L&#39;auteur remercie le Dr Matthias Mann pour le soutien continu et Mme Katharina Zettl pour démontrer la méthode. Ce travail a été soutenu par la Société Max-Planck pour l&#39;avancement des sciences.

Une. Instrumentation requis <ol><li> Préparation des tranches de tissu pour microdissection et échantillon lyse <ol><li> Thermoblock réglé sur 99 ° C ou un bain d&#39;eau bouillante. </li><li> Laser exploitation microdissecteur (par exemple PALM, Zeiss, Göttingen, Allemagne). </li><li> Thermostaté paillasse centrifugeuse, température réglée à 20 ° C. </li><li> Chambre humide (boîte) avec un support pour les tubes d&#39;évacuation de type Eppendorf. </li><li> Incubateur réglé à 37 ° C. </li><li> Spectrofluorometer permettant la mesure de la fluorescence excitée à proximité de la lumière UV avec des cuves en quartz micro-échelle (0,1-0,2 ml). </li></ol></li></ol> 2. Solutions <ol><li> «Tissue Lysis Buffer» (TLB): 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M de DTT, 0,5% (p / v) de polyethylene glycol 20 000 et 4% de SDS. </li><li> Solution UC: 8 M d&#39;urée dans 0,1 M de Tris-HCl pH 8,5. Préparer 1 ml par 1 échantillon. Solutions UC et de l&#39;AAI doivent être fraîchement préparées et utilisées dans une journée. </li><li> Solution IAA: 0,05 M iodoacetamide en UC. Préparer 0,1 ml par 1 échantillon. </li><li> Endoprotéinase Lys-C, la solution mère. </li><li> Trypsine, la solution mère. </li><li> «Tampon de digestion» (DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8,5. Préparer 0,25 ml par 1 échantillon. </li><li> «Tryptophane Standard Solution &#39;: 0,1 ug tryptophane dans 1 ml d&#39;eau déminéralisée. </li><li> Assay tampon B &#39;(ABB): 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. </li><li> Solution mère de Britton &amp; Universal Buffer Robinson (brub). Préparer une solution contenant 0,1 M de CH 3 COOH, 0.1 MH 3 PO 4, et 0,1 MH 3 BO 3 et ajuster avec NaOH 1 M à pH requis (2, 4, 5, 6, et 11). Avant utilisation diluer 5 fois avec de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Tampon A: 1% (v / v) de CH 3 COOH dans de l&#39;eau désionisée. </li><li> Tampon B: 60% (v / v) de CH 3 CN, 1% (v / v) de CH3COOH dans l&#39;eau désionisée. </li></ol> 3. Pipette Conseil et colonnes &quot;StageTip &#39; <ol><li> Préparer SAX pointe-colonne par empilement de 6 couches de membrane Empore-anion dans une common 0,2 ml pointe de la pipette. Faites deux colonnes SAX-pointe par exemple. </li><li> Préparez &#39;StageTip&#39; en empilant trois couches de Empore-C 18 dans une pipette de 0,2 ml. Faire 6 conseils de Scène pour chaque échantillon. </li></ol> 4. Préparation des tranches de tissu pour microdissection et d&#39;échantillons de lyse <ol><li> Des sections avec un microtome coupé (l&#39;épaisseur des tranches dépend de l&#39;échantillon. Habituellement microdissection fonctionne bien avec des tranches de 7-10 um). </li><li> Irradier les diapositives de la membrane (MembraneSlide 1.0 PEN) avec la lumière UV pendant 45 min. </li><li> Montez les sections sur les lames de la membrane irradier et sec à 37 ° C pendant 2 heures. </li><li> Déparaffiner les sections montées par deux incubations successives dans le xylène pendant 2,5 minutes et 1,5 min. Réhydrater les sections par des incubations successives dans l&#39;éthanol absolu, 70% d&#39;éthanol et de l&#39;eau, chaque pendant 1 min. </li><li> Colorer les sections avec l&#39;hématoxyline de Mayer pendant 20 secondes, rincer à l&#39;eau pendant 1 min, et sécher à l&#39;air. </li><li> Recueillir les populati cellulairesd&#39;intérêt en utilisant le système de microdissection par capture laser. Lors de l&#39;utilisation de l&#39;instrument PALM (Zeiss) collecter les échantillons dans les bouchons adhésifs (adhésif PAC 200). </li><li> Pipeter une aliquote de la TLB sur le matériau microdisséquée dans le capuchon. Fermer le tube et recueillir la suspension par une courte centrifugation. Lyse la microdissection de tissu à 99 ° C dans un bloc chauffant avec agitation (600 rpm) pendant 1 heure. Utilisez 3 pi de tampon pour 10 nl du tissu microdissection. </li><li> Clarifier l&#39;extrait brut par centrifugation à 16 000 g à 18 ° C pendant 10 min. Le lysat peut être conservé congelé à -20 ° C. </li></ol> 5. Traitement des échantillons <ol><li> Mélangez jusqu&#39;à 50 pi de lysat clarifié avec 200 pi d&#39;UC dans les unités d&#39;ultrafiltration (30k légale) et centrifuger à 14 000 xg jusqu&#39;à moins de 10 pi de la solution resteront dans le filtre. Habituellement, cette étape nécessite 10-15 min centrifugation. </li><li> Introduire à la pipette 200 ul d&#39;UC à l&#39;unité d&#39;ultrafiltrationet centrifuger comme en 5.1. Vider le tube de