Le protocole démontré dans cette vidéo nous permet de comprendre le rôle des métabolites intestinaux sur la morphogenèse hyphale fongique. Cette technique ex vivo plus ou moins l’approximation la plus proche de l’intestin pour étudier la morphogenèse hyphale fongique d’une manière qu’aucune étude in vitro ne peut reproduire. Cette méthode peut être appliquée pour étudier le rôle des métabolites intestinaux sur d’autres agents pathogènes en entéroïques.
Disséquer les souris à l’aide de ciseaux et de forceps stérilisés autoclavés. Après l’euthanasie, fixez l’animal à une surface de dissection en épinglant tous les membres pour exposer l’abdomen. Vaporiser la région abdominale de 70 % d’éthanol pour empêcher la fourrure de coller aux forceps, aux ciseaux ou aux sections intestinales.
Utilisez des forceps pour pincer et soulever une section de peau à la base de l’abdomen et créer une petite incision à travers la peau et fascia sous-jacente en prenant soin d’éviter de percer le cécu ou la paroi intestinale. Étendre cette coupe à la cage thoracique exposant partiellement la cavité péritonéale, puis faire une coupe à partir du point de l’incision initiale de chaque côté et s’étendant vers le haut et latéralement. Tirez ces volets latéralement et épinglez-les à la surface disséquante pour exposer complètement la cavité péritonéale.
Extraire le tractus gastro-intestinal avec des forceps tout en utilisant des ciseaux pour rendre les coupures supérieures à l’estomac et à la région distale du gros intestin pour assurer la collecte de la plus grande quantité de contenu intestinal. Lors de la suppression du tractus gastro-intestinal, prenez soin d’éviter de rompre les composants individuels. Séparez l’estomac, l’intestin grêle, le cecum et le gros intestin à leurs extrémités proximales et distales.
Pour la collecte du contenu intestinal de chaque section, faire une seule incision à l’extrémité distale, puis expulser manuellement la teneur en intestin dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre avec des forceps. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius pour obtenir des analyses ex vivo. Stries une culture fraîche de C.albicans SC5314 sur une plaque d’agar YPD et l’incuber pendant la nuit à 30 degrés Celsius.
Le lendemain, choisissez deux ou trois colonies individuelles de taille moyenne et dépensez-les en un millilitre de PBS. Récupérez le contenu intestinal congelé du congélateur et décongelez-les à 25 degrés Celsius. Transférez environ 150 milligrammes de contenu intestinal dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et dépensez-les avec 150 microlitres de PBS.
Vortex l’échantillon à grande vitesse pendant 30 secondes pour homogénéiser le contenu de l’intestin et lui permettre de s’asseoir à température ambiante pendant environ une minute. Centrifugeuse l’homogénéise à 1000 fois G pendant trois minutes, puis transférer le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre en prenant soin de ne pas transférer de débris. Après avoir répété la centrifugation, ajouter 10 microlitres de l’inoculum C.albicans au supernatant, bien mélanger et incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant quatre à cinq heures.
Pour tester l’effet des métabolites exogènes sur les C.albicans, ajoutez la concentration désirée de métabolites au contenu intestinal et au mélange PBS, puis vortexez l’échantillon à grande vitesse pendant 30 secondes, laissez-le reposer à température ambiante pendant 10 minutes, et effectuez la centrifugation et l’inoculation comme décrit précédemment. Centrifugeuse la culture cellulaire fongique à 1000 fois G pendant deux minutes et jeter le supernatant. Fixer les échantillons en 100 microlitres de 2%PFA pendant 15 minutes, puis répéter la centrifugation et jeter le supernatant.
Lavez les échantillons deux fois avec un millilitre de PBS selon les instructions manuscrites, puis incubez les échantillons à température ambiante dans 100 microlitres de PBS avec un anticorps polyclonal C.albicans pendant 30 minutes. Après l’incubation, laver l’échantillon trois fois de plus avec PBS, en travaillant en faible lumière pour éviter le photobleaching. Dans une pièce sombre, incuber les échantillons à température ambiante pendant 15 minutes dans 100 microlitres de PBS contenant des anticorps IgG Alexa Fluor 488 anti-lapin à une dilution d’un à 500.
Après avoir lavé l’échantillon trois fois avec un millilitre de PBS, résuspendez-le en 100 microlitres de PBS et transférez-le dans une plaque de 96 puits pour l’imagerie. Imagez les cellules fongiques avec un microscope d’imagerie par fluorescence à l’aide de lentilles objectives 20X et 40X et d’un filtre à protéines fluorescentes vertes. Lorsque C.albicans est cultivé ex vivo dans les extraits d’homogénéisation intestinale prélevés dans l’estomac, les intestins grêles et les gros intestins de souris témoins non traitées et traitées aux antibiotiques, il se développe généralement avec une morphologie de levure.
Cependant, lorsqu’il est cultivé dans l’extrait cécal de souris traitées aux antibiotiques, C.albicans subit facilement la morphogenèse résultant en des formes de levure et d’hyphe. Ceci indique que le traitement antibiotique cause des changements dans l’environnement cecal, qui induisent la morphogenèse hyphale de C.Albicans. L’addition exogène du glucose à l’homogénéate cecal des souris antibiotiques-traitées a montré un développement hyphal massif ex vivo.
Ces résultats suggèrent que l’addition des métabolites d’intestin de nouveau à l’homogénéate cecal des souris antibiotiques-traitées régule différentielle la morphogenèse des C.albicans. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que l’optimisation de la dilution de la teneur en intestin assure une collecte suffisante des métabolites intestinaux sans collecte de débris. Ne dépassez pas une dilution de contenu média-intestin à deux contre un et visez une dilution plus faible si possible.
Cette technique est maintenant utilisée pour explorer comment des métabolites spécifiques dans le développement hyphal d’impact intestinal, permettant aux chercheurs de mieux comprendre le rôle des métabolites intestinaux sur la pathogénie fongique.
