Il est très important de porter des gants sans poudre lors de la préparation de la couche mince. Nettoyage de la plaque d&#39;échantillon <ol><li> Utiliser une plaque d&#39;acier inoxydable ou en or de l&#39;échantillon MALDI. </li><li> Laver avec du MeOH et essuyer délicatement avec un Kimwipe. Ne pas frotter ou frotter la surface avec le Kimwipe, pour éviter de rayer la surface. </li><li> Laver avec H 2 O et essuyer délicatement avec un Kimwipe. </li><li> Laver avec du MeOH et essuyer délicatement avec un Kimwipe. </li><li> Si nécessaire, répétez MeOH / H 2 O cycle de nettoyage / MeOH, finissant toujours par MeOH. </li><li> Assurez-vous qu&#39;il n&#39;ya pas de taches fantômes ou résidu restant sur la plaque. S&#39;il ya des taches fantômes, rincer la plaque avec de l&#39;eau déminéralisée tout en frottant la surface avec votre main gantée (Ne pas frotter avec Kimwipes). Répétez le MeOH / H 2 O cycle de nettoyage / MeOH. </li><li> Utilisez la plaque immédiatement après le lavage. </li></ol> Préparation de la solution substrat mince couche <ol><li> Mélanger 1 partie de gras saturés 4-HCCA (2 pièces d&#39;ACN, 1 partie d&#39;eau, et 0,1% final TFA) et 3 parties d&#39;isopropanol. Remarque: La solution fine couche substrat est très stable, et peut être conservé à température ambiante dans l&#39;obscurité pendant un an. Il peut également être conservés à 4 ° C. </li></ol> Rendre le substrat mince couche <ol><li> Appliquer 20-50 pl de la solution de substrat couche mince sur le centre gauche de la plaque, et étaler avec le côté d&#39;une extrémité de la pipette. Balayer dans une direction. </li><li> En séchant, solution, le solvant organique s&#39;évapore très rapidement, laissant derrière de minuscules gouttelettes d&#39;eau sur la surface de la plaque. A ce point, enveloppez votre index avec une nappe de Kimwipe et initialement éponger délicatement la surface de la plaque avec elle. </li><li> Lorsque la surface est libéré de gouttelettes d&#39;eau, essuyez la plaque entière avec uni-directionnel mouvements de balayage en utilisant un Kimwipe. Remarque: Si la solution ne se propage pas assez de toute la surface de la plaque, d&#39;augmenter la composition d&#39;ACN et de recréer la couche mince. Certains paramètres qui peuvent influer sur la propagation de la solution comprennent l&#39;humidité ambiante et la température. Remarque: Avec des plaques d&#39;or, la couche apparaît généralement comme un reflet jaunâtre, en fonction de visualisation et d&#39;angles de lumière. Avec des plaques d&#39;acier, seul le bord de la couche est normalement visible. </li><li> Nettoyer les bords de la plaque avec un Kimwipe frais avant de le placer dans le support de plaque pour éviter de contaminer la matrice de l&#39;instrument. </li></ol> Préparation de la solution de matrice <ol><li> <a href="http://prowl.rockefeller.edu/protocols/saturated-4HCCA-solution.html">Saturés 4-HCCA</a> dans FWI (3 parties d&#39;acide formique, 1 partie d&#39;eau, 2 parties d&#39;isopropanol) est recommandé pour l&#39;analyse des deux membranes et les protéines solubles. Il pourrait également être utilisé dans des cas particuliers pour l&#39;analyse des peptides très hydrophobes de grande taille (M&gt; u 4000). Assurez-vous que la solution la matrice utilisée pour repérer les protéines ne dépasse pas ~ 50% de contenu organique, car il dissoudre complètement le substrat en couche mince, défaisant les avantages de la méthode. </li></ol> Test du substrat mince couche <ol><li> 0.5μL spot de la solution de la matrice sur la plaque. Un précipité blanchâtre apparaît à l&#39;interface entre la couche mince et la goutte. Lorsque cette couche recouvre le fond de la gouttelette entièrement, habituellement dans les 10-15 secondes, aspirer l&#39;excès de liquide avec une ligne vide. Si cela prend plus longtemps que 30 secondes pour le précipité se forme, c&#39;est une indication qu&#39;il pourrait y avoir un problème avec le substrat en couche mince et / ou la solution de la matrice. </li></ol> Exemple d&#39;application <ol><li> La concentration de l&#39;analyte dans les solutions de départ devrait être dans les 10 et 1000μM. </li><li> Diluer la solution d&#39;analyte dans la solution de matrice pour une concentration de l&#39;analyte finale entre 0,2 et 2 pm. Par exemple, commencez avec 1 microlitre d&#39;échantillon et de solution 9μl matrice. Remarque: Assurez-vous que la matrice est proche de la saturation dans la solution finale, sinon vous allez dissoudre le substrat en couche mince. Remarque: les concentrations d&#39;analyte nécessaire d&#39;obtenir des signaux décent sont très dépendants de la complexité et la solution de composition (par exemple, les contaminants) et ionizability analyte. Note: Si une dilution en une seule étape ne donne pas de bons résultats, vous devriez essayer une autre étape de dilution. Bien que contre-intuitive, les solutions analyte très concentré produisent rarement de bons spectres. Remarque: Les protéines membranaires nécessitent généralement plus grandes dilutions. </li><li> 0.5μl spot de l&#39;échantillon / matrice de mélange sur la plaque. Un précipité blanchâtre se forme à l&#39;interface entre la couche mince et la goutte. Ce précipité est le co-cristallisation de la matrice et l&#39;analyte. Lorsque cette couche recouvre le fond de la gouttelette entièrement, Usuallié en 10-15 secondes, aspirer l&#39;excès de liquide avec une ligne vide. Si cela prend plus longtemps que 30 secondes pour le précipité se forme, il peut être une indication d&#39;un contaminant présent, ce qui empêche la cristallisation, ou votre analyte est trop concentré. </li></ol> L&#39;application calibrant <ol><li> Préparer le mélange calibrant / matrice d&#39;une manière similaire avec une concentration finale entre 0,1 calibrant-0.5μM. </li><li> Spot 0.5μl calibrant / matrice de mélange sur la plaque à proximité de spots de l&#39;échantillon. Cette proximité physique est utilisée dans une procédure d&#39;étalonnage de pseudo-intérieures dans lequel la plaque est déplacé de l&#39;endroit de l&#39;échantillon à l&#39;endroit calibrant lors de l&#39;acquisition de l&#39;échantillon, pour ajouter un peu de tirs laser de l&#39;calibrants au spectre. Cette approche garantit un calibrage supérieur de masse de précision que l&#39;étalonnage externe seulement. </li></ol> Étape de lavage <ol><li> Lavez chaque spot avec environ 2μL d&#39;une solution froide de la glace 0,1% de TFA aqueux. Aspirer l&#39;excès de liquide avec une ligne vide. </li></ol> Acquisition des spectres de masse <ol><li> Vous êtes maintenant prêt à acquérir des spectres de masse. Si vous utilisez la solution de matrice FWI, vous devez acquérir votre spectres dès que possible pour empêcher la modification irréversible de l&#39;analyte telles que la formylation. </li></ol>

