Ce protocole est significatif, parce qu’il utilise une méthode de visualisation sans taches au lieu de la visualisation basée sur le colorant sur le tissu cérébral humain post mortem, qui aide à préserver l’intégrité de l’ARN. La préservation de l’ARN est un grand avantage dans ce protocole, car il est utile, non seulement dans le tissu cérébral humain post mortem, mais aussi d’autres types de tissus, avec une activité rnase élevée. Pour commencer, retirez le tissu du congélateur et placez-le sur de la glace sèche pour le transporter au cryostat.
Placez les brosses propres, le mandrin et le tissu dans le cryostat pendant au moins 20 minutes, pour leur permettre d’atteindre la température optimale. Pour les cryostats avec des chambres doubles et des températures de détention de spécimens, réglez la température de l’objet à moins 16 degrés Celsius et la température de la chambre à moins 18 degrés Celsius. Réglez l’épaisseur de la section du cryostat à 14 micromètres et l’épaisseur de la garniture à 30 micromètres.
Ensuite, nettoyez la scène avec un mélange de décontamination RNase et 70% d’éthanol, pour éviter le gel. Obtenez une nouvelle lame de cryostat jetable et nettoyez-la avec un décontamineur RNase. Placez la lame nettoyée dans le porte-lame sur la scène.
Ensuite, nettoyez la plaque anti-roulis avec le décontamineur RNase. Attachez la plaque nettoyée à la scène et attendez au moins 20 minutes que la lame et la plaque anti-roulis descendent à la température du cryostat. Tout d’abord, couper un petit morceau de tissu pour la section, en s’assurant que la section est d’environ 95% cortex cerebellar.
Remettre le reste du tissu soit à la glace sèche, soit au congélateur, à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, commencez lentement à ajouter oct sur le dessus du mandrin avec un lent, mouvement circulaire. Accumulez des couches d’OTC jusqu’à ce qu’il y ait une monture d’environ trois millimètres de haut couvrant le mandrin.
Lorsque l’OCT est partiellement congelé, mais a encore un peu de liquide au centre, placez les tissus sur le dessus de la monture. Laisser reposer le tissu sur le dessus de l’OCT pendant une à deux minutes jusqu’à ce qu’il soit complètement congelé. Ensuite, transférez le mandrin avec l’OCT congelé et le tissu dans le bras de coupe cryostat.
Ajustez le tissu de façon à ce qu’il soit rincé avec la lame de coupe et laissez le tissu reposer dans le bras de coupe pendant 20 minutes pour s’adapter à la nouvelle température. L’étape la plus critique est de permettre au tissu de s’acclimater dans le bras de coupe cryostat aussi longtemps que nécessaire. Si les tissus déchiquetent, la visualisation cellulaire purkinje sera très difficile.
Je recommande d’utiliser des tissus plus petits et plus minces pour permettre au tissu de s’acclimater plus rapidement. Après cela, déplacez lentement le tissu plus près de la lame. Une fois que le tissu a atteint la lame, commencer le processus de coupe.
Couper le tissu deux à trois fois, jusqu’à ce que les couches du cortex soient visibles. Ensuite, placez et alignez la plaque anti-roulis juste au-dessus de la lame cryostat. Coupez quatre à six sections de 14 micromètres d’épaisseur, en notant que les sections correctement coupées seront à plat sous la plaque anti-roulis.
Alignez les sections coupées horizontalement sur le stade cryostat. Inclinez une glissière pour ramasser tous les morceaux de tissu simultanément. Immédiatement après avoir sectionner le tissu, placez la lame dans le porte-lame avec 70 % d’éthanol sur la glace pendant deux minutes.
Transférez la glissade sur un support de glissière avec 95 % d’éthanol sur la glace pendant 45 secondes. Ensuite, placez la lame dans le support de diapositives avec 100% d’éthanol à température ambiante pendant deux minutes. Trempez la glissière trois fois dans le porte-glissière contenant du xylène numéro un à température ambiante.
