37 ° C pendant 5 minutes et re-suspension de l&#39;échantillon d&#39;ADNc dans 5uL de tampon de couplage chaleur 2X. </li><li> Chauffer l&#39;ADNc / Tampon de couplage à 50 ° C pendant 10 minutes et tourbillon bien. Assurez-vous que votre culot d&#39;ADNc est totalement remis en suspension dans le tampon de couplage 2X. </li></ol> Partie 3: Étiquetage par un colorant fluorescent Lors de la préparation de la réaction, être prudent afin de minimiser l&#39;exposition de la solution de colorant à la lumière. En outre, le DMSO est hygroscopique et absorbe l&#39;humidité de l&#39;air, qui va réagir avec l&#39;ester NHS de la teinture et de réduire considérablement le rendement de la réaction de couplage. Gardez le DMSO fourni dans le kit dans un bouchon à vis ambrée flacon à -20 ° C, et laisser le flacon à température ambiante avant d&#39;ouvrir pour éviter la condensation. Utilisez uniquement le DMSO fourni avec ce kit. <ol><li> Ouvrez un paquet de Cy-3 ou Cy-5 Dye et ajouter 75μl de DMSO directement au flacon de teinture. </li><li> Ajouter 5uL de la solution de DMSO / colorant pour le tube de l&#39;étape 2.18. </li><li> Bien mélanger et incuber le tube à température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 1 heure. </li><li> Ajouter 20 pi d&#39;acétate de sodium 3M (pH 5,2) à la solution de teinture couplé ADNc. </li><li> Ajouter 500μl de tampon de chargement à la solution d&#39;ADNc. Mélangez bien au vortex. </li><li> Placer une colonne SNAP sur un tube de collecte clair et la charge de la solution d&#39;ADNc / tampon. </li><li> Centrifuger à 14000 g à température ambiante pendant 1 minute; jeter le accréditives. </li><li> Placer la colonne SNAP sur la même collectionle tube, ajouter 500μl de tampon de lavage de la colonne. </li><li> Centrifuger à 14000 g à température ambiante pendant 1 minute; jeter le accréditives. </li><li> Répétez les étapes 3. 8 à 3,9 à trois reprises, pour un total de trois lavages 500μl. </li><li> Spin une fois de plus à 14000 g à température ambiante pendant 1 minute; jeter le accréditives. </li><li> Placer la colonne sur un tube SNAP ambrée nouvelle collection. </li><li> Ajouter 65μl de DEPC-eau tiède (50 ° C) à la colonne SNAP et incuber à température ambiante pendant 1 minute. </li><li> Centrifuger à 14000 g à température ambiante pendant 1 minute et recueillir le flux continu. Le flux continu doit contenir 60μl de votre purifiée colorant couplé ADNc. </li></ol> Partie 4: Évaluation de la procédure de labellisation. <ol><li> Effectuer un essai de spectrophotomètre pour évaluer chacun étiquetage Cy-ADNc. Calculer le nombre total de pmoles d&#39;ADNc synthétisé: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Calculez le total de pmoles incorporées Cy-Dye pour chaque réaction de marquage: pmol Cy3 = [DO 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [DO 650 X vol.] / 0,25. Ensuite, calculez le pmol de nucléotides / pmol ratio de teinture pour chaque réaction. Optimal réactions génèrent 6000pmol&gt; d&#39;ADNc (par 60ul),&gt; 200pmol de Cy-Dye (par 60ul), et un ratio de nucléotides / colorant qui est &lt;30. </li></ol> Partie 5: Glissez prélavage <ol><li> Le tableau est imprimé sur PtGen2 diapositives UltraGAPS Corning (amino-silane couché) et les ADNc sont UV-réticulé. Imprimer taches sont clairement visibles en raison de la forte teneur en sel du tampon. </li><li> Utilisez un stylo à pointe de diamant pour marquer le toboggan pour les zones supérieure et inférieure de la zone d&#39;impression (en option). </li><li> Mettez environ 250mL pré-chauffé à 43 ° C une solution à 0,2% de SDS dans un plat à laver microscope à glissière (3 &quot;x 4&quot;). </li><li> Placer les lames d&#39;être pré-hybridés dans le rack glisser et plonger dans la solution de SDS 15-20 fois très vigoureusement pour éliminer les sels sur les diapositives. </li><li> En utilisant une pince, retirer soigneusement les diapositives de la grille et les placer dans un bocal contenant de Coplin mémoire tampon de pré-hybridation (5X SSC, 0,1% SDS, 1% de BSA) qui a été préchauffé à 43 ° C. Incuber à 43 ° C pendant au moins une heure. </li></ol> Partie 6: pré-hybridation <ol><li> Mettre en place cinq plats glisser à laver, chacun rempli de millipure dH 2 O, et une jarre de Coplin remplie moléculaires isopropanol de qualité. Placer les lames dans un rack de diapositives et processus de façon séquentielle à travers cinq plats par tremper 20 fois chacun. </li><li> Retirer diapositives deux à la fois de l&#39;eau de lavage cinquième et DIP 5-6 fois à la place de l&#39;isopropanol et immédiatement se glisse dans la microcentrifugeuse diapositives (paillasse Chipmate, 2 postes) et de spin 1 minute à sécher. </li><li> Diapositives Nettoyer à l&#39;air comprimé filtré à travers un filtre à cartouche de 0,22 um et placez-les avec le code barre vers le haut dans une chambre d&#39;hybridation génomique Solutions. </li><li> LifterSlips Clean ™ avec air filtré et les positionner sur les lames avec les bandes blanches vers le bas. Utiliser un embout de pipette jaune pour aligner les délicatement glisser lifter sur la diapositive (lavage LifterSlips ™ abord dans l&#39;éthanol à 70% est facultative. Nous avons trouvé que c&#39;était inutile.) </li></ol> Partie 7: Hybridation Doit être effectuée à la lumière sombre ou faible. <ol><li> Pour chaque lame à hybrider, calculer le montant de Cy-5 et Cy-3 ADNc marqué pour donner 50-75pmol de chaque cible. Combinez ces montants dans un seul tube et sécher dans un dessiccateur à vide avec le réglage de la chaleur à 37-45 ° C. Évitez de faire sécher complètement! </li><li> Resuspendre les sondes séché dans 60mL de tampon d&#39;hybridation (fait frais ce jour-là) et brièvement au vortex. </li><li> Incuber les ADNc resuspendu pendant 5 minutes dans un bain de 95 ° C puis centrifuger rapidement pendant 30 secondes. </li><li> Chargez le volume de sonde toute suspension par pipetage lentement à la diapositive-LifterSlip ™ de jonction au fond (fin du code à barres) de la diapositive. La diapositive se charge par voie d&#39;action capillaire. (Certains préfèrent pipette sur la diapositive et puis doucement superposer les LifterSlip ™ s&#39;agit d&#39;une méthode d&#39;un seul coup, car si vous obtenez les bulles vous ne pouvez pas déplacer le ™ LifterSlip après le placement qui peut conduire à repérer les artefacts bavures) </li><li> 20ul place de la TNT 100 mM dans chacun d&#39;humidité bien situés aux extrémités de la chambre. </li><li> Placez le haut de la chambre et serrer les vis à came. Couvrir la chambre avec du papier aluminium et les plonger dans un bain d&#39;eau de 48 ° C pendant 12-18 heures avec une agitation douce à 50-60 min. </li></ol> Partie 8: Post-hybridation Lave Tous les lavages doivent être effectués à la lumière sombre ou faible. Les lames doivent jamais être autorisés à sécher jusqu&#39;à l&#39;étape finale. <ol><li> Mettre en place un pot rempli de Coplin solution de lavage n ° 1 @ 53 ° C, et quatre plats glisser-linge rempli de 250 ml de chacun des éléments suivants: 1) WSolution n ° 1 de cendres @ 53 ° C, 2) la solution de lavage n ° 2 @ température ambiante, 3 &amp; 4), deux plats contenant la solution de lavage # 3 @ température ambiante. </li><li> Retirez délicatement les diapositives de la chambre d&#39;hybridation et placez-les deux à la fois dans la jarre de Coplin. Laisser reposer pendant 30 secondes, puis soulevez le glisser lentement et le bordereau de lifter restera dans le bocal. Placer les lames dans le châssis lame et immédiatement plonger dans la solution de lavage n ° 1 (1X SSC, SDS 0,2%, préchauffer à 43 ° C). Répétez jusqu&#39;à ce que tous LifterSlips sont enlevés et toutes les diapositives doivent être lavés sont dans la solution de lavage n ° 1 plat. Plongez en rack de haut en bas 10 fois vigoureusement. </li><li> Vaisselle Placer dans 53 ° C dans l&#39;air shaker avec secousses à 50-100 rpm pendant 10 minutes. </li><li> Transfert rack pour laver Solution n ° 2 (0,1 X SSC, SDS 0,2%), plongent 10 fois, et incuber à température ambiante, lent agitant pendant 10 minutes. </li><li> Plongez en rack 15 fois dans la solution de lavage première # 3 (0,1 X SSC) pour enlever tout résidu SDS effectuer le relais de la solution de lavage n ° 2. Placer la grille dans la solution de lavage n ° 3 secondes plat, plongent 10 fois, puis lente secouer pendant 10 minutes. </li><li> Placer les lames dans des tubes Falcon 50 ml et de spin plafonné @ 1500 rpm dans la centrifugeuse équipée d&#39;un rotor swing. Retirer diapositives à la lumière de conteneurs épreuve, nous utilisons un autre tube Falcon recouvert de papier d&#39;aluminium, et purger l&#39;air du tube avec de l&#39;azote, bonnet serré (ce qui réduit l&#39;oxydation des colorants Cy, Cy-5 en particulier en été lorsque les niveaux d&#39;ozone sont plus élevés ). Les diapositives peuvent être stockées pendant quelques heures avant la numérisation dans les tubes purgées à l&#39;azote, mais les meilleurs résultats sont obtenus lorsque le signal de balayage est effectué immédiatement après le lavage. </li></ol> Partie 9: Collecte des données et analyse statistique <ol><li> Données d&#39;image Scan est recueilli sur un ScanArray PerkinElmer. Nous utilisons un paramètre de numérisation de 10 microns et l&#39;équilibre Cy3 et Cy5 signaux utilisant la méthode d&#39;ajustement de ligne selon les instructions du fabricant. </li><li> Fichiers TIF sont maillées et des données signal brut collecté et filtré avec ImaGene version 7.5 (BioDiscovery, Inc, El Segundo, Californie) </li><li> Normalisation des données et d&#39;évaluation afin de déterminer statistiquement espèces valides exprimés différentiellement est fait avec des outils de tableau BRB Ver. 3.7. </li><li> Pattern Analysis pour faciliter la détermination des gènes exprimés de façon coordonnée se fait avec l&#39;expression des gènes Pattern Analysis Software (GEPAS) Ver. 3.1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1182/Figure1_WWLorenz-1.png" alt="Figure 1" /> Figure 1. Exemple de gamme PtGen2 traitées à l&#39;aide de cette l. Protoco <img src="/files/ftp_upload/1182/Figure2_WWLorenz.png" alt="Figure 2" /> Figure 2. Exemple de gamme PtGen2 traitées en utilisant l&#39;hybridation et des protocoles standards à laver.