collecte. </li><li> Pipette 50 ul de solution IAA et mélanger à 600 rpm dans un thermo-mélangeur pendant 1 min et centrifuger comme en 5.1. </li><li> Introduire à la pipette 100 ul d&#39;UC à l&#39;unité d&#39;ultrafiltration et centrifuger comme en 5.1. Répétez cette étape deux fois </li><li> Ajouter 100 pi de la DB à l&#39;unité d&#39;ultrafiltration et centrifuger à 5.1. Répétez cette étape deux fois. </li><li> Transférer les unités de filtration de nouveaux tubes de prélèvement. Introduire à la pipette 40 ul de DB avec l&#39;endoprotéinase Lys-C (protéinase par rapport au total de protéine de 1:100) et mélanger à 600 tpm dans thermo-malaxeur pendant 1 min. Incuber les unités dans une chambre humide à 37 ° C pendant 18 heures. </li><li> Centrifuger les unités de filtration à 14 000 x g comme dans 5.1. </li><li> Introduire à la pipette 160 ul d&#39;eau désionisée et on centrifuge les unités de filtre comme dans 5.1. Le flux continu commun (5.7 et 5.8 étapes) contient les peptides libérés par endoprotéinase Lys C. </li><li> Transférer l&#39;unité d&#39;ultrafiltration à un nouveau tube de collecte. Ajouter 40 ulDB avec de la trypsine (rapport enzyme à protéine 1:100) et mélanger à 600 tpm dans thermo-malaxeur pendant 1 min. Incuber les unités dans une chambre humide à 37 ° C pendant 4 heures. Répétez les étapes 5.7 et 5.8 pour recueillir les peptides tryptiques. </li></ol> 6. La quantification des peptides <ol><li> La mesure de la teneur en peptides dans les produits de digestion de protéines peut être réalisée dans un tampon dilué, parce que les résidus tryptophane sont bien accessibles au solvant. </li><li> Introduire à la pipette 0,2 ml d&#39;ABB dans la cuvette de quartz et d&#39;enregistrer le spectre d&#39;émission de «blanc». </li><li> Préparer la courbe d&#39;étalonnage en utilisant 0,1 ug étapes en ajoutant 1 ul aliquotes de TSS à la cuvette et doux mélange avec l&#39;ABB. </li><li> Nettoyer la cuvette. </li><li> Pipeter l&#39;échantillon et enregistrer le spectre (échantillon). </li><li> Calcul de la concentration de protéine et de peptide Etant donné que 0,1 ug tryptophane correspond à environ 9 pg de protéine (sur la base de la moyenne de 1,1% de la teneur en tryptophane dans des mélanges protéiques obtenus by lyser les cellules humaines) la teneur en protéines de l&#39;échantillon ou dans le peptide contenu dans le produit de digestion est égale à: <img alt="Equation 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> où F (Standard1) est la fluorescence de 0,1 ug norme tryptophane. La teneur en peptide permet de calculer le rendement de la procédure de digestion et fournit des informations essentielles pour le peptide suivant le fractionnement et l&#39;analyse par spectrométrie de masse. </li></ol> 7. Fractionnement des Lys-C et tryptiques peptides <ol><li> Diluer les solutions de peptides obtenus par digestion avec Lys-C et de la trypsine avec 0,2 ml de brub pH 11 et pH 5, respectivement. </li><li> Monter la pointe SAX-colonne dans la centrifuge couvercle de l&#39;adaptateur de tube. </li><li> Laver et équilibrer la colonne de bout-SAX successivement avec 0,1 ml de methanol, 0,1 ml de NaOH 1 M, et trois fois avec 0,1 ml de brub, pH 11 pour la séparation de Lys-C Peptides et brub, pH 5 pour les peptides tryptiques. L&#39;écoulement des solutions à travers la matière de la colonne est facilitée par centrifugation à 4000 x g. </li><li> Laver et équilibrer les C 18 - &#39;StageTips&#39; ensuite, avec 0,05 ml de methanol, puis avec 0,05 ml de tampon B et avec 0,05 ml de tampon A. Préparer six C 18 - &#39;StageTips&#39;, 4 pour la séparation de la Lys- C peptides et deux pour la séparation des peptides trypsiques. </li><li> Assemblez le Tip-colonne SAX dans le C 18 - &#39;StageTip. Chargez les solutions d&#39;échantillon dans les SAX Tip-colonnes équilibrées et centrifuger les colonnes à 5000 g pendant 3 min. </li><li> Equilibrer les colonnes «pipette à pointe» avec 0,1 ml de la brub, pH 11 ou pH 5, respectivement à la Lyc-C et des échantillons tryptiques. Faciliter la circulation par centrifugation à 5000 x g. </li><li> Transférer le Tip-colonne SAX pour le prochain C 18 - &#39;StageTip. </li><li> Continuer l&#39;élution des peptides avec brub pH 6, 4 et 2 pour l&#39;échantillon C et avec Lys BRUB pH 2 pour l&#39;échantillon avec des peptides tryptiques. Pour chaque étape d&#39;élution utiliser un C séparé 18 - &#39;StageTip. </li><li> Laver les C 18 - «StageTips» avec 0,05 ml de tampon A. </li><li> Éluer des fractions de 0,05 ml de tampon B dans des flacons utilisés directement pour l&#39;injection des échantillons dans le système de LC assemblés avec un spectromètre de masse. </li></ol>