Ensuite, placez la glissière dans le support de diapositives avec du xylène deux à température ambiante pendant cinq minutes. Tenez les glissières dans un capot de fumée propre et laissez-les sécher à l’air pendant au moins 30 minutes. Si vous stockez les glissières, placez-les dans un tube séparé de 50 millilitres et placez les tubes dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant une période d’une période d’une période de sept jours.
Tout d’abord, utilisez le décontamineur RNase pour nettoyer l’étape du microscope et le bras de collecte du bouchon. Avec les mains gantées, placez la lame sur le microscope et un bouchon opaque de 500 microlitres dans le bras de collecte. Lors d’un grossissement faible, aligner le capuchon opaque sur le tissu cerebellar, en s’assurant que le bouchon couvre toute la zone qui est visualisée dans le morceau d’oeil.
Utilisez un objectif de cinq à dix fois pour visualiser les couches cerebellar. Placez le curseur sur la section où se croisent la couche moléculaire et la couche granuale des cellules. Passez à un grossissement 40 fois et visualisez les cellules purkinje.
Ensuite, commencez à les capturer. Pour commencer la collecte de l’ARN après la microdissection, ajouter 50 microlitres de tampon de lyse cellulaire au bouchon opaque avec le bouchon orienté vers le haut. Fermez soigneusement le tube au-dessus du bouchon et procédez à la collecte comme indiqué dans le protocole de texte.
Dans ce protocole, frais, congelé, post mortem, tissu cérébral humain est préparé pour la microdissection de capture laser UV. Après la section cryostat dans le temps de dessin alloué, les couches cellulaires du cervelet sont facilement visibles avec cinq fois et 10 fois des lentilles objectives. Comme on le voit ici, l’incubation appropriée du xylène fait que le tissu devient plus foncé et délimite mieux les couches cellulaires que l’éthanol seul.
Lors de la coupe au microscope de capture laser, la lentille 40 fois objectif est nécessaire pour assurer la capture que les cellules purkinje et non pas le tissu environnant. Comme on le voit ici, l’incubation appropriée dans le xylène produit une image morphologiquement intacte de haute qualité par rapport à la seule fixation de l’éthanol. La capacité de glissement de couverture d’un capuchon opaque est ensuite testée tandis que d’autres protocoles utilisent un bouchon rempli de liquide, ces bouchons peuvent réduire la visualisation des tissus et provoquer l’image résultante d’être granulaire et irisé sous le microscope.
Cependant, la visualisation à travers un capuchon opaque entraîne l’apparence lisse des tissus qui est plus doux et plus nette dans la forme. Des images représentatives de cellules purkinje excisées à faible puissance et à haute puissance montrent l’enlèvement précis du corps cellulaire purkinje. Après cela, rnase de haute qualité est obtenu pour le séquençage ultérieur de l’ARN.
Six échantillons représentatifs ont subi l’extraction d’ARN et ont été résuspendus dans 14 microlitres d’eau sans arn et les six échantillons ont produit l’ARN de haute qualité avec des nombres d’intégrité d’ARN égaux ou supérieurs à huit. La chose la plus importante à retenir est que la qualité des tissus est tout. Même la coupe et le placement de diapositives feront ou rompront ce protocole.
À la suite de cette procédure, toute méthode qui étudie l’ARN ou l’ADN pourrait être effectuée, en particulier nous sondons notre ARN pour l’expression différentielle des gènes, mais d’autres questions concernant la régulation des gènes pourraient également être étudiées. Cette méthode pourrait être appliquée à tout type de tissu qui a une morphologie délimitée spécifique qui ne nécessite pas l’utilisation d’antigènes ou de réagens spécifiques à la teinture pour l’identification des cellules d’intérêt. Nous espérons que cette technique nous aidera à comprendre la génétique des tremblements essentiels et d’autres maladies qui ont un phénotype tremblement.
Le produit chimique le plus dangereux utilisé dans ce protocole est le xylène. Il doit être manipulé correctement dans un capot de fumée, éliminé correctement, et les glissières devraient être autorisées à sécher adéquatement jusqu’à ce qu’elles soient utilisées dans un espace ouvert. En outre, lorsque vous travaillez avec des échantillons humains, la gestion des déchets biodangereux et la sécurité devraient être utilisées.
