Commencez par exciser au moins 20 testicules des pupes de moustiques anophèles dans du PBS stérile. Transférez les testicules sur une lame de microscope propre contenant une goutte fraîche de PBS. À l’aide d’embouts filtrés P1000 ou de la pointe d’une aiguille de dissection, transférez les testicules dans une boîte embryonnaire contenant 3,7 % de formaldéhyde dans le PBST.
Incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les testicules dans du PBST pendant cinq minutes à température ambiante. Transférez les testicules dans la boîte embryonnaire contenant la RNase A et incubez-les pendant une demi-heure à 37 degrés Celsius.
Retirez la solution d’ARN et ajoutez un millilitre de la solution pénétrante. Incuber les testicules dans la solution pénétrante à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les testicules et le PBST deux fois pendant cinq minutes chacun.
Transférez les testicules dans un tube de 1,5 millilitre contenant 20 à 30 microlitres de solution d’hybridation avec la sonde d’ADN marquée. Incuber le mélange pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans l’obscurité pour permettre l’hybridation. À l’aide de l’embout filtré blanc AP 1000, transférez les testicules dans une boîte à embryons, puis lavez-les dans deux XSSC pendant cinq minutes.
Retirez le SSC puis montez les testicules sur une lame de verre dépoli à l’aide d’un support de montage disponible dans le commerce contenant du DAPI. Scellez la lame avec un scellant de recouvrement et incubez-la à température ambiante dans l’obscurité pendant deux heures. Un bon niveau d’hybridation a permis de visualiser les chromosomes ciblés tout au long de la spermatogenèse.
L’appariement des chromosomes sexuels marqués a pu être observé aux stades prébiotique et myotique. Les spermatides portant X ou Y ont pu être suivies tout au long de la spermiogenèse marquée par différents niveaux de condensation de l’ADN jusqu’à l’étape finale des spermatozoïdes matures en forme de flèche.