<ol>
	<li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+(Pinus+taeda)+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries.">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li><li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> unpublished data. , .</li><li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis.">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li><li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESTs,+cDNA+microarrays,+and+gene+expression+profiling:+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development.">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li><li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gene+Expression+changes+in+Pinus+species+using+a+Loblolly+pine+cDNA+microarray.">Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray.</a> IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).</li><li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+during+P.+pinaster+embryo+development.">Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development.</a> 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).</li></ol>

PtGen2 a été récemment développée, microréseaux d&#39;ADNc personnalisée qui a été conçu pour être utilisé principalement par la communauté de recherche à encens de pin. Les résultats préliminaires généré à ce jour ont montré que le tableau à être un outil précieux dans l&#39;évaluation des événements transcriptionnels qui se produisent en réponse à la sécheresse, ainsi que dans la surveillance des changements qui surviennent au cours du développement embryonnaire dans le pin maritime, <em...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pre-hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt&#x2019;s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #1</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #2</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC, 0.2% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #3</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC</td>
</tr>
<tr>
<td>Isopropyl Alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>34959-2.5L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352196</td>
<td>Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation</td>
</tr>
<tr>
<td>Coplin Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Dish & Rack </td>
<td>Other</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
<td>Other</td>
<td>Sigma&#x2122;</td>
<td>A-9418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PolyA RNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>POLYA.GF</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling </td>
<td>Kit</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>L1014-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Turbo DNase</td>
<td>Kit</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1907</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-5 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA25001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-3 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA23001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LifterSlips&trade;</td>
<td>Other</td>
<td>Erie Scientific Company&#x2122; </td>
<td>25X601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HybChambers</td>
<td>Equipment</td>
<td>GeneMachines</td>
<td>JHYB200003</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