<ol>
	<li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line.">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548 (2011).</li><li>Beck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+proteome+of+a+human+cell+line.">The quantitative proteome of a human cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 549 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+workflow+for+analysis+of+archival+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+clinical+samples+to+a+depth+of+10+000+proteins.+Proteomics.">Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics.</a> Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).</li><li>Magdeldin, S., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+deciphering+proteomes+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissues.">Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues.</a> Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).</li><li>Ostasiewicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome,+phosphoproteome,+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+recovery+FASP+applied+to+the+proteomic+analysis+of+microdissected+formalin+fixed+paraffin+embedded+cancer+tissues+retrieves+known+colon+cancer+markers.">High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers.</a> Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+quantitative+remodeling+of+the+proteome+between+normal+colon+tissue+and+adenocarcinoma.">Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.</a> Mol. Syst. Biol. 8, 611 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+proteolytic+digestion+in+an+enzyme+reactor+increases+depth+of+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis.">Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome.">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li><li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue.">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li></ol>

L&#39;auteur n&#39;a rien à révéler.

La possibilité d&#39;étudier la matière FFPE par la technologie protéomique à une profondeur comparable à séquençage des acides nucléiques et des techniques de puces à ADN ouvre de nouvelles perspectives dans les biomarqueurs et la découverte de cibles de médicament. Le protocole décrit permet la caractérisation et la quantification des protéomes des populations de cellules par microdissection sur une échelle de 10 000 protéines. Lorsque vous utilisez moins de la matière microdisséqués un petits ensembles de données peuvent être générés, mais peut-être dans de nombreux cas, les personnes peuvent aussi fournir de précieuses données cliniques. Ainsi, soit les échantillons peuvent être analysés directement après la procédure MED-FASP ou peuvent être séparés en fractions moins. Depuis procédure de FASP est compatible avec tout type de protéase, d&#39;autres enzymes ou leur combinaison peuvent être utilisés à partir de digestions protéiques 6. La qualité de la matière FFPE semble être le problème le plus critique de l&#39;analyse. Nous avons fait l&#39;expérience que le tissu fixé de la même origine, mais provenant de différentscliniques de rentes ont des propriétés distinctes. En utilisant des tissus provenant d&#39;une source, nous avons pu générer des peptides à des rendements élevés, tandis que d&#39;un autre matériau similaire clinique était presque inutile. Il est probable que la fixation et appliqué les procédures d&#39;enrobage ainsi que les conditions de stockage sont les principaux facteurs qui influent sur ​​les propriétés du matériau clinique 12. Par conséquent, il est conseillé de tester les propriétés de quelques échantillons avant de commencer un projet plus vaste. De nombreuses publications ont signalé l&#39;utilisation de la matière de FFPE dans le passé. Cependant, le nombre de protéines identifiées dans ces études n&#39;a jamais dépassé plus de protéines 1000-2000 4. Compte tenu de la taille des protéomes spécifiques de cellules humaines comprenant plus de 10 000 protéines, ces études ont pu seulement de fournir une image très superficielle, presque limité à des protéines hautement abondantes impliquées dans les fonctions d&#39;entretien ménager. Notre protocole permet l&#39;isolement efficace du matériel clinique ou biologique from conservé tissu et est optimisé pour la lyse, la transformation des protéines et des peptides préfractionnement. En conséquence notre échantillon préparation flux de travail, lorsqu&#39;il est couplé à la spectrométrie de masse haut de gamme, permet un aperçu des protéomes presque complets. Notable, cela est possible à des exigences minute montant de l&#39;échantillon. L&#39;avantage majeur de l&#39;utilisation des tissus conservés est leur large disponibilité relative. Échantillons FFPE archivés pendant de nombreuses années et des décennies, et parfois considérés comme inutiles, maintenant, grâce à la technologie protéomique, apparaissent comme matériau de grande valeur pour la recherche clinique. Alors que de nombreuses maladies peuvent être étudiés en utilisant l&#39;enquête de matière fraîche ou congelée de matériel FFPE semble être particulièrement important pour l&#39;étude des maladies rares 12, étaient collecte d&#39;un ensemble représentatif de l&#39;échantillon prend généralement beaucoup de temps.

