Ringraziamo il resto dei membri del laboratorio Javierre per il loro feedback sul manoscritto. Ringraziamo il Programma CERCA, la Generalitat de Catalunya e la Fondazione Josep Carreras per il sostegno istituzionale. Questo lavoro è stato finanziato dal FEDER/Ministero spagnolo della Scienza e dell'Innovazione (RTI2018-094788-A-I00), dall'Associazione europea di ematologia (4823998) e dall'Associazione spagnola contro il cancro (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ è finanziato dal progetto Junior Leader della La Caixa Banking Foundation (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR è finanziato da una borsa di studio AGAUR FI (2019FI-B00017) e LT-D è finanziato da una borsa di studio FPI (PRE2019-088005). Ringraziamo il programma di dottorato in biochimica e biologia molecolare dell'Universitat Autònoma de Barcelona per il suo supporto. Nessuno dei finanziatori è stato coinvolto in nessun momento nella progettazione sperimentale o nella scrittura del manoscritto.

Un approccio completo allo studio dell'interattoma del promotore in cellule scarse

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

liCHi-C offre la capacità di generare librerie di interattomi promotori ad alta risoluzione utilizzando un framework sperimentale simile a PCHi-C ma con un numero di celle notevolmente ridotto. Ciò si ottiene notevolmente eliminando i passaggi non necessari, come la purificazione del fenolo e la rimozione della biotina. Nel classico protocollo Hi-C57 della legatura in-nucleo e nella sua successiva tecnica derivata PCHi-C, la biotina viene rimossa dai frammenti di restrizione non legati per evita...

