Pour commencer, ensemencez les cellules d’ostéosarcome humain 143B dans une plaque à six puits. Une fois que les cellules deviennent confluentes à 75%, remplacez le milieu dans chaque puits par le milieu contenant 10 millimolaires d’aspartate 13C4 et incuber pendant huit heures pour obtenir un état stable pour marquer les cellules. Pour isoler les métabolites, refroidissez le tampon préparé pendant la nuit à moins 80 degrés Celsius ou placez-le sur de la glace sèche.
Pendant ce temps, prenez une assiette de l’incubateur et aspirez le milieu de chaque puits à l’aide d’une pipette. Lavez-le deux fois avec du PBS, puis retirez le PBS résiduel avant de continuer. Maintenant, placez la plaque sur de la glace sèche et ajoutez 800 microlitres de tampon préparé à chaque puits.
Pour faciliter la lyse cellulaire, incuber la plaque pendant 15 minutes à moins 80 degrés Celsius. Après l’incubation, grattez chaque puits sur de la glace sèche à l’aide d’un élévateur de cellule et transférez le lysat dans un tube microcentrifuge de 15 millilitres placé sur de la glace sèche. Tourbillonner le lysat pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, et centrifuger à quatre degrés Celsius et 17 000 g pendant 10 minutes.
Ensuite, transférez le surnageant dans un tube à microcentrifugation de 1,5 millilitre et séchez-le dans un concentrateur sous vide à quatre degrés Celsius avec un piège froid sous vide poussé pendant environ six heures. Conservez la pastille de métabolite séché à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit utilisée ultérieurement. Pour analyser l’échantillon par spectrométrie de masse par chromatographie liquide ou LCMS, ajouter 100 microlitres d’eau de qualité CLHP à la pastille séchée et au vortex comme démontré.
Centrifuger les échantillons à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à la vitesse maximale. Transférez ensuite 25 microlitres de surnageant dans le flacon LCMS et injectez deux microlitres dans le système LCMS. Pour effectuer la chromatographie liquide, utiliser un débit constant de 0,15 millilitre par minute, sous le mode gradient d’une phase B mobile de 80 à 20% pendant 20 minutes, 20 à 80% pendant 0,5 minute, et maintenir à 80% pendant 7,5 minutes contre la phase mobile A.Ensuite, effectuer une spectroscopie de masse en choisissant un balayage complet entre mz 70 à 1, 000 dalton.
Et résolution à 70 000. Fixez la cible AGC d’une fois 10 à la sixième, et un temps d’injection maximum de 20 millisecondes. Ensuite, définissez le temps d’exécution sur 16,5 minutes.
Polarité définie sur positive. L’objectif de l’AGC est fixé à un à la puissance de cinq. Réglage informatique maximal sur 20 millisecondes.
Et la plage de balayage définie sur un rapport masse/charge de 70 à 1 000. Réglez ensuite la tension de pulvérisation à 3,0 kilovolts. Et le capillaire chauffé à 275 degrés Celsius.
Sélectionnez le débit de gaz de gaine à 40 unités, le débit de gaz auxiliaire à 15 unités et le débit de gaz de balayage à une unité. Pour le traçage isotopique de la glutamine 13C5, une fois que les cellules atteignent 75% de confluence, changer le milieu en deux milieux millimolaires contenant de la glutamine 13C5 et incuber pour obtenir un état stable de marquage des cellules d’intérêt. Isoler et analyser les métabolites comme démontré précédemment.
Après avoir isolé et analysé les métabolites, analyser l’activité de la succinate déshydrogénase ou SDH en calculant le pourcentage de marquage du fumarate 13C3, du fumarate 13C4, du succinate 13C3 et du succinate 13C4. Ensuite, évaluez l’oxydation du succinate et la réduction du fumarate à l’aide de la formule. Dans les conditions traitées par véhicule, le complexe SDH a favorisé l’activité en avant, et l’incorporation du succinate de 13C4 dans le fumarate de 13C4 était supérieure au fumarate de 13C3 dans le succinate de 13C3.
Dans les cellules ostéosarcome traitées à l’antimycine, le complexe SDH favorisait l’activité inverse, et l’incorporation du fumarate 13C3 dans le succinate 13C3 était plus significative que le succinate 13C4 dans le fumarate 13C4.