Fixation au paraformaldéhyde et l&#39;intégration dans la paraffine (FFPE) est la méthode standard pour la conservation et l&#39;enquête pathomorphologiques de matériel tissulaire clinique. Microscopie du tissu conservé permet l&#39;identification des maladies liées à des changements morphologiques, et la détection et la notation de l&#39;apparition de maladies liées à des antigènes. Etant donné que généralement seule une petite partie de l&#39;échantillon FFPE est utilisé dans ces analyses, de grandes quantités de matériel clinique restent archivés et peuvent être exploitées dans d&#39;autres types d&#39;études. Au cours de la dernière décennie de la recherche en sciences de la vie a été renforcé par la technologie protéomique puissant. Cette technologie permet l&#39;identification et la quantification de milliers de protéines dans des mélanges complexes de protéines. Une caractéristique importante de cette technologie est que seulement des quantités infimes de matière sont nécessaires pour des analyses à grande échelle. Études protéomiques récentes ont démontré que les protéines peuvent être étudiés sur une échelle de un échantillon de près deLete Protéomes 1, 2. Ce type de système permet d&#39;investigations larges perspectives dans la composition des cellules et l&#39;identification des groupes de protéines qui se produisent à des niveaux anormaux de maladies. Considérant que ces études doivent grandes capacités de spectrométrie de masse, le travail récent a montré que dans la même mesure de l&#39;identification peut être réalisée en une seule journée de mesure 3. L&#39;exigence de la quantité d&#39;échantillon relativement faible et la grande disponibilité des échantillons cliniques et d&#39;autres conservés nous tentés de développer des méthodes permettant l&#39;exploration protéomique de la matière de la FFPE (pour une revue voir 4). Profitant de la réversibilité de la fixation au formol sous un traitement thermique, nous avons mis au point un protocole permettant l&#39;extraction quantitative des protéines à partir du tissu fixe 5. Nous avons montré que la procédure de fixation conserve pas seulement des protéines, mais aussi au moins certaines modifications post-traductionnelles. Phosphorylation et de N-glycosylation peuvent être étudiés en utilisant les échantillons FFPE 5, cependant une condition préalable pour cela est une des conditions de collecte de tissus, de stockage et de fixation contrôlés soigneusement. Ensuite, nous avons optimisé la méthode de microdissection par capture laser de tissu fixe et pour le réacteur en fonction protéomique traitement des échantillons 6, 7. Une étude à grande échelle sur le cancer colorectal a permis une analyse quantitative des protéines à partir de 7500 par microdissection de matériel clinique 8. Enfin, nous avons amélioré la façon de l&#39;exploration de la matière microdissection par l&#39;application consécutive de deux protéines de l&#39;étape protocole de digestion 9. En comparaison avec les stratégies de digestion communes utilisant enzyme unique, cette procédure permet la génération de plusieurs peptides de séquence unique et, par conséquent, se traduit par une plus grande profondeur de l&#39;identification des protéines. Analyse de microdissection adénome colique humaine a permis l&#39;analyse protéomique à une profondeur de 9500 protéines par exemple 3. Dans ce goujony nous avons cartographié 55 000 peptides par échantillon permettant l&#39;identification de 88-89% de protéines d&#39;au moins 2 peptides. Ici, nous présentons un protocole optimisé pour la préparation d&#39;échantillons à partir du matériau pour l&#39;analyse LC-MS/MS FFPE. Ce protocole comprend la préparation de coupes de tissu pour microdissection, la lyse des cellules isolées, et le traitement des échantillons dans un format de réacteur (FASP) 6. Ensuite, nous décrivons une détermination spectrofluorométrique des rendements peptidiques; une tâche avec une grande importance pour l&#39;identification de peptides optimale par la spectrométrie de masse. Enfin, nous démontrons un échangeur fort d&#39;anions (SAX) à base de technique de séparation pour le peptide fractionnement. Dans ce procédé, à la fois la séparation du peptide et le nettoyage final sont effectués en utilisant une pipette à pointe micro-colonnes 10, 11. Cette étape est facultative mais recommandée dans les études où plus de quelques microgrammes peptides peuvent être obtenus à partir d&#39;un seul échantillon. Le SAX-fractionnement peut augmenter considérablement le nombre et la gamme dynamique de identfications et étendre la couverture de la séquence de protéine 3, 10.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adhesive Cap 200 opaque</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mayer's hematoxylin solution </td>
			<td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td>
			<td>MHS32</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forensic 30k </td>
			<td>Merck Millipore Darmstadt, Germany</td>
			<td>MRCF0R030 </td>
			<td>(Previously sold as Microcon YM-30) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore Anion</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN </td>
			<td>2252</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore C18</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td>
			<td>2215</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin </td>
			<td>Promega </td>
			<td>2014-06-27</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue

Matériel clinique préservé est une source unique pour la recherche protéomique des maladies humaines. Ici, nous décrivons un protocole optimisé permettant l&#39;analyse quantitative à grande échelle de formol et inclus en paraffine fixé (FFPE) tissus. Le procédé comprend quatre étapes distinctes. Le premier est la préparation d&#39;articles à partir du matériau de FFPE et microdissection de cellules d&#39;intérêt. Dans la deuxième étape, les cellules isolées sont lysées et traitées à l&#39;aide &#39;filtre assistée préparation des échantillons&#39; (FASP) technique. Dans cette étape, les protéines sont épuisées à partir de réactifs utilisés pour la lyse de l&#39;échantillon et sont digérés en deux étapes à l&#39;aide de l&#39;endoprotéinase LysC et trypsine. Après chaque digestion, les peptides sont recueillis dans des fractions séparées et leur contenu est déterminée en utilisant une mesure de fluorescence très sensible. Enfin, les peptides sont fractionnés sur microcolonnes «pipette à pointe». Les LysC-peptides sont séparés en 4 fractions alors que la pe tryptiqueptides sont séparés en deux fractions. De cette manière, les échantillons préparés permettent l&#39;analyse des protéomes de quantités infimes de matière à une profondeur de 10 000 protéines. Ainsi, le flux de travail décrit est une technique puissante pour étudier les maladies dans un système à l&#39;échelle de la mode ainsi que pour l&#39;identification de biomarqueurs potentiels et de cibles thérapeutiques.