L'espressione genica temporale guida la differenziazione cellulare e, in definitiva, lo sviluppo dell'organismo, e la sua alterazione è strettamente correlata a un'ampia pletora di malattie 1,2,3,4,5. La trascrizione genica è finemente regolata dall'azione di elementi regolatori, che possono essere classificati come prossimali (cioè promotori genici) e distali (ad esempio, potenziatori o silenziatori), questi ultimi sono frequentemente situati lontano dai loro geni bersaglio e interagiscono fisicamente con loro attraverso il looping della cromatina per modulare l'espressione genica 6,7,8.
L'identificazione delle regioni regolatorie distali nel genoma è una questione ampiamente condivisa, poiché queste regioni ospitano specifiche modificazioni degli istoni 9,10,11 e contengono specifici motivi di riconoscimento dei fattori di trascrizione, fungendo da piattaforme di reclutamento per loro12,13,14. Inoltre, nel caso di enhancer e super-enhancers 15,16, hanno anche una bassa occupazione nucleosomica 17,18 e sono trascritti in eRNA non codificanti 19,20.
Tuttavia, i geni bersaglio di ciascun elemento regolatore distale sono più difficili da prevedere. Il più delle volte, le interazioni tra gli elementi regolatori distali e i loro bersagli sono specifiche del tipo cellulare e dello stimolo 21,22, si estendono su centinaia di kilobasi, collegando altri geni in qualsiasi direzione 23,24,25 e possono anche essere localizzate all'interno di regioni introniche del loro gene bersaglio o di altri geni non intervenienti 26,27. Inoltre, gli elementi regolatori distali possono anche controllare più di un gene allo stesso tempo, e viceversa28,29. Questa complessità posizionale ostacola l'individuazione delle associazioni regolatorie tra loro e, pertanto, la maggior parte degli obiettivi di ciascun elemento regolatore in ogni tipo di cellula rimane sconosciuta.
Negli ultimi anni, c'è stato un boom significativo nello sviluppo di tecniche di cattura della conformazione cromosomica (3C) per lo studio delle interazioni della cromatina. Il più utilizzato di essi, Hi-C, permette di generare una mappa di tutte le interazioni tra ogni frammento del genoma di una cellula30. Tuttavia, per rilevare interazioni significative a livello di frammento di restrizione, Hi-C si basa sul sequenziamento ultra-profondo, vietandone l'uso per studiare regolarmente il panorama regolatorio dei singoli geni. Per superare questa limitazione economica, sono emerse diverse tecniche 3C basate sull'arricchimento, come ChIA-PET31, HiChIP 32 e la sua controparte a basso input HiCuT33. Queste tecniche dipendono dall'uso di anticorpi per arricchire le interazioni genome-wide mediate da una proteina specifica. Tuttavia, la caratteristica unica di queste tecniche 3C è anche la rovina della loro applicazione; Gli utenti contano sulla disponibilità di anticorpi di alta qualità per la proteina di interesse e non possono confrontare le condizioni in cui il legame della proteina è dinamico.
Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) è un'altra tecnica 3C basata sull'arricchimento che aggira queste limitazioni34,35. Utilizzando un sistema di arricchimento della sonda di RNA biotinilato, PCHi-C è in grado di generare librerie ad alta risoluzione a livello di genoma di regioni genomiche che interagiscono con 28.650 promotori genici umani o 27.595 annotati nel topo, noti anche come interattoma del promotore. Questo approccio consente di rilevare interazioni significative a lungo raggio alla risoluzione a livello di frammento di restrizione di entrambi i promotori attivi e inattivi e di confrontare in modo robusto gli interattomi del promotore tra qualsiasi condizione indipendentemente dalla dinamica delle modificazioni istoniche o del legame proteico. PCHi-C è stato ampiamente utilizzato negli ultimi anni per identificare le riorganizzazioni dell'interattoma del promotore durante il differenziamento cellulare 36,37, identificare il meccanismo d'azione dei fattori di trascrizione38,39 e scoprire nuovi potenziali geni e vie deregolate nella malattia da varianti non codificanti 40,41,42,43,44,45,46,47,48, accanto alle mutazioni non codificanti del nuovo driver49,50. Inoltre, semplicemente modificando il sistema di cattura, questa tecnica può essere personalizzata in base alla domanda biologica per interrogare qualsiasi interattoma (ad esempio, l'interattoma enhancer 51 o l'interattoma di una raccolta di alterazioni non codificanti41,52).
Tuttavia, PCHi-C si basa su un minimo di 20 milioni di cellule per eseguire la tecnica, che impedisce lo studio di popolazioni cellulari scarse come quelle spesso utilizzate nella biologia dello sviluppo e nelle applicazioni cliniche. Per questo motivo, abbiamo sviluppato Capture Hi-C (liCHi-C) a basso input, un nuovo metodo economico e personalizzabile basato sul framework sperimentale di PCHi-C per generare interattomi promotori ad alta risoluzione con input a bassa cella. Eseguendo l'esperimento con minime modifiche del tubo, scambiando o eliminando passaggi dal protocollo PCHi-C originale, riducendo drasticamente i volumi di reazione e modificando le concentrazioni di reagenti, la complessità della libreria è massimizzata ed è possibile generare librerie di alta qualità con un minimo di 50.000 celle53.
Low input Capture Hi-C (liCHi-C) è stato confrontato con PCHi-C e utilizzato per chiarire il ricablaggio dell'interattoma del promotore durante la differenziazione delle cellule ematopoietiche umane, scoprire potenziali nuovi geni e percorsi associati alla malattia deregolati da alterazioni non codificanti e rilevare anomalie cromosomiche53. Il protocollo passo-passo e i diversi controlli di qualità attraverso la tecnica sono dettagliati qui fino alla generazione finale delle librerie e alla loro analisi computazionale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 mM Biotin-14-dATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x NEBuffer 2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td>Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x T4 DNA ligase reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mg/mL Bovine Serum Albumin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock Gel Light tubes</td>
			<td>Qiuantabio</td>
			<td>2302820</td>
			<td>For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters and PCR primers for library amplification</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>Bought as individual primers with PAGE purification for NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrappers</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>179693</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHiCAGO R package</td>
			<td>1.14.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanNGS beads</td>
			<td>CleanNA</td>
			<td>CNGS-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U120A, U121A, U122A, U123A</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind tube, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td>For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65602</td>
			<td>For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, qualified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiCUP</td>
			<td>0.8.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII, 100 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0104T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow EXO- 5000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-retention filter tips&#160;(10 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L and 1000 &#181;L)</td>
			<td>ZeroTip</td>
			<td>PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>For sonication in section 6 (sonication)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF, 100 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3131M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers for quality controls</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips&#160;and caps</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>410022, 401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531L</td>
			<td>For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) 
			and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33230</td>
			<td>For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutsmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>Or any other brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS - Solution 10% for molecular biology</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect custom 3-5.9 Mb library</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-4831</td>
			<td>Custom designed mouse or human capture system, used for the capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Target Enrichment Box 1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-8645</td>
			<td>Used for the capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>931107</td>
			<td>Used for the capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224025</td>
			<td>For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 2000000/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td>For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK 10000 units/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation 4200 instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and 
			section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,</td>
			<td>For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and 
			section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 for molecular biology</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A4975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated workflow to study the promoter-centric spatio-temporal genome architecture in scarce cell populations