processing the loblolly pine ptgen2 cdna microarray

PtGen2 est une puce 26496 fonction d&#39;ADNc contenant amplifié ESTs pin blanc. Le tableau est produit dans notre laboratoire pour une utilisation par les chercheurs qui étudient l&#39;expression des gènes dans les espèces de conifères et d&#39;autres pins. PtGen2 a été élaboré à la suite de nos efforts de découverte de gènes chez le pin taeda, et est composé de séquences identifiées principalement par les tissus des racines, mais aussi de l&#39;aiguille et la tige. PtGen2 1,2 a été testé par hybridation différents Cy-dye étiquetés ADNc cible de conifères , utilisant à la fois amplifié et non amplifié méthodes indirectes d&#39;étiquetage, et aussi testé avec un certain nombre de conditions d&#39;hybridation et de lavage. Cette vidéo se concentre sur la manipulation et le traitement des diapositives avant et après pré-hybridation, ainsi que, après hybridation, en utilisant certaines modifications aux procédures développées précédemment. Sont également inclus 3,4, sous forme de texte uniquement, sont les protocoles utilisés pour la production, l&#39;étiquetage et le nettoyage des s ADNc cible, ainsi que des informations sur le logiciel utilisé pour le traitement des données en aval. PtGen2 est imprimé avec un tampon d&#39;impression exclusive qui contient de fortes concentrations de sel qui peut être difficile à enlever complètement. Les lames sont d&#39;abord lavé dans une solution tiède de SDS avant de pré-hybridation. Après pré-hybridation, les lames sont lavées vigoureusement dans plusieurs changements d&#39;eau pour l&#39;élimination complète des sels restants. LifterSlips ™ sont ensuite nettoyées et positionnés sur les lames et les ADNc marqué est soigneusement chargée sur la puce par voie d&#39;action capillaire qui prévoit une répartition uniforme de l&#39;échantillon à travers la lame, et réduit le risque de constitution de bulles. L&#39;hybridation des cibles pour le tableau est fait à 48 ° C dans des conditions de forte humidité. Après l&#39;hybridation, une série de lavages standards sont effectuées à 53 ° C et la température ambiante pendant des périodes prolongées. Traitement PtGen2 diapositives en utilisant cette technique réduit le sel et le SDS dérivés artefacts souvent vu lorsque le tableau est traité moins rigoureusement. Hybridation des cibles à partir de plusieurs sources différentes ARN conifères, ce protocole de traitement donné moins d&#39;artefacts, de fond réduit, et a fourni une meilleure cohérence entre les différents groupes expérimentaux de tableaux.

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Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

L&#39;ADNc biopuces PtGen2 a été développé pour les études d&#39;expression génique dans le pin taeda,<em&gt; P. taeda</em&gt;, Et d&#39;autres conifères. Ici, nous montrons pré-et post-hybridation manutention et le lavage des techniques qui peuvent être utilisés avec ce tableau de céder une meilleure cohérence, les artefacts réduits, et de milieux.

Traitement du pin taeda PtGen2 cDNA microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

processing-the-loblolly-pine-ptgen2-cdna-microarray

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K vues.  University of Georgia (UGA). L'ADNc biopuces PtGen2 a été développé pour les études d'expression génique dans le pin taeda, P. taeda, Et d'autres conifères. Ici, nous montrons pré-et post-hybridation manutention et le lavage des techniques qui peuvent être utilisés avec ce tableau de céder une meilleure cohérence, les artefacts réduits, et de milieux.

Vidéo: Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

Gibberella zeae ascospores production et la collecte d&#39;expériences sur biopuces.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Recherche

Biologie

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

La sonde microfluidique: Fonctionnement et utilisation pour le traitement de surface localisé

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Isolement d&#39;ARN à partir de synthèse d&#39;ADNc embryonnaires Zebrafish et pour analyser l&#39;expression génique

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Mondial Analyse expression génique utilisant une plateforme biopuces oligonucléotidiques Zebrafish