L&#39;analyse protéomique de matériel FFPE nécessite des méthodes robustes et reproductibles pour la préparation des échantillons. Dans cette publication, nous démontrons un protocole qui permet une isolation efficace des populations de cellules à partir de la matière fixée et de leur traitement chimique résultant en des fractions peptidiques de haute pureté qui peuvent être directement utilisées pour l&#39;analyse LC-MS/MS. La procédure se composent de quatre parties distinctes: (1) préparation de sections des échantillons FFPE et son microdissection, (2) la lyse de l&#39;échantillon et la transformation des protéines en utilisant l&#39;approche MED FASP, et (3) la quantification et (4) de fractionnement les peptides (figure 1). Dans la première étape de la procédure, les échantillons FFPE sont coupés avec un microtome et montées sur des lames de la membrane recouverte. Pour augmenter l&#39;adhérence entre les sections de tissu et la surface de la membrane de coulissement est nécessaire d&#39;irradier la surface de glissement avec une lumière UV. A cet effet, on utilise la lumière d&#39;une lampe UVintégré dans un banc de culture cellulaire. Après cette étape, les lames sont soumises à des lavages permettent l&#39;élimination de la paraffine et de réhydratation des échantillons. Le matériau réhydraté est coloré avec l&#39;hématoxyline pendant une courte période. Il en résulte une faible coloration de l&#39;échantillon, mais est suffisant pour la visualisation des zones de l&#39;échantillon pour microdissection. Le procédé de coloration doit être arrêtée rapidement par rinçage des lames avec un excès d&#39;eau. Une coloration prolongée des résultats de l&#39;échantillon des rendements peptidiques pauvres. Dans l&#39;étape suivante, les sections séchées sont soumises à une microdissection. La sélection des zones de tissu de cellules individuelles dépend du type d&#39;enquête et nécessite toujours une connaissance spécifique en histologie ou pathomorphologie. Le matériau laser-libéré est recueilli sur des surfaces adhésives des tubes de prélèvement d&#39;échantillon. Etant donné que la capacité de liaison de la matière adhésive est limitée, il est nécessaire de transférer la matière à partir de la microdissection couvercle à til tube après dissection de chaque 5.3 mm 2 de l&#39;échantillon. Ceci peut être facilement réalisé par pipetage de quelques microlitres de tampon de lyse tissulaire (LTB) sur le couvercle et une courte rotation du tube dans une centrifugeuse. Après que l&#39;échantillon est recueilli dans le fond du tube, la microdissection et le prélèvement de l&#39;échantillon sur le couvercle peuvent être poursuivies. Une fois que la totalité de l&#39;échantillon est collecté les tubes doivent être en plus bouché avec du Parafilm et on les incube dans un bain d&#39;eau à environ 99 ° C avec une agitation continue pendant 1 h. Etant donné que pendant l&#39;incubation de l&#39;eau se condense sur le couvercle, toutes les 15 min les tubes doivent être centrifugés brièvement pour collecter l&#39;eau de retour dans le cône de tube. Pour obtenir des peptides les lysats de tissus sont traités à l&#39;aide de l&#39;approche MED-FASP. Dans ce procédé, les protéines sont épuisées lysées du détergent et d&#39;autres substances de faible poids moléculaire, à carboamidomethylated résidus cystéinyle, puis consécutivement digérés par deux enzymes difféfrances à leurs spécificités de clivage: endoprotéinase LysC et la trypsine. Après chaque étape de digestion des peptides sont recueillis en fractions séparées. Dans cette partie de la préparation des échantillons, il est important de continuer à chacune des étapes de centrifugation jusqu&#39;à ce que plus de 95% de la solution initialement chargé dans l&#39;unité de filtration passé la membrane. L&#39;analyse de tissu de côlon et le cancer de sa nous avons observé que cette procédure rendements 3-6 pg de peptide pour 100 nl (tissu de 100 ug ou 10 mm 2 d&#39;une section de 10 um) de la matière microdisséquée (tableau 1). Étant donné que la protéine totale extraite de tissus est d&#39;environ 10% du poids du tissu les procédures d&#39;extraction et