Pour commencer, prenez les fragments d’ADN de la cellule rare tirés avec de la biotine. Préparer un mélange maître en ajoutant les réactifs pour la cuisson du dATP et incuber l’échantillon pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, inactivez Klenow exo-minus en incubant l’échantillon pendant 10 minutes à 65 degrés Celsius et en le refroidissant sur de la glace.
Après avoir lavé les billes avec 300 microlitres chacune de TB, NTB et 100 microlitres de tampon de ligature, remettez-les en suspension dans 50 microlitres de tampon de ligature. Ajouter quatre microlitres de mélange d’adaptateurs pré-recuits de 15 micromolaires et un microlitre de 2000 unités par microlitre d’ADN T4 ligase à l’échantillon. Lavez les billes avec 400 microlitres de TB, 200 microlitres de NTB et 100 microlitres de tampon de restriction deux.
Après avoir amplifié la bibliothèque par PCR, regroupez les réactions de 50 microlitres du même échantillon dans un tube à faible liaison d’ADN de 1,5 millilitre. Placez-le sur un tube magnétique et attendez que toutes les perles soient collées au mur. Transférer le surnageant contenant la bibliothèque dans un nouveau tube à faible liaison d’ADN de 1,5 millilitre et compléter avec un tampon TLE à 500 microlitres.
Pour effectuer une sélection recto-verso à l’aide de la purification paramagnétique des billes, ajoutez 200 microlitres de billes de stock à la bibliothèque, mélangez par vortex et incuber pendant 10 minutes, en tournant à température ambiante. Ensuite, placez la bibliothèque sur un aimant et attendez que toutes les perles soient collées au mur. Transférez le surnageant contenant la bibliothèque dans un nouveau tube à faible liaison d’ADN de 1,5 millilitre.
Concentrez les billes en prenant 750 microlitres de billes de stock et en les plaçant dans un tube de 1,5 millilitre sur un aimant. Une fois que toutes les perles sont collées au mur, retirez le surnageant et remettez en suspension les perles en vortex dans 300 microlitres de nouvelles perles de stock. Ajouter 300 microlitres de billes concentrées à l’échantillon.
Mélanger par vortex et incuber pendant 10 minutes, en tournant à température ambiante. Placer sur un aimant. Attendez que toutes les perles soient collées au mur et retirez le surnageant.
Lavez les perles en ajoutant un millilitre d’éthanol à 70% dans le tube avec les perles encore sur l’aimant. Laisser sécher les billes à l’air libre et les remettre en suspension dans 21 microlitres de tampon TLE par vortex. Pour éluer la bibliothèque des billes, incuber l’échantillon pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius dans un thermobloc.
Placez le tube dans un aimant et transférez le surnageant contenant la bibliothèque dans un nouveau tube à faible liaison d’ADN de 1,5 millilitre.