La trascrizione genica spaziotemporale è strettamente regolata da elementi regolatori distali, come potenziatori e silenziatori, che si basano sulla vicinanza fisica con i loro promotori genici bersaglio per controllare la trascrizione. Sebbene questi elementi regolatori siano facili da identificare, i loro geni bersaglio sono difficili da prevedere, poiché la maggior parte di essi sono specifici del tipo di cellula e possono essere separati da centinaia di kilobasi nella sequenza lineare del genoma, saltando altri geni non bersaglio. Per diversi anni, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) è stato il gold standard per l'associazione di elementi regolatori distali ai loro geni bersaglio. Tuttavia, PCHi-C si basa sulla disponibilità di milioni di cellule, vietando lo studio di popolazioni cellulari rare come quelle comunemente ottenute da tessuti primari. Per superare questa limitazione, è stato sviluppato Capture Hi-C (liCHi-C) a basso input, un metodo economico e personalizzabile per identificare il repertorio di elementi regolatori distali che controllano ciascun gene del genoma. liCHi-C si basa su un framework sperimentale e computazionale simile a PCHi-C, ma impiegando cambiamenti minimi del tubo, modificando la concentrazione e i volumi del reagente e scambiando o eliminando passaggi, rappresenta una perdita minima di materiale durante la costruzione della libreria. Collettivamente, liCHi-C consente lo studio della regolazione genica e dell'organizzazione spaziotemporale del genoma nel contesto della biologia dello sviluppo e della funzione cellulare.

Temporal gene expression drives cell differentiation and, ultimately, organism development, and its alteration is closely related to a wide plethora of diseases1,2,3,4,5. Gene transcription is finely regulated by the action of regulatory elements, which can be classified as proximal (i.e., gene promoters) and distal (e.g., enhancers or silencers), the latter of which are frequently located afar from their target genes and physically interact with them through chromatin looping to modulate gene expression6,7,8.
The identification of distal regulatory regions in the genome is a matter which is widely agreed upon, since these regions harbor specific histone modifications9,10,11 and contain specific transcription factor recognition motifs, acting as recruiting platforms for them12,13,14. Besides, in the case of enhancers and super-enhancers15,16, they also have low-nucleosome occupancy17,18 and are transcribed into non-coding eRNAs19,20.
Nonetheless, each distal regulatory element&#39;s target genes are more difficult to predict. More often than not, interactions between distal regulatory elements and their targets are cell-type and stimulus specific21,22, span hundreds of kilobases, bridging over other genes in any direction23,24,25, and can even be located inside intronic regions of their target gene or other non-intervening genes26,27. Furthermore, distal regulatory elements can also control more than one gene at the same time, and vice versa28,29. This positional complexity hinders pinpointing regulatory associations between them, and therefore, most of each regulatory element&#39;s targets in every cell type remain unknown.
During recent years, there has been a significant boom in the development of chromosome conformation capture (3C) techniques for studying chromatin interactions. The most widely used of them, Hi-C, allows to generate a map of all the interactions between every fragment of a cell&#39;s genome30. However, to detect significant interactions at the restriction fragment level, Hi-C relies on ultra-deep sequencing, prohibiting its use to routinely study the regulatory landscape of individual genes. To overcome this economic limitation, several enrichment-based 3C techniques have emerged, such as ChIA-PET31, HiChIP32, and its low-input counterpart HiCuT33. These techniques depend on the use of antibodies to enrich for genome-wide interactions mediated by a specific protein. Nonetheless, the unique feature of these 3C techniques is also the bane of their application; users count on the availability of high-quality antibodies for the protein of interest and cannot compare conditions in which the binding of the protein is dynamic.
Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) is another enrichment-based 3C technique that circumvents these limitations34,35. By employing a biotinylated RNA probe enrichment system, PCHi-C is able to generate genome-wide high-resolution libraries of genomic regions interacting with 28,650 human- or 27,595 mouse-annotated gene promoters, also known as the promoter interactome. This approach allows one to detect significant long-range interactions at the restriction fragment level resolution of both active and inactive promoters, and robustly compare promoter interactomes between any condition independently of the dynamics of histone modifications or protein binding. PCHi-C has been widely used over recent years to identify promoter interactome reorganizations during cell differentiation36,37, identify the mechanism of action of transcription factors38,39, and discover new potential genes and pathways deregulated in disease by non-coding variants40,41,42,43,44,45,46,47,48, alongside new driver non-coding mutations49,50. Besides, by just modifying the capture system, this technique can be customized according to the biological question to interrogate any interactome (e.g., the enhancer interactome51 or the interactome of a collection of non-coding alterations41,52).
However, PCHi-C relies on a minimum of 20 million cells to perform the technique, which prevents the study of scarce cell populations such as the ones often used in developmental biology and clinical applications. For this reason, we have developed low input Capture Hi-C (liCHi-C), a new cost-effective and customizable method based on the experimental framework of PCHi-C to generate high-resolution promoter interactomes with low-cell input. By performing the experiment with minimal tube changes, swapping or eliminating steps from the original PCHi-C protocol, drastically reducing reaction volumes, and modifying reagent concentrations, library complexity is maximized and it is possible to generate high-quality libraries with as little as 50,000 cells53.
Low input Capture Hi-C (liCHi-C) has been benchmarked against PCHi-C and used to elucidate promoter interactome rewiring during human hematopoietic cell differentiation, discover potential new disease-associated genes and pathways deregulated by non-coding alterations, and detect chromosomal abnormalities53. The step-by-step protocol and the different quality controls through the technique are detailed here until the final generation of the libraries and their computational analysis.