de digestion résultent ensemble dans un rendement de 30 à 60% dans le rapport à l&#39;origine du tissu frais. Ces valeurs reflètent les pertes de la protéine au cours de la déshydratation et de la coloration, microdissection, et la rétention de la partie de l&#39;échantillon non digéré dans les unités d&#39;ultrafiltration. Parce que l&#39;extraction et le traitement de pastissu FFPE n-microdisséquée résulté en un rendement de 5 75%, il est probable que les pertes d&#39;échantillons critiques se produisent au cours des étapes avant MED-FASP protéine-peptide-à-conversion. Une caractéristique importante des mélanges de peptides obtenus par cette procédure est leur grande pureté qui facilite en outre le processus de fractionnement des peptides de fractionnement et l&#39;identification par spectrométrie de masse. Ceci a été montré récemment, par une analyse des échantillons de l&#39;adénome colorectal 3. Dans cette étude, 40% des événements de MS / MS a conduit à l&#39;identification de peptides de tissu FFPE et a abouti à la cartographie d&#39;un maximum de 17 000 peptides seul passage par LC-MS/MS. Taux d&#39;identification plus élevés ont été atteints que dans l&#39;analyse de cellules congelées in vitro en culture 3. Dans les deux dernières parties de l&#39;ensemble de la procédure les peptides isolés sont quantifiés et fractionné sur microcolonnes pipette à pointe. Depuis les quantités de peptide isolé du tissu microdisséqués sont êtrebas 10 ug ils ne peuvent être quantifiés en utilisant des analyses de protéines couramment utilisées à base de colorants. De plus, les A 280 mesures spectrale UV à ces concentrations ne sont pas utiles en raison de l&#39;effet de diffusion de la lumière. En revanche, les mesures de fluorescence des résidus tryptophane offrent un moyen fiable pour la détermination de la teneur en peptide. Récemment, nous avons montré que jusqu&#39;à 5000 protéines à partir de cellules cultivées peuvent être identifiés dans un &quot;seul coup&quot; 4 d&#39;analyse h LC-MS/MS 7. Toutefois, ce type d&#39;analyse appliquée aux tissus natifs permet rarement l&#39;identification de plus de 3.000 milliers de protéines. Pour augmenter la profondeur de l&#39;analyse des peptides générés dans MED FASP doivent être pré-fractionné avant LC-MS/MS. Le micro-colonne de séparation SAX base est une méthode simple et efficace de fractionnement 10. Il a déjà été utilisée dans plusieurs études protéomiques y compris ceux analyser tissu fixe 5, 8, 9. Le SAX-microcolu «pipette à pointe &#39;mns, et le C 18 - dessalage colonnes &#39;StageTip&#39; 9 sont faciles à préparer. Les colonnes sont assemblées par empilement de bouchons, coupés de la SAX ou C 18 membranes, dans une pointe de pipette 200 pl 11. Des exemples de l&#39;analyse des échantillons FFPE SAX fractionnée sont présentés dans le tableau 1. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de la procédure. La procédure se composent de quatre parties distinctes: (1) préparation de sections des échantillons FFPE et son microdissection, (2) la lyse de l&#39;échantillon et la transformation des protéines en utilisant l&#39;approche MED FASP, et (3) la quantification et (4) le fractionnement de les peptides. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Échantillon </td><td fo:width="1in"> Échantillon de pré-fractionnement / digestion </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> Spectromètre de masse utilisé </td><td fo:width="1.25in"> rendement de peptides ng / échantillon nL (± écart-type) </td><td fo:width="1.25in"> Identifications de protéines uniques par échantillon unique </td><td fo:width=".75in"> Référence </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • muqueuse colique normale </td><td> SAX / une enzyme </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (n = 8) </td><td> 5985 ± 54 5868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • colique adénome </td><td> SAX / deux enzymes </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6,1 (n = 3) </td><td> 9501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Des résultats représentatifs des analyses protéomiques du tissu microdisséqués FFPE.