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	<li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+to+Increase+Contaminant+Tolerance+in+Protein+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+by+the+Fabrication+of+Thin+Protein-Doped+Polycrystalline+Films.">A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li><li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Robust,+Detergent-Friendly+Method+for+Mass+Spectrometric+Analysis+of+Integral+Membrane+Proteins.">A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins.</a> Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li><li>Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains.">Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).</li></ol>

Il est essentiel que tous les réactifs sont de la plus haute qualité (par exemple HPLC). Les gants sans poudre (latex ou nitrile) Acier inoxydable ou plaqué or de l&#39;échantillon MALDI Méthanol (MeOH) Eau Kimwipes alpha-cyano-4-hydroxycinnamique (4-HCCA) Acide trifluoroacétique (TFA) (concentration finale de 0,1% en H 2 O) Acétonitrile (ACN) L&#39;acide formique Isopropanol

maldi sample preparation: the ultra thin layer method

Cette vidéo montre la préparation d&#39;un ultra-mince de matrice / analyte couche pour analyser des peptides et des protéines par Matrix-Assisted Laser Spectrométrie de masse par désorption ionisation (MALDI-MS) 1, 2. La méthode de la couche ultra-mince implique la production d&#39;une couche de substrat de cristaux de matrice (alpha-cyano-4-hydroxycinnamique) sur la plaque échantillon, qui sert de terrain d&#39;ensemencement pour la cristallisation subséquente d&#39;un mélange matrice / analyte. Avantages de la méthode de la couche ultra-mince par rapport aux autres approches de dépôt de l&#39;échantillon (par exemple goutte séchée) sont qu&#39;il fournit (i) une plus grande tolérance aux impuretés telles que les sels et les détergents, (ii) une meilleure résolution, et (iii) plus l&#39;uniformité spatiale. Cette méthode est particulièrement utile pour la détermination de la masse exacte de protéines. Le protocole a été initialement développé et optimisé pour l&#39;analyse des protéines membranaires et utilisé avec succès pour analyser les canaux ioniques, transporteurs métabolite, et les récepteurs, contenant entre 2 et 12 domaines transmembranaires 2. Depuis la publication originale, elle a également montré pour être tout aussi utile pour l&#39;analyse des protéines solubles. En effet, nous avons utilisé pour un grand nombre de protéines ayant une large gamme de propriétés, y compris ceux avec des masses moléculaires plus élevé que 380 kDa 3. Il est actuellement notre méthode de choix pour l&#39;analyse de masse moléculaire de toutes les protéines. La procédure décrite produit une qualité constante des spectres, et il est sensible, robuste et facile à mettre en œuvre.

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

Cette vidéo montre la préparation d&#39;un ultra-mince de matrice / analyte couche pour analyser des peptides et des protéines par Matrix-Assisted Laser Désorption Ionisation Mass Spectrometry (MALDI-MS).

Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince

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