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high concentrations of phenolic compounds and polysaccharides that interfere with RNA purification. Isolation of high-quality RNA from these species requires rigorous tissue collection procedures in the field and the employment of an RNA isolation protocol comprised of multiple organic extraction steps in order to isolate RNA of sufficient quality for microarray and other genomic analyses. The isolation of high-quality RNA from field-collected loblolly pine samples can be challenging, but several modifications to standard tissue and RNA isolation procedures greatly improve results. The extent of general RNA degradation increases if samples are not properly collected and transported from the field, especially during large-scale harvests. Total RNA yields can be increased significantly by pulverizing samples in a liquid nitrogen freezer mill prior to RNA isolation, especially when samples come from woody tissues. This is primarily due to the presence of oxidizing agents, such as phenolic compounds, and polysaccharides that are both present at high levels in extracts from the woody tissues of most conifer species. If not removed, these contaminants can carry over leading to problems, such as RNA degradation, that result in low yields and a poor quality RNA sample. Carryover of phenolic compounds, as well as polysaccharides, can also reduce or even completely eliminate the activity of reverse transcriptase or other polymerases commonly used for cDNA synthesis. In particular, RNA destined to be used as template for double-stranded cDNA synthesis in the generation of cDNA libraries, single-stranded cDNA synthesis for PCR or qPCR's, or for the synthesis of microarray target materials must be of the highest quality if researchers expect to obtain optimal results. RNA isolation techniques commonly employed for many other plant species are often insufficient in their ability to remove these contaminants from conifer samples and thus do not yield total RNA samples suitable for downstream manipulations. In this video we demonstrate methods for field collection of conifer tissues, beginning with the felling of a forty year-old tree, to the harvesting of phloem, secondary xylem, and reaction wood xylem. We also demonstrate an RNA isolation protocol that has consistently yielded high-quality RNA for subsequent enzymatic manipulations.

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Many plant tissues, including phloem and xylem from loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high levels of phenolics and polysaccharides that interfere with RNA purification. This presentation discusses techniques for the harvest of field-grown tissues and isolation of RNA of sufficient quality for microarrays and other genomic analyses.

Une méthode améliorée d&#39;isolement d&#39;ARN à partir de pin taeda ( P. taeda L.) et d&#39;autres conifères

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

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In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

Exécution personnalisée expériences de micropuces MicroRNA

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been studied substantially using traditional two-dimensional techniques. Recent advancements in X-ray imaging technology via desktop micro-computed tomography (&#181;CT) and synchrotron radiation micro-computed tomography (SR&#181;CT) have allowed for the acquisition of high-resolution three-dimensional (3D) scans of a larger field of view (FOV) than other 3D imaging techniques (e.g., SEM) providing a more complete picture of microscopic structures within human cortical bone. The specimen should be accurately centered within the FOV, however, to limit the appearance of streak artifacts known to impact data analysis. Previous studies have reported procurement of irregularly shaped rectilinear bone blocks that result in imaging artifacts due to uneven edges or image truncation. We have applied a geological sampling protocol (coring) to procure consistently sized cortical bone core specimens for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This coring method is efficient and minimally destructive to tissue. It creates uniform cylindrical samples that decrease imaging artifacts by nature of being isometric during rotation and providing a uniform path length for X-ray beams throughout scanning. Image processing of X-ray tomographic data of cored and irregularly shaped samples confirms the potential of the technique to improve visualization and analysis of cortical bone microarchitecture. A goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable method for the extraction of cortical bone cores that is adaptable for various types of high-resolution bone imaging experiments. An overarching goal of the work is to create a standardized cortical bone procurement for SR&#181;CT that is affordable, consistent, and straightforward. This procedure may further be adapted by researchers in related fields who commonly evaluate hard composite materials such as in biological anthropology, geosciences, or material sciences.

We employed a geological (coring) sampling protocol to procure cortical bone specimens of uniform size for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This method is minimally destructive, efficient, results in cylindrical specimens that minimize imaging artifacts from irregular sample shapes and improves microarchitectural visualization and analysis.

Un guide de sectionnement, de coring et de traitement d’image pour l’approvisionnement et l’analyse d’échantillons d’os cortical à haut débit pour le micro-CT synchrotron

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

Élucider la structure et l’occurrence des glycanes à l’aide du profilage des polymères de microréseaux

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

Pleins feux sur l’auteur : Protocole MAPP – Faire progresser l’analyse des glycanes 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

Profilage des polymères par puce à ADN (MAPP) pour l’analyse des glycanes à haut débit

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...