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Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Formol archives fixé et inclus en paraffine (FFPE) échantillons cliniques sont un matériel précieux pour l&#39;étude des maladies. Ici, nous démontrons une préparation flux d&#39;échantillons permettant une analyse en profondeur protéomique des tissus FFPE microdissection.

Protéomique Préparation de l&#39;échantillon de formol et inclus en paraffine fixe tissus

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

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Research

JoVE Journal

Biology

27.4K vues.  Max Planck Institute of Biochemistry.  Formol archives fixé et inclus en paraffine (FFPE) échantillons cliniques sont un matériel précieux pour l'étude des maladies. Ici, nous démontrons une préparation flux d'échantillons permettant une analyse en profondeur protéomique des tissus FFPE microdissection. 

Vidéo: Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

Immunohistochimie: coupes en paraffine utilisant le kit de Vectastain ABC Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Recherche

Biologie

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Séparation électrophorétique de protéines

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

L&#39;induction ou à toxines et d&#39;extraction de protéines à partir Fusarium Spp. Cultures pour les études protéomiques

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: préparation d&#39;échantillons à la détection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extraction d&#39;ADN de matériel inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation pour les tissus rénaux fixés au formol

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR est une méthode sensible et rapide pour la détection de l&#39;ADN cytomégalovirus dans la formaline fixe, inclus dans la paraffine des tissus de biopsie

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

Employant numérique Droplet PCR pour détecter des mutations BRAF V600E dans de paraffine standard de référence lignées cellulaires fixés au formol

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Préparation de Cores de tissus enrobés de paraffine fixés au formol pour les ARN et d&#39;extraction d&#39;ADN

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...