Autore in primo piano: un flusso di lavoro integrato per studiare l'architettura del genoma spazio-temporale promotore-centrica in popolazioni cellulari scarse  

Un flusso di lavoro integrato per studiare l'architettura del genoma spazio-temporale centrata sul promotore in popolazioni cellulari scarse

With liCHi-C, the main question that we are trying to answer is how the chromatin interacts in the nucleus, and therefore, to understand a new layer of gene regulation. We have proven with liCHi-C that we can explore the genome organization of a given sample, link the non-coding mutation associated with disease with potential genes affected, and detect chromosomal rearrangements, such as translocation, for example, in tumor samples. Now we can explore the 3D chromatin organization of scar cell types, such as primary stem cells or relevant clinical samples.Our protocol reduces the input materials and the time and cost needed to obtain quality data to explore the genome organization at the restriction fragment resolution. liCHi-C is expanding the reach of the 3D chromatin organization field, allowing us to explore new cell types previously impossible to analyze. Thanks to liCHi-C, the scientific community can explore the special regulation of gene expression.For example, in malignant transformation only in a specific clonal sub-population inside a tumor.

liCHi-C offre la possibilità di generare librerie di interattomi promotori di alta qualità e risoluzione con un minimo di 50.000 cellule53. Ciò si ottiene – oltre alla drastica riduzione dei volumi di reazione e all'uso di oggetti plastici a basso legame del DNA in tutto il protocollo – rimuovendo passaggi non necessari dal protocollo originale, in cui si verificano perdite significative di materiale. Questi includono la purificazione del fenolo dopo la reticolazione, la rimozione della bio...

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations at JoVE.com

L'espressione genica è regolata dalle interazioni dei promotori genici con gli elementi regolatori distali. Qui, descriviamo come basso input Capture Hi-C (liCHi-C) consenta l'identificazione di queste interazioni in tipi di cellule rare, che in precedenza non erano misurabili.

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity ...

Con liCHi-C, la domanda principale a cui stiamo cercando di rispondere è come la cromatina interagisce nel nucleo e, quindi, di comprendere un nuovo livello di regolazione genica. Abbiamo dimostrato con liCHi-C che possiamo esplorare l'organizzazione del genoma di un dato campione, collegare la mutazione non codificante associata alla malattia con potenziali geni interessati e rilevare riarrangiamenti cromosomici, come la traslocazione, ad esempio, nei campioni tumorali. Ora possiamo esplorare l'organizzazione della cromatina 3D dei tipi di cellule cicatriziali, come le cellule staminali primarie o campioni clinici rilevanti.Il nostro protocollo riduce i materiali di input e il tempo e il costo necessari per ottenere dati di qualità per esplorare l'organizzazione del genoma alla risoluzione del frammento di restrizione. liCHi-C sta espandendo la portata del campo dell'organizzazione della cromatina 3D, permettendoci di esplorare nuovi tipi di cellule precedentemente impossibili da analizzare. Grazie a liCHi-C, la comunità scientifica può esplorare la speciale regolazione dell'espressione genica.Ad esempio, nella trasformazione maligna solo in una specifica sottopopolazione clonale all'interno di un tumore.

an-integrated-workflow-to-study-promoter-centric-spatio-temporal

Research

JoVE Journal

Genetics

An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations

951 Views.  Josep Carreras Leukaemia Research Institute. Con liCHi-C, la domanda principale a cui stiamo cercando di rispondere è come la cromatina interagisce nel nucleo e, quindi, di comprendere un nuovo livello di regolazione genica. Abbiamo dimostrato con liCHi-C che possiamo esplorare l'organizzazione del genoma di un dato campione, collegare la mutazione non codificante associata alla malattia con potenziali geni interessati e rilevare riarrangiamenti cromosomici, come la traslocazione, ad esempio, nei campioni tumorali. Ora possiamo esplora